A型通用流感病毒的數(shù)字pcr檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】一種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、數(shù)字PCR緩沖液PCR MasterMix、A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，數(shù)字PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，上游引物A-FP:5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；下游引物A-RP:5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；特異性探針A-P:5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’，其中FAM為熒光報告基團(tuán)，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)；并采用數(shù)字PCR檢測方法，方法簡單，時間快結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說明】A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測試劑盒機(jī)檢測方法，可應(yīng)用于 A型通用流感病毒引起的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，原有的定量PCR對原有的樣本核酸只能進(jìn)行相對定量，需要依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線 或參照基因來測定核酸量，是對起始樣品的絕對定量。依靠 Ct值常不能很好分辨：拷貝數(shù) 變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA 表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。而目前的熒光檢測方法周期長，且對病毒是否為陽性的 檢測存在不確定結(jié)果，導(dǎo)致多次檢測，或檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù) 的方法，大大提高了檢測靈敏度、精確性，適合重大傳染病的早期篩查。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案：這種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測 試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、數(shù)字PCR緩沖液PCRMasterMi X、A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，數(shù)字PCR 檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，上游引物、下游引物和特異性探針序 列如下：
[0005] 上游引物 A-FP: 5，-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3，；
[0006] 下游引物 A-RP: 5，-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3，；
[0007] 特異性探針 A-P: 5 ' -FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3 ' ；
[0008] 其中FAM為熒光報告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)；
[0009] 其中A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：
[0010] GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGC GAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTo
[0011] 其中數(shù)字PCR檢測試劑盒中組分含有：
[0012]

【權(quán)利要求】
1. 一種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、數(shù)字PCR緩沖液 PCRMasterMix、A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，其特征是：所述數(shù)字PCR檢測試劑盒還包括上游 引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針序列如下： 上游引物 A-FP: 5 ' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3 ' ； 下游引物 A-RP: 5 ' -AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3 ' ； 特異性探針 A-P: 5' -FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3'， 其中FAM為熒光報告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)； 所述A型流感病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下： GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAGGGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGG ACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCT。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測試劑盒，其特征是：所述 數(shù)字PCR檢測試劑盒中組分含有：
3. -種A型通用流感病毒的數(shù)字PCR檢測方法，按照以下步驟進(jìn)行： (1) 打開兩份病毒核酸樣品放入試管中，分別放在水浴42°C、金屬浴65°C中，提取病毒 核酸待檢樣本RNA ; (2) 在試管中加入IOul的逆轉(zhuǎn)錄酶，IOul的逆轉(zhuǎn)錄酶由5ul的RNA模版、3ul的dH20、 Iul的Oligo或Random6引物、Iul的dNTP組成，將待檢樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ; (3) 在65°C環(huán)境中放置5min，然后在冰上快速冷卻； (4) 加入 4. 5ul 的 dH20、4ul 的 5*buffer、lul 的 RTase 和 0· 5ul 的 TNase 抑制劑； (5) 輕輕混合均勻，在42°C的環(huán)境中放置30?60min ; (6) 在95°C 5min滅活酶，冰中保存； (7) 體系加入樣本模板cDNA，每個20ul反應(yīng)體系中含IOul數(shù)字PCR緩沖液 PCRMasterMix，250nM探針，900nM 引物，反應(yīng)溫度為：先95°C lOmin，再 94°C30s -58°C60s， 這樣不停地循環(huán)變換溫度40次；然后放在98°C的溫度下10min，4°C保存或分析； (8) 通過儀器讀取20000個微孔中的熒光值。
【文檔編號】C12Q1/70GK104388582SQ201410592623
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】雷永良, 劉敏, 陳秀英, 王曉光, 葉靈, 葉碧峰, 梅建華 申請人:雷永良