A型流感病毒h5和h9亞型檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種A型流感病毒H5和/或H9亞型檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端與所述第二包被膜的一端相連，所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域包被有帶熒光標(biāo)記的第一抗體和帶熒光標(biāo)記的第二抗體，所述第二包被膜包含分離的第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域比所述第三區(qū)域靠近所述第一包被膜，所述第一區(qū)域包被有第三抗體，所述第三抗體和所述第一抗體能夠特異性結(jié)合同一種抗原，所述第二區(qū)域包被有第四抗體，所述第四抗體與所述第二抗體能夠特異性結(jié)合同一種抗原，所述第三區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體能夠特異性結(jié)合所述第一抗體和所述第二抗體。利用本發(fā)明的試劑盒和/或方法檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定等優(yōu)點。
【專利說明】A型流感病毒H5和H9亞型檢測方法及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及A型流感病毒H5和/或H9亞型的 檢測方法及其試劑盒，特別地，本發(fā)明涉及一種試劑盒、試劑盒在檢測A型流感病毒H5和/ 或H9亞型中的用途以及一種檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] A型流感病毒即甲型流感病毒為常見流感病毒，甲型流感病毒容易發(fā)生變異，其亞 型常被人們稱為"禽流感"。禽流感是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的毀滅性疫病，其病原容易突變， 具有多個血清型，給該病的防控帶來困難，病毒基因變異后能夠感染人類，感染后的癥狀主 要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo) 致死亡，據(jù)WHO統(tǒng)計，人感染H5亞型的死亡率高達(dá)60 %。甲型流感對人類致病性高，曾多 次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今發(fā)現(xiàn)能直接感染人的禽流感病毒亞型有：甲型 H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2 和 H10N8,其中 H1、H5、H7、H9 亞型為高致病 性。
[0003] 目前常見的A型流感病毒H5和H9亞型的檢測方法主要有：核酸檢測和病毒分離 鑒定。核酸檢測有RT-PCR檢測和real-time RT-PCR檢測方法，核酸檢測依賴于樣本模板 RNA的質(zhì)與量，操作要求嚴(yán)格，需要大量儀器與設(shè)備及專業(yè)人員操作，檢測時間較長，檢測靈 敏度高。病毒分離鑒定常用于對陽性樣品病毒的亞型鑒定，需要專門實驗室才能進(jìn)行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商 業(yè)選擇。
[0005] 為此，依據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種試劑盒，其包括第一包被膜和第二包被膜， 所述第一包被膜的一端與所述第二包被膜的一端相連，所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域 包被有帶熒光標(biāo)記的第一抗體和帶熒光標(biāo)記的第二抗體，所述第二包被膜包含分離的第一 區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域比所述第三區(qū)域靠近所述第一 包被膜，所述第一區(qū)域包被有第三抗體，所述第三抗體和所述第一抗體能夠特異性結(jié)合同 一種抗原，所述第二區(qū)域包被有第四抗體，所述第四抗體與所述第二抗體能夠特異性結(jié)合 同一種抗原，所述第三區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體能夠特異性結(jié)合所述第一抗體和所 述第二抗體。對第一包被膜中的包被有熒光標(biāo)記第一抗體和有熒光標(biāo)記第二抗體的區(qū)域的 大小不作限制，可以是整個第一包被膜，也可以是第一包被膜的一部分，在本發(fā)明的一個實 施例中第一包被膜被稱為樣品墊。同樣的，對第二包被膜中的分離的第一區(qū)域、第二區(qū)域和 第三區(qū)域各自的大小也不作特別限制，只要這三個區(qū)域任兩個或任三個之間沒有連接或重 疊的區(qū)域，另外，第一區(qū)域和第二區(qū)域中的哪個更靠近第一包被膜也不作限制。在本發(fā)明的 一個實施例中，如圖1所示，試劑盒的第一包被膜和第二包被膜都是長方形的，第一包被膜 的一條寬邊和第二包被膜的一條寬邊相粘，第一包被膜中的包被有熒光標(biāo)記第一抗體的區(qū) 域為長約2cm、寬約3mm的長方形，第二包被膜中的第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域都為線 狀，第一區(qū)域被稱為檢測線1或Tl線，第二區(qū)域被稱為檢測線2或T2線，第三區(qū)域被稱為 質(zhì)控線或C線，三個區(qū)域所在的線狀平面都平行于兩包被膜的粘結(jié)邊，所說的線狀第一、第 二或第三區(qū)域的寬度大約為0. 5-lmm、長為所在膜的寬。
[0006] 本發(fā)明的這一試劑盒利用第一膜和第二膜分別包被有能特異性結(jié)合同一種抗原 的熒光標(biāo)記的第一抗體和第二抗體，加入待測樣品后利用膜層析，在第二膜上形成雙抗體 夾心復(fù)合物，基于檢測復(fù)合物中的第一抗體上帶的熒光標(biāo)記的熒光強度來判斷樣品中是否 存在待檢的抗原。本發(fā)明的這一試劑盒能夠明顯的提高檢測的特異性，縮短檢測所需時間。 通過熒光標(biāo)記第一抗體，能夠明顯的提高檢測靈敏度。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，本發(fā)明的這一方面的試劑盒中的第二包被膜的另一端 連接有吸水墊。吸水墊可為強吸水物質(zhì)，這樣在檢測液態(tài)樣品時能夠給予定向作用力使液 態(tài)樣品從第一包被膜定向?qū)游鲋恋诙荒ぁ?br> [0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水墊固定 在同一固相基質(zhì)上。固相基質(zhì)主要為在使用本發(fā)明的試劑盒中的膜時有個承載，方便操作， 固相基質(zhì)的類型不作特別限定，可以為不會與待測樣品發(fā)生反應(yīng)或者不影響抗原抗體結(jié)合 的惰性材料，比如紙板、塑料板等。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一包被膜為玻璃纖維素膜，所述第二包被膜為 硝酸纖維素膜（NC膜）。玻璃纖維膜呈化學(xué)惰性，不含粘合劑，采用100 %硼硅酸玻璃纖維 制造而成，其上包被有熒光標(biāo)記的第一抗體，利于第一抗體與待測樣品中的目標(biāo)抗原發(fā)生 特異性結(jié)合。而NC膜本身是已經(jīng)添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經(jīng)存在有一定 的緩沖系統(tǒng)，具有毛細(xì)纖維結(jié)構(gòu)，能吸附比同等纖維素濾紙更多的水分，流速快，耐高溫，利 于其上包被的第三和/第四抗體分別與前述的突光標(biāo)記第一抗體-抗原和/或突光標(biāo)記第 二抗體-抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，激發(fā)熒光。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述突光標(biāo)記為突光微球標(biāo)記，所述第一抗體與所述 熒光微球標(biāo)記通過肽鍵共價結(jié)合。這樣，提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性，避免了抗體空間位阻的影 響，有利于提高靈敏度和特異性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述熒光微球直徑在納米級范 圍內(nèi)，其直徑范圍為10-500nm，較佳地為20-300nm，其上負(fù)載有熒光物質(zhì)，是受外界能量刺 激能激發(fā)出熒光的固體微粒。所述熒光微球負(fù)載的熒光物質(zhì)為摻雜熒光染料、稀土絡(luò)合物、 量子點等的轉(zhuǎn)換熒光納米材料。所述熒光微球負(fù)載的熒光物質(zhì)通過高分子聚合物修飾有活 性官能基團(tuán)，所述活性官能基團(tuán)為羧基，氨基，羥基，巰基。在本發(fā)明的一個實施例中，所述 活性官能基團(tuán)具體為羧基，所述熒光微球標(biāo)記第一抗體為將待標(biāo)記的第一抗體和羧基修飾 的熒光微球以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一抗體為A型流感病毒H5亞型抗體，所述第二 抗體為A型流感病毒H9亞型抗體，所述第三抗體為不同于所述第一抗體的A型流感病毒H5 亞型抗體，所述第四抗體為不同于所述第二抗體的A型流感病毒H9亞型抗體。第一和第三 抗體都可以特異性結(jié)合抗原A型流感病毒H5亞型，而且較佳地，兩種抗體能與H5亞型的不 同表面決定簇特異性結(jié)合，第二和第四抗體都可以特異性結(jié)合抗原A型流感病毒H9亞型， 而且較佳地，兩種抗體能與H9亞型的不同表面決定簇特異性結(jié)合，這樣利于H5和/或H9亞 型檢測的準(zhǔn)確進(jìn)行。在本發(fā)明的一個實施例中，所述第一抗體和/或第三抗體為A型流感 病毒H5亞型單克隆抗體和A型流感病毒H5亞型多克隆抗體中的任一種，所述第二抗體和 /或第四抗體為A型流感病毒H9亞型單克隆抗體和A型流感病毒H9亞型多克隆抗體中的 任一種。本發(fā)明的這一試劑盒是基于對熒光標(biāo)記、抗原和抗體特性的研究，通過選擇適合的 熒光標(biāo)記與特異性的抗體進(jìn)行定向共價化學(xué)偶聯(lián)，獲得熒光標(biāo)記抗體分析，并通過優(yōu)化雙 抗體夾心免疫反應(yīng)的各種條件，制備得到上述能夠用于檢測A型流感病毒H5和/或H9亞 型的試劑盒。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述抗抗體為羊抗鼠 IgG抗體，其能夠與第一抗體和/ 或第二抗體特異性結(jié)合，即與多余的帶熒光標(biāo)記第一抗體和/或帶熒光標(biāo)記第二抗體結(jié)合 形成免疫復(fù)合物，激發(fā)熒光，得以能夠定性和/或定量檢測該免疫復(fù)合物。
[0013] 依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供上述本發(fā)明一方面的和各種實施例中的任一試劑盒 在檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型中的用途。前面針對試劑盒所描述的優(yōu)點和技術(shù)特 征，仍適用于該試劑盒的用途，在此不再贅述。
[0014] 依據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型的方法，所 述方法包括步驟：將待測樣本加到上述任一試劑盒中的第一包被膜中的包被有帶熒光標(biāo)記 的第一抗體和帶熒光標(biāo)記的第二抗體的區(qū)域；檢測所述試劑盒中的第一區(qū)域、第二區(qū)域和 第三區(qū)域的熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光強度、第二區(qū)域熒光強度和第三區(qū)域熒光強度；基 于第一比值大于第一預(yù)定閾值，判定所述待測樣本中存在A型流感病毒H5亞型，和/或基 于第二比值大于第二預(yù)定閾值，判定所述待測樣本中存在A型流感病毒H9亞型，其中，第一 比值=第一區(qū)域熒光強度/第三區(qū)域熒光強度，第二比值=第二區(qū)域熒光強度/第三區(qū)域 熒光強度。第一包被膜中的包被有帶熒光標(biāo)記第一抗體和帶熒光標(biāo)記第二抗體的區(qū)域為 與待測樣本中的目標(biāo)抗原（若有的話）結(jié)合的區(qū)域，在本發(fā)明的一個實施例中，將該區(qū)域稱 為加樣端。在本發(fā)明的一個實施例中，所述預(yù)定閾值為〇. 025,該值是通過參考利用已知的 雙抗體夾心免疫反應(yīng)的條件或市售試劑盒產(chǎn)品，大量測定正常樣本和添加陽性樣本（含H5 和/或H9)的正常樣本來確定的，是個二者測定值的比值的均值，利用該均值作為臨界值 (cutoff)，可以準(zhǔn)確判斷檢測樣本是陽性或陰性的。在本發(fā)明的一個實施例中，通過手持儀 器檢測熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光強度和第二區(qū)域熒光強度分別與第三區(qū)域熒光強度的 比值，將兩個比值分別與所述的臨界值相比較，能夠客觀得到檢測結(jié)果，該檢測結(jié)果與市售 檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型的熒光PCR試劑盒的檢測結(jié)果一致。利用本發(fā)明的這 一檢測方法，利用本發(fā)明的上述試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對A型流感病毒H5和/或H9亞型的快速 和高靈敏測定，本發(fā)明的方法具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定的優(yōu) 點。利用本發(fā)明的這一試劑盒和/或方法檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型，對A型流感 病毒H5亞型的靈敏度達(dá)0. 016HA Unit，對A型流感病毒H9亞型的靈敏度達(dá)0. 5HA Unit。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中：
[0016] 圖1是本發(fā)明的一個實施例中的試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017] 圖2是本發(fā)明的一個實施例中的檢測A型流感病毒H5和H9亞型的試劑盒的結(jié)構(gòu) 示意圖；
[0018] 圖3是本發(fā)明的一個實施例中的檢測A型流感病毒H5和H9亞型的檢測值與濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實施方式】
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實施方式，提供了以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限 定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。另外，本發(fā)明中的術(shù) 語"包被"為免疫領(lǐng)域的術(shù)語，包含吸附、固定之意。
[0020] 以下將第一抗體稱為A型流感病毒H5亞型標(biāo)記抗體，將第二抗體稱為A型流感病 毒H9亞型標(biāo)記抗體，將熒光標(biāo)記的第一抗體稱為A型流感病毒H5亞型抗體混合物，將熒光 標(biāo)記的第二抗體稱為A型流感病毒H9亞型抗體混合物，將第三抗體稱為A型流感病毒H5 亞型包被抗體，將第四抗體稱為A型流感病毒H9亞型包被抗體，將第一區(qū)域稱為測試區(qū)1 或Tl線，將第二區(qū)域稱為測試區(qū)2或T2線，將第三區(qū)域稱為質(zhì)控區(qū)或C線，將第一包被膜 稱為樣品墊，將第二包被膜稱為包被膜。
[0021] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022] 下述實施例中所用的突光微球是購自Bangs Laboratories, Inc.公司，產(chǎn)品目 錄號為FC02F/10930固含量為10mg/ml，為羧基修飾的熒光微球，該熒光微球平均直徑為 IlOnm0
[0023] 下述實施例中所用的待標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型抗體是購自昆明云大單抗 中心的編號為F5-25、F9-17抗A型流感病毒H5和H9亞型的單克隆抗體。
[0024] 下述實施例中的A型流感病毒H5和H9亞型包被抗體是購自昆明云大單抗中心的 編號為F5-39、F9-47抗A型流感病毒H5和H9亞型的單克隆抗體。
[0025] 下述實施例中用于制作樣品墊的玻璃纖維膜購自Millipore公司、商品目錄號為 GF-CP20300。
[0026] 下述實施例中用于制作吸水墊的吸水紙購自Millipore公司、商品目錄號為 CF-SP22300。
[0027] 下述實施例中用于制作包被膜的硝酸纖維素膜購自Millipore公司、商品目錄號 為 Hi-Flow Plus HF135。
[0028] 下述實施例中的pH為7. 4的0. 02M PBS緩沖液按照如下方法配制：稱取2. 3g Na2HP04、0. 524g NaH2PO4. H20、8. 77g NaCl 溶于純水，用純水定容至 1L，調(diào) pH 至 7. 4,得到 pH 為7. 4的0. 02M PBS緩沖液。
[0029] 下述實施例中的膜處理緩沖液按照如下方法配制：將Tween-20、BSA、蔗糖溶于上 述pH為7. 4的0. 02M PBS緩沖液使Tween-20的質(zhì)量百分含量為0. 2 %、BSA的質(zhì)量百分含 量為1 %、蔗糖的質(zhì)量百分含量為2%，調(diào)pH至7. 4,得到膜處理緩沖液。
[0030] 下述實施例中的50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液按照如下方法配制：稱取I. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于IOOml純水，調(diào)pH至8. 5得到50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液。
[0031] 下述實施例中的樣品處理液按照如下方法配制：將Tween-20溶于上述pH為7. 4 的0. 02M PBS緩沖液使Tween-20的質(zhì)量百分含量為0. 2%，調(diào)pH至7. 4,得到樣品處理液。
[0032] 檢測A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒的一般制備方法包括以下步驟：
[0033] ( 一）羧基修飾的突光微球標(biāo)記探針的制備
[0034] 采用適合的羧基修飾的熒光微球，活化其表面的羧基后，采用共價偶聯(lián)的方式分 別將A型流感病毒H5和H9亞型標(biāo)記抗體定向連接到該羧基修飾的熒光微球表面。
[0035] (二）測試區(qū)T線和C線處抗體的包被
[0036] 采用噴膜儀器，于包被膜測試區(qū)的Tl線處噴涂A型流感病毒H5亞型包被抗體，于 包被膜測試區(qū)的T2線處噴涂A型流感病毒H9亞型包被抗體，于C線處噴涂羊抗鼠 IgG抗 體。
[0037](三）樣品墊處標(biāo)記探針的包被
[0038] 采用噴涂儀器，于樣品墊特定位置處噴涂熒光微球標(biāo)記的抗A型流感病毒H5和H9 亞型抗體混合物。該特定位置為樣品墊上的一塊區(qū)域，該區(qū)域即作為后續(xù)的"加樣端"。 [0039](四）試劑盒的組裝成型
[0040] 按照試劑盒的結(jié)構(gòu)圖示意圖圖2,于塑料支撐背板中間粘貼作為測試區(qū)的包被膜， 于包被膜的Tl或T2線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。采用試紙分切機，將其分切為一 定寬帶的紙條，并裝入夾片，用裝有干燥劑的鋁箔袋進(jìn)行包裝。
[0041] (五）抗原-抗體熒光免疫復(fù)合物的形成
[0042] 于上述組裝成型的反應(yīng)板的加樣端處加入待測樣品，樣品中的A型流感病毒H5亞 型與熒光微球標(biāo)記的A型流感病毒H5亞型標(biāo)記抗體結(jié)合后層析到Tl線處噴涂的A型流感 病毒H5亞型包被抗體，在Tl線處形成包被抗體-抗原-熒光微球標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物，多 余的熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型抗體則在C線處與羊抗鼠 IgG形成的熒光標(biāo) 記免疫復(fù)合物；樣品中的A型流感病毒H9亞型與熒光微球標(biāo)記的A型流感病毒H9亞型標(biāo) 記抗體結(jié)合后層析到T2線處噴涂的A型流感病毒H9亞型包被抗體，在T2線處形成包被抗 體-抗原-熒光微球標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物，多余的熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞 型抗體則在C線處與羊抗鼠 IgG形成的熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物。
[0043](六）熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物熒光強度檢測
[0044] 用熒光檢測儀測定Tl線處和T2線處熒光強度，通過與設(shè)定的閾值比對而確定其 陽性或陰性結(jié)果，C線測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。
[0045] 所述的熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物的熒光強度，是指在Tl線、T2線和C線處分別滯留下 的結(jié)合熒光微球的數(shù)量用熒光檢測儀測定后所得到的數(shù)值。通過雙抗體夾心免疫反應(yīng)的條 件，經(jīng)大量測定正常樣本和添加陽性樣本可確定出各不同正常樣本的測定均值，以此作為 臨界值（cutoff)來確定檢測樣本的陽性或陰性結(jié)果。C線測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì) 控內(nèi)標(biāo)。
[0046] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不 能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語"第一"、"第二"、"第三" 和"第四"等僅用于方便描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性，也不能理解為之 間有先后順序關(guān)系。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，"多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0047] 實施例1檢測A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒的制備
[0048] (一）熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型標(biāo)記抗體的制備
[0049] 以平均直徑為llOnm、羧基修飾的突光微球（購自Bangs Laboratories, Inc?公 司，產(chǎn)品目錄號為FC02F/10930)，抗A型流感病毒H5和H9亞型的單克隆抗體（購自昆明云 大單抗中心的編號為F5-25、F9-17)，按照下述方法制備熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和 H9亞型標(biāo)記抗體：
[0050] 取IOmg的上述羧基修飾的熒光微球用MES緩沖液（0. 1M、pH4. 7)洗滌并離心后， 用Iml MES緩沖液（0? lM、pH4. 7)重懸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC) 至終濃度為5mM、加入NHS (N-羥基丁二酰亞胺）至終濃度為10mM，室溫避光，反應(yīng)半小時得 到活化后羧基修飾的熒光微球。
[0051] 用50mM pH8. 5的硼砂緩沖液洗滌該活化后羧基修飾的熒光微球，分別取0. 37mg 上述待標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型抗體和5mg上述活化后羧基修飾的熒光微球混合到 50mM pH8. 5的硼砂緩沖液中充分混勻。室溫避光下反應(yīng)2小時，讓抗體和熒光微球形成穩(wěn) 定的肽鍵共價結(jié)合得到熒光微球與A型流感病毒H5和H9亞型抗體的偶聯(lián)物。反應(yīng)結(jié)束后， 加入終濃度為1 % (質(zhì)量百分含量）的BSA溶液對熒光微球與A型流感病毒H5和H9亞型 抗體的偶聯(lián)物上剩余活性羧基位點進(jìn)行封閉，室溫避光反應(yīng)〇. 5小時。完成后，用pH7. 4的 0. 02M PBS緩沖液洗滌、重懸得到5mg/ml熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型抗體液 體，4°C保存待用。
[0052] (二）檢測A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒的制備
[0053] 以A型流感病毒H5和H9亞型包被抗體，以羊抗鼠 IgG抗體制備包被膜，具體方法 如下：
[0054] 采用pH7. 4的0. 02M PBS緩沖液，將羊抗鼠 IgG抗體（長沙博優(yōu)生物科技有限公 司，ABGAM-0500)配制為濃度lmg/ml溶液，將A型流感病毒H5和H9亞型包被抗體（購自昆 明云大單抗中心的編號為F5-39、F9-47)的濃度分別配制為濃度2mg/ml溶液，選用BioDot 的XYZ3050噴膜系統(tǒng)將羊抗鼠 IgG抗體噴至包被膜（硝酸纖維素膜）的質(zhì)控線（C線）位 置，將A型流感病毒H5亞型包被抗體噴至檢測線（Tl線）位置，將A型流感病毒H9亞型包 被抗體噴至檢測線（T2線）位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間進(jìn)行抽濕4小時后干 燥待用，得到具有檢測線和質(zhì)控線的包被膜。
[0055] 用上述膜處理緩沖液浸泡玻璃纖維紙半小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕 條件進(jìn)行抽濕4小時后，用上述膜處理緩沖液稀釋步驟（一）所得熒光微球標(biāo)記A型流感病 毒H5和H9亞型抗體液體至熒光微球標(biāo)記A型流感病毒H5和H9亞型抗體含量為0. 05mg/ ml混合液后，采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)將其噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上 制備形成樣品墊，于同樣的抽濕條件進(jìn)行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干 燥好的具有檢測線和質(zhì)控線的包被膜、上述樣品墊、吸水墊、背板按圖2所示進(jìn)行搭配組裝 后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為4mm/條的寬度，裝入檢測用夾片 待用。
[0056] 實施例2檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型試劑盒的評估 [0057](一）檢測靈敏度
[0058] 以A型流感病毒H5和H9亞型HI試驗抗原作為待測樣品來測定實施例1的檢測 A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒的靈敏度。
[0059] 同時將A型流感病毒H5和H9亞型HI試驗抗原用pH為7. 4的0. 02M PBS緩沖 液分別和混合配制成系列濃度（64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 063、0. 031、0. 016、 0. 008、0HA Unit)，分別加入由實施例1得到的檢測A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒的 加樣端中，并采用熒光檢測儀檢測熒光強度。檢測步驟：檢測前先將待檢測樣品恢復(fù)室溫 (25°C )，用精確移液器取待檢測樣品60 iU垂直緩慢滴入實施例1得到的檢測A型流感病 毒H5和H9亞型試劑盒的加樣端，10分鐘后用熒光檢測儀進(jìn)行測試。
[0060] 其檢測結(jié)果如下表1所示。從檢測結(jié)果中可以得出實施例1的檢測A型流感病毒 H5亞型的靈敏度為0. 016HA Unit，檢測A型流感病毒H9亞型的靈敏度為0. 5HA Unit(T/C Cut-Off值大于0. 025為陽性值）。
[0061] A型流感病毒H5和H9亞型試劑盒檢測值與濃度曲線圖如圖3所示。
[0062] 表I A型流感病毒H5和H9亞型不同樣品濃度的試劑盒檢測值
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種試劑盒，其包括第一包被膜和第二包被膜，所述第一包被膜的一端與所述第二 包被膜的一端相連， 所述第一包被膜中的至少一塊區(qū)域包被有帶熒光標(biāo)記的第一抗體和帶熒光標(biāo)記的第 二抗體， 所述第二包被膜包含分離的第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域和所述第 二區(qū)域比所述第三區(qū)域靠近所述第一包被膜， 所述第一區(qū)域包被有第三抗體，所述第三抗體和所述第一抗體能夠特異性結(jié)合同一種 抗原， 所述第二區(qū)域包被有第四抗體，所述第四抗體與所述第二抗體能夠特異性結(jié)合同一種 抗原， 所述第三區(qū)域包被有抗抗體，所述抗抗體能夠特異性結(jié)合所述第一抗體和所述第二抗 體。
2. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第二包被膜的另一端連接有吸水墊。
3. 權(quán)利要求2的試劑盒，其特征在于，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水墊 固定在同一固相基質(zhì)上。
4. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第一包被膜為玻璃纖維素膜，所述第二包被 膜為硝酸纖維素膜。
5. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，所述熒光標(biāo)記為熒光微球標(biāo)記。
6. 權(quán)利要求5的試劑盒，其特征在于，所述第一抗體與所述熒光微球標(biāo)記通過肽鍵共 價結(jié)合，所述第二抗體與所述熒光微球標(biāo)記通過肽鍵共價結(jié)合。
7. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，所述第一抗體為A型流感病毒H5亞型抗體，所述 第二抗體為A型流感病毒H9亞型抗體，所述第三抗體為不同于所述第一抗體的A型流感病 毒H5亞型抗體，所述第四抗體為不同于所述第二抗體的A型流感病毒H9亞型抗體。
8. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，所述抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。
9. 權(quán)利要求1-8任一試劑盒在檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型中的用途。
10. -種檢測A型流感病毒H5和/或H9亞型的方法，其特征在于，包括， 將待測樣本加到權(quán)利要求1-8任一試劑盒中的第一包被膜中的包被有帶熒光標(biāo)記的 第一抗體和帶熒光標(biāo)記的第二抗體的區(qū)域； 檢測所述試劑盒中的第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域的熒光強度，獲得第一區(qū)域熒光 強度、第二區(qū)域熒光強度和第三區(qū)域熒光強度； 基于第一比值大于第一預(yù)定閾值，判定所述待測樣本中存在A型流感病毒H5亞型，和 /或，基于第二比值大于第二預(yù)定閾值，判定所述待測樣本中存在A型流感病毒H9亞型，其 中，第一比值=第一區(qū)域熒光強度/第三區(qū)域熒光強度，第二比值=第二區(qū)域熒光強度/第 三區(qū)域熒光強度； 任選地，所述第一預(yù)定閾值和第二預(yù)定閾值均為0. 025。
【文檔編號】G01N21/64GK104407135SQ201410614127
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】馬嵐, 吳峰, 秦智鋒, 盧體康 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院