萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體及其構(gòu)建方法和應用，所述RNAi載體含有一個萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子HSP70A/RBCS2、內(nèi)含子和3’UTR和潮霉素篩選標記表達框序列，萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子HSP70A/RBCS2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，潮霉素篩選標記表達框序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本發(fā)明利用PCR技術(shù)把目的基因的部分cDNA片段先構(gòu)建到中間載體pEASY-T1上，然后再通過兩次酶切相繼把目標基因的正向和反向片段連接到萊茵衣藻RNAi骨架載體上，簡化了載體構(gòu)建步驟，縮短了載體構(gòu)建時間，提高了效率，同時可以直接應用到衣藻其它基因的功能研究方面。
【專利說明】萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體及其構(gòu)建方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及RNAi載體領(lǐng)域，具體地指一種萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體及其構(gòu) 建方法和應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 萊茵衣藻屬于綠藻門、團藻目、衣藻科，是真核單細胞生物，進化上比較古老，介于 高等植物和動物之間。萊茵衣藻培養(yǎng)條件簡單、生長周期短、光合效率高、遺傳背景清楚，與 酵母細胞有許多共同的特征，素有"綠色酵母"之稱。其生物學特性與高等植物和動物密切 相關(guān)，是目前用于研究纖毛的模式生物中最為廣泛使用的一個。
[0003] 近年來，我們關(guān)于纖毛的知識大多來自于對萊茵衣藻的研究，比如：我們對纖 毛結(jié)構(gòu)的了解，"鞭毛內(nèi)運輸"的機制的發(fā)現(xiàn)以及與纖毛相關(guān)疾病的確定等。"鞭毛內(nèi)運 輸"（intraflagellar transport,簡稱IFT)是發(fā)生于纖毛軸絲和纖毛膜之間從纖毛基 部到頂端的一種蛋白質(zhì)復合體的雙向運輸過程。運動的蛋白復合體被稱為IFT顆粒（IFT particles)，由15?17個多肽組成，可分為蛋白質(zhì)復合體A和B;巴德-畢氏綜合征 (Bardet-Biedl syndrome, BBS)蛋白具有協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)復合體A和B之間聯(lián)系的功能。其中， 巴德-畢氏（Bardet-Biedl syndrome, BBS)綜合癥就是一種由多種基因突變造成的、與原 生纖毛功能缺失相關(guān)的疾病。包含12種致病基因，分別為BBSl?12。BBS患者的癥狀包 括視網(wǎng)膜衰退、腎囊形成、多指（趾）癥、嗅覺失敏、高血壓、肥胖癥乃至精神發(fā)育遲滯癥等。 最近的研究發(fā)現(xiàn)BBS蛋白位于纖毛或基體，它們參與了纖毛的組裝過程和信號傳導過程。 IFT馬達蛋白或顆粒蛋白的缺陷將限制形成新的纖毛，亦可造成已形成的纖毛發(fā)生縮短解 聚。在萊茵衣藻中，抑制BBS5的表達，纖毛將不能形成；BBSl或BBS4基因突變，萊茵衣藻 喪失了趨光性，IFT蛋白顆粒的組裝和運輸沒有受到影響，但是其失去趨光性的分子機制尚 不清楚，有待于我們進一步深入研究。
[0004] 2007年萊茵衣藻基因組測序的完成為萊茵衣藻反向遺傳學的研究提供了 可能。RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。它是一種高 效的特異性強的基因阻斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，目前已成為功能基因組研究領(lǐng)域中一種 簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，在一定程度上起到了基因 Knock-down的效果。因 此若用RNAi技術(shù)對衣藻BBS基因或IFT顆粒蛋白基因進行研究，將會促進我們深刻了解和 認識萊茵衣藻趨光性及纖毛組裝的分子機制，同時有可能揭示出"纖毛相關(guān)疾病"發(fā)生的分 子機理。
[0005]目前衣藻中已經(jīng)有相應的RNAi載體，但其構(gòu)建步驟較為繁瑣，需要多次酶切和連 接才能構(gòu)建成功，而且其轉(zhuǎn)化后陽性克隆子的篩選效果也不理想。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體及其構(gòu) 建方法和應用。本發(fā)明在對萊茵衣藻靶基因敲除的過程中，構(gòu)建各種中間重組載體，獲得了 含有萊茵衣藻啟動子、內(nèi)含子、3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列的萊茵衣藻RNAi骨架 載體，然后再把BBSl靶基因的正向和反向片段序列相繼構(gòu)建到萊茵衣藻RNAi骨架載體上， 形成BBSl基因的RNAi載體。從而實現(xiàn)對萊茵衣藻BBSl目標基因的沉默，改變?nèi)R茵衣藻的 趨光性，為萊茵衣藻趨光性分子機制的研究奠定基礎(chǔ)，同時構(gòu)建的RNAi載體也可應用到衣 藻中其它基因的研究，因此具有較好的應用價值。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體，所述 尺嫩1載體含有一個萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子批?7(^/1?052、內(nèi)含子和3'^1?和潮霉 素篩選標記表達框序列，其中，萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子HSP70A/RBCS2的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示，3'UTR的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，潮霉素篩選標記表達框 序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 進一步地，所述RNAi載體含有還有一個hpRNA表達盒，所述hpRNA表達盒包括順 序連接的啟動子、相關(guān)基因正向片段、內(nèi)含子、相關(guān)基因反向片段、3'UTR和潮霉素篩選標記 表達框序列。
[0009] 再進一步地，所述內(nèi)含子為磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子，所述磷酸核酮糖激 酶的第四段內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示
[0010] 再進一步地，所述相關(guān)基因為BBSl基因或BBS4基因或IFT20基因，其中，BBSl基 因的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，BBS4基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，IFT20 基因核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示。
[0011] 本發(fā)明提供了一種萊茵衣藻BBSl基因的RNAi載體制備方法，包括以下步驟：
[0012] l)pGH_intron中間載體的構(gòu)建
[0013] 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的磷酸核酮糖激酶序列信息GenBank號：AAA33090. 1，設(shè)計一對引 物：
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體，其特征在于：所述RNAi載體含有一個萊茵衣 藻嵌合組成型表達啟動子HSP70A/RBCS2、內(nèi)含子和3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列， 其中，萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子HSP70A/RBCS2的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示， 3'UTR的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，潮霉素篩選標記表達框序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體，其特征在于：所述RNAi載體含 有還有一個hpRNA表達盒，所述hpRNA表達盒包括順序連接的啟動子、相關(guān)基因正向片段、 內(nèi)含子、相關(guān)基因反向片段、3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體，其特征在于：所述內(nèi)含子 為磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子，所述磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子的核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體，其特征在于：所述相關(guān)基 因為BBSl基因或BBS4基因或IFT20基因，其中，BBSl基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所 示，BBS4基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，IFT20基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 7 所示。
5. -種萊茵衣藻BBSl基因的RNAi載體制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 1. pGH_intron中間載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的磷酸核酮糖激酶序列信息GenBank號：AAA33090. 1，設(shè)計一對引物：
的第四段內(nèi)含子，回 收PCR產(chǎn)物連接pEASR-Tl載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細胞，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行測序， 獲得磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子序列，即間隔序列；然后將間隔序列插入PGH載體內(nèi)， 得到中間載體pGH-intron ; 2. pChlamy_RNAi骨架載體的構(gòu)建 A :萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子pHSP70A/RBCS2序列的獲得 以 Invitrogen 公司 GeneAlt? Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3 載 體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，獲得萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動 子 HSP70A/RBCS2 序列； B :構(gòu)建含有萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子PHSP70A/RBCS2序列的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron 用Pst I和Kpn I酶切步驟2)A得到的帶有萊茵衣藻啟動子的pEASY-Tl重組載體， 然后與同樣經(jīng)Pst I和Kpn I酶切的重組載體pGH-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動 子 HSP70A/RBCS2 的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron ; C :萊茵衣藻3' UTR及潮霉素篩選標記表達框序列的獲得 同樣以 invitrogen 公司（Α、ικν\Π '. Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3載體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，得到我們要構(gòu)建的萊茵衣藻RNAi 載體的3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列； D :構(gòu)建含有萊茵衣藻啟動子、3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列的萊茵衣藻 pChlamy_RNAi骨架載體 用Xba I和Not I酶切步驟2)中小步驟C)中得到的帶有萊茵衣藻3' UTR和潮霉素 篩選標記表達框序列的pEASY-Tl重組載體，然后與同樣經(jīng)Xba I和Not I酶切的中間載 體pGH-HSP70A/RBCS2-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動子、3 ' UTR和潮霉素篩選標記表 達框序列的萊茵衣藻pChlamy_RNAi骨架載體； 3. BBSl基因部分cDNA目的片段的獲得 為了確認cDNA選取片段對BBSl基因干擾效果的影響，我們選取了 BBSl基因上的兩段 序列，分別命名為BBSL 1和BBSL 2,具體方法如下：用TRIzoL提取萊茵衣藻總RNA，反轉(zhuǎn) 錄、以其cDNA為模板，設(shè)計以下兩對引物：
以上述兩對引物進行PCR擴增，然后分別連接到pEASY-Tl載體上、測序，形成 pEASY-Tl-BBSl. 1/2. 1 中間載體，獲得 BBSl 基因兩段 cDNA 片段 BBSL 1 和 BBS2. 1 ; 4)pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. l_FRRNAi 載體的構(gòu)建 A :含有BBSl基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. 1_F RNAi載體的構(gòu)建 酶切含有BBSl基因正向目的片段的pEASY-Tl-BBSl. 1/2. 1中間載體質(zhì)粒，與同樣 經(jīng)Kpn I和Spe I的pChlamy_RNAi骨架載體連接，獲得含有BBSl基因正向目的片段的 pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. 1_F RNAi 載體； B :含有BBSl基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. 1_FR RNAi載體的 構(gòu)建 酶切含有BBSl基因反向目的片段的pEASY-Tl-BBSl. 1/2. 1中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng) Nde I和Xba I酶切的含有BBSl基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. 1_F RNAi 載體連接，獲得含有BBSl基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBSl. 1/2. 1_FR RNAi 載體，即萊茵衣藻茵衣藻BBSl基因 RNAi載體。
6. -種萊茵衣藻BBS4基因的RNAi載體制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 1. pGH_intron中間載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的磷酸核酮糖激酶序列信息GenBank號：AAA33090. 1，設(shè)計一對引物：
以萊茵衣藻基因組DNA為模板，進行PCR擴增磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子，回收 PCR產(chǎn)物連接pEASR-Tl載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細胞，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行測序，獲 得磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子序列，即間隔序列；然后將間隔序列插入PGH載體內(nèi)，得 到中間載體pGH-intron ; 2. pChlamy_RNAi骨架載體的構(gòu)建 A :萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子pHSP70A/RBCS2序列的獲得 以 Invitrogen 公司 GeneArt? Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3 載 體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，獲得萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動 子 HSP70A/RBCS2 序列； B :構(gòu)建含有萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子PHSP70A/RBCS2序列的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron 用Pst I和Kpn I酶切步驟2)A得到的帶有萊茵衣藻啟動子的pEASY-Tl重組載體， 然后與同樣經(jīng)Pst I和Kpn I酶切的重組載體pGH-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動 子 HSP70A/RBCS2 的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron ; C :萊茵衣藻3' UTR及潮霉素篩選標記表達框序列的獲得 同樣以 invitrogen 公司 GeneArt? Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3載體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，得到我們要構(gòu)建的萊茵衣藻RNAi 載體的3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列； D :構(gòu)建含有萊茵衣藻啟動子、3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列的萊茵衣藻 pChlamy_RNAi骨架載體 用Xba I和Not I酶切步驟2)中小步驟C)中得到的帶有萊茵衣藻3' UTR和潮霉素 篩選標記表達框序列的pEASY-Tl重組載體，然后與同樣經(jīng)Xba I和Not I酶切的中間載 體pGH-HSP70A/RBCS2-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動子、3 ' UTR和潮霉素篩選標記表 達框序列的萊茵衣藻pChlamy_RNAi骨架載體； 3. BBS4基因部分cDNA目的片段的獲得 用TRIzoL提取萊茵衣藻總RNA，反轉(zhuǎn)錄、以其cDNA為模板，根據(jù)BBS4基因的序列設(shè)計 以下引物：
以上述一對引物進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，形成 PEASY-T1-BBS4中間載體，獲得BBSl基因的一段cDNA序列； 4)pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi 載體的構(gòu)建 A :含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi載體的構(gòu)建 酶切含有BBS4基因正向目的片段的pEASY-Tl-BBS4中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)Kpn I和 Spe I的pChlamy_RNAi骨架載體連接，獲得含有BBSl基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_ BBS4F RNAi 載體； B :含有BBS4基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4FR RNAi載體的構(gòu)建 酶切含有BBS4基因反向目的片段的pEASY-Tl-BBS4中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)Nde I和 Xba I酶切的含有BBS4基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS4F RNAi載體連接，獲得含 有BBS4基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS44FR RNAi載體，即萊茵衣藻茵衣藻 BBS4基因 RNAi載體。
7. -種萊茵衣藻IFT20基因基因的RNAi載體制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 1. pGH_intron中間載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的磷酸核酮糖激酶序列信息GenBank號：AAA33090. 1，設(shè)計一對引物：
以萊茵衣藻基因組DNA為模板，進行PCR擴增磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子，回收 PCR產(chǎn)物連接pEASR-Tl載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細胞，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行測序，獲 得磷酸核酮糖激酶的第四段內(nèi)含子序列，即間隔序列；然后將間隔序列插入PGH載體內(nèi)，得 到中間載體pGH-intron ; 2. pChlamy_RNAi骨架載體的構(gòu)建 A :萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子pHSP70A/RBCS2序列的獲得 以 Invitrogen 公司 GeneArt*". Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3 載 體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，獲得萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動 子 HSP70A/RBCS2 序列； B :構(gòu)建含有萊茵衣藻嵌合組成型表達啟動子PHSP70A/RBCS2序列的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron 用Pst I和Kpn I酶切步驟2)A得到的帶有萊茵衣藻啟動子的pEASY-Tl重組載體， 然后與同樣經(jīng)Pst I和Kpn I酶切的重組載體pGH-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動 子 HSP70A/RBCS2 的重組載體 pGH-HSP70A/RBCS2-intron ; C :萊茵衣藻3' UTR及潮霉素篩選標記表達框序列的獲得 同樣以 invitrogen 公司 GeneArt? Chlamydomonas Engineering kits 中的 pChlamy_3載體質(zhì)粒為模板， 設(shè)計一對引物：
進行PCR擴增，然后連接到pEASY-Tl載體上、測序，得到我們要構(gòu)建的萊茵衣藻RNAi 載體的3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列； D :構(gòu)建含有萊茵衣藻啟動子、3' UTR和潮霉素篩選標記表達框序列的萊茵衣藻 pChlamy_RNAi骨架載體 用Xba I和Not I酶切步驟2)中小步驟C)中得到的帶有萊茵衣藻3' UTR和潮霉素 篩選標記表達框序列的pEASY-Tl重組載體，然后與同樣經(jīng)Xba I和Not I酶切的中間載 體pGH-HSP70A/RBCS2-intron連接，得到含有萊茵衣藻啟動子、3 ' UTR和潮霉素篩選標記表 達框序列的萊茵衣藻pChlamy_RNAi骨架載體； 3. IFT20基因部分cDNA目的片段的獲得 用TRIzoL提取萊茵衣藻總RNA，反轉(zhuǎn)錄、以其cDNA為模板，根據(jù)IFT20基因序列設(shè)計以 下引物：
用上述引物進行PCR擴增，然后分別連接到pEASY-Tl載體上、測序，形成 PEASY-T1-IFT20中間載體，獲得IFT20基因 cDNA片段； 4. pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi 載體的構(gòu)建 A :含有IFT20基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FRNAi載體的構(gòu)建 酶切含有IFT20基因正向目的片段的pEASY-Tl-IFT20中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)Kpn I 和Spe I的pChlamy_RNAi骨架載體連接，獲得含有IFT20基因正向目的片段的pChlamy_ RNAi_IFT20F RNAi 載體； B :含有IFT20基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi載體的構(gòu)建 酶切含有IFT20基因反向目的片段的pEASY-Tl-IFT20中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)Nde I 和Xba I酶切的含有BBSl基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FRNAi載體連接，獲 得含有BBSl基因正向和反向目的片段的pChlamy_RNAi_IFT20FR RNAi載體，即萊茵衣藻茵 衣藻IFT20基因 RNAi載體。
8. -種權(quán)利要求1?4中任意一項所述萊茵衣藻相關(guān)基因的RNAi載體的應用，其特征 在于：研究萊茵衣藻趨光性的分子機制的應用，研究鞭毛顆粒蛋白復合體是如何裝載和卸 載貨物及馬達蛋白的活性又是如何調(diào)控中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK104388455SQ201410591912
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】陳利紅, 李麗麗, 高利芬, 周俊飛, 李甜甜, 彭海, 張繼, 方治偉, 章偉雄 申請人:江漢大學