一種適用于pcr或hrm檢測分析的微流控芯片及檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片及檢測裝置，通過微管道和陣列反應(yīng)腔基板構(gòu)成組合模具，通過注塑法生成微流控基片，以等離子體清洗與玻璃鍵合成微流控芯片，芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入帶有手柄和孔道的旋桿構(gòu)成旋轉(zhuǎn)閥，以手柄旋轉(zhuǎn)使孔道斷開控制多反應(yīng)腔進(jìn)樣的通斷及密封，實(shí)現(xiàn)各反應(yīng)腔之間物理隔離，密封性好，不存在相互污染，可實(shí)現(xiàn)多樣本的同時(shí)檢測。本發(fā)明既可以用于獨(dú)立的PCR檢測或者HRM檢測，也可以用于聯(lián)合的先PCR檢測緊接著無需任何改變的進(jìn)入HRM檢測，實(shí)現(xiàn)檢測的多功能化。
【專利說明】—種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片及檢測裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控芯片的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片及檢測裝置。

【背景技術(shù)】
[0002]微流控芯片作為新型的微納分析技術(shù)平臺(tái)，將生物和化學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、分離與檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯片上，具有多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺(tái)上靈活組合、規(guī)模集成的特征和優(yōu)勢。微流控芯片具有節(jié)約空間和試劑、熱容量小、升降溫速率快、易于集成化等優(yōu)點(diǎn)。微流控芯片在裝置上的主要特征是其容納流體的有效結(jié)構(gòu)(包括通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件)至少在一個(gè)維度上為微米級(jí)尺度。與宏觀尺度的實(shí)驗(yàn)裝置相比，微流控芯片的微米級(jí)結(jié)構(gòu)顯著增大了流體環(huán)境的面積/體積比例。這一變化在微流控系統(tǒng)中導(dǎo)致一系列與物體表面有關(guān)的、決定其特殊性能的特有效應(yīng)。這些效應(yīng)大多數(shù)使微流控芯片的分析性能顯著超過宏觀條件下的分析體系。
[0003]高分辨率熔解(high-resolut1n melting, HRM)曲線分析是近年來在實(shí)時(shí)突光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新興技術(shù)。HRM是基于核酸的物理性質(zhì)，根據(jù)DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，對(duì)PCR產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行分析，其極高的溫度均一性和分辨率使其分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分，從而完成對(duì)樣品的序列分析?；谶@種檢測原理，HRM檢測不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，既可以對(duì)未知突變進(jìn)行篩查、掃描，又可以對(duì)已知突變進(jìn)行分析，所需要的只是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上增加一個(gè)飽和染料。所以，相比傳統(tǒng)的突變分析法和定量探針法，在確保結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)之上，簡化了操作時(shí)間和步驟，大大降低了使用成本，可廣泛應(yīng)用于檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡單序列重復(fù)(SSR)和插入/缺失等多種DNA變異，物種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及分型、等位基因頻率分析、甲基化研究等多個(gè)研究領(lǐng)域，已成為近年來國外新興遺傳學(xué)、方法學(xué)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。
[0004]HRM有專用熒光染料，目前市場上的飽和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYT09等幾種。SYBR Green I就屬于非飽和性染料，由于它對(duì)PCR的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度很低，遠(yuǎn)未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降。飽和染料在飽和濃度(熒光最大)下，也不會(huì)抑制PCR。高濃度的染料飽和了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會(huì)發(fā)生重排，所以高的分辨率能區(qū)分熔解曲線。
[0005]擴(kuò)增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生了突變，都會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個(gè)差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。對(duì)于做高分辨率熔解曲線分析的儀器，在熔解操作時(shí)每攝氏度至少要獲得10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即達(dá)到0.1°C區(qū)分。此外，溫度均一性也要求兩孔之間溫度相差小于0.1°C，否則可能導(dǎo)致最終的熔解溫度相差0.1°C，就無法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0006]目前市場上銷售的具備高分辨率熔解曲線分析(High resolut1n melting,HRM)功能的熒光定量PCR儀僅有三款，均為國外公司生產(chǎn)。有關(guān)HRM研究在國內(nèi)開展的還比較少，其核心技術(shù)主要掌握在國外幾家知名生命科學(xué)儀器研發(fā)公司。美國猶他大學(xué)保健科學(xué)中心病理學(xué)部Carl Wittwer實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合美國Idaho Technology公司，在實(shí)時(shí)突光分析技術(shù)的基礎(chǔ)之上，于2006生產(chǎn)出世界上第一臺(tái)HRM儀器HR-1。該設(shè)備具有精確的溫度控制系統(tǒng)，并結(jié)合了高速的數(shù)據(jù)采集技術(shù)，配合使用高分辨的飽和LC Green熒光染料，使其具有超高的靈敏度和特異性，但HR-1不具備PCR熱循環(huán)性能，每次只能分析單個(gè)樣本并要結(jié)合LightcycIer系列毛細(xì)管PCR擴(kuò)增儀使用，且分析結(jié)束后產(chǎn)物不易取出，難以用于下游分析，HR-1在應(yīng)用中實(shí)用性較差。羅氏公司的LightScanner使用改良過的熱模塊設(shè)計(jì)，敏感性和特異性好，整個(gè)微孔板的檢測同時(shí)進(jìn)行，但其盡管應(yīng)用先進(jìn)的工程技術(shù)，仍然無法避免孔與孔之間的熱學(xué)和光學(xué)的差異影響，溫度和光照均一性沒有得到妥善解決。Qiagen公司的Rotor-Gene 6000是首款具有熱循環(huán)和HRM性能的多孔儀器，實(shí)現(xiàn)了 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析在同一管中完成，節(jié)約了時(shí)間，減少了污染，但是也同樣具有熱學(xué)和光學(xué)非均一性的缺點(diǎn)。
[0007]微流控芯片具有液體流動(dòng)可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點(diǎn)，它可以在幾分鐘甚至更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行上百個(gè)樣品的同時(shí)分析，并且可以在線實(shí)現(xiàn)樣品的預(yù)處理及分析全過程。隨著微流控PCR芯片技術(shù)的發(fā)展，高通量的微流控PCR芯片集成了成千上萬個(gè)反應(yīng)腔，CXD利用一次成像記錄芯片上所有信息通過對(duì)圖像的分析，能及時(shí)、準(zhǔn)確的給出每一個(gè)反應(yīng)腔的實(shí)時(shí)信息。
[0008]微流控芯片反應(yīng)腔的試劑在PCR反應(yīng)中經(jīng)歷多次高溫到低溫，低溫到高溫的循環(huán)，在高分辨率熔解曲線分析中，也是經(jīng)歷溫度低溫到高溫過程，尤其是在高溫時(shí)，如果反應(yīng)腔密封不好，試劑容易溢出，從而影響實(shí)驗(yàn)檢測，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。微閥的密封性顯得十分的重要。常用的密封形式有，采用氣動(dòng)微閥，易于集成化，可實(shí)現(xiàn)陣列式密封，操作簡單，但微閥在受熱時(shí)容易泄漏；采用微柱塞子式的密封，密封效果好，但是對(duì)于陣列式反應(yīng)腔，腔體多，操作繁瑣耗時(shí)；采用螺釘式的密封，密封遇到情況和微柱塞子式的一樣；采用液體固化式密封，流體流進(jìn)封口，容易造成腔體試劑溢出，造成相互參雜干擾；采用蠟熔式密封，利用物質(zhì)的熔點(diǎn)大于水的特性，但是這種密封也存在反應(yīng)腔試劑溢出，造成相互參雜干擾；采用復(fù)合方式，即進(jìn)樣是一種閥，腔內(nèi)反應(yīng)采用另一種閥密封，這種操作也太繁瑣。微閥的設(shè)計(jì)與制作與芯片的用途息息相關(guān)，進(jìn)樣閥與腔體反應(yīng)的密封閥功能不一樣，使用普通設(shè)計(jì)思維設(shè)計(jì)微閥，二者兼顧存在著實(shí)現(xiàn)困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明為了解決克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種既可以用于獨(dú)立的PCR檢測或者HRM檢測，也可以用于聯(lián)合的先PCR檢測緊接著無需任何改變的進(jìn)入HRM檢測的帶有旋轉(zhuǎn)閥的微流控芯片和檢測裝置，實(shí)現(xiàn)檢測的多功能化，使用帶有旋轉(zhuǎn)閥的微流控芯片操作，既可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣的通斷，也可以實(shí)現(xiàn)腔內(nèi)反應(yīng)時(shí)需求的通道密封，使用微流控芯片提升了反應(yīng)速度，縮短了整個(gè)反應(yīng)所需的時(shí)間，過程密封性好，防止多腔同時(shí)檢測間的相互干擾，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0010]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0011]一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，該微流控芯片包括基片，玻璃基底，旋轉(zhuǎn)桿，微通道和反應(yīng)腔，其中，旋轉(zhuǎn)桿包括微孔，長桿和手柄；基片以等離子體清洗反應(yīng)腔表面后與玻璃基底鍵合成微流控芯片，微流控芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入旋轉(zhuǎn)桿以構(gòu)成該微流控芯片旋轉(zhuǎn)微閥，以手柄旋轉(zhuǎn)至垂直于玻璃基底，旋轉(zhuǎn)桿上的微孔與基片的微通道連通，此時(shí)可以注入試劑，可視為旋轉(zhuǎn)微閥打開；當(dāng)旋轉(zhuǎn)桿手柄旋轉(zhuǎn)與玻璃基底平行，旋轉(zhuǎn)桿的微孔與微通道斷開，兩通道成90度互不連通，試劑無法注入到反應(yīng)腔內(nèi)，此時(shí)可視為微閥關(guān)閉；該微流控芯片放置于CDD模塊、LED模塊以及濾光片組成的檢測模塊下方，貼著熱沉銀片、TEC加熱制冷模塊和熱管風(fēng)冷散熱器組成的溫控模塊進(jìn)行PCR或HRM檢測分析。
[0012]進(jìn)一步的，反應(yīng)腔的可以是單排，也可以是多排，利用此旋轉(zhuǎn)桿可以實(shí)現(xiàn)控制多反應(yīng)腔密封。
[0013]進(jìn)一步的，該微流控芯片通過微管道和反應(yīng)腔基板構(gòu)成組合模具，通過注塑法生成微流控基片，以等離子體清洗反應(yīng)腔表面后與玻璃基底鍵合成微流控芯片，微流控芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入帶有手柄和微孔的旋轉(zhuǎn)桿構(gòu)成旋轉(zhuǎn)微閥，以手柄旋轉(zhuǎn)使微孔和微通道組成的孔道斷開控制多反應(yīng)腔密封。
[0014]進(jìn)一步的，生成該微流控芯片的基片的組合模具包括模具殼、模具橫柱和模具立柱；模板上表面具有微流控芯片反應(yīng)腔形狀的凸起陣列腔體，凸起陣列腔體的列和排可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)；模具橫柱中部具有模具立柱可穿過的微孔，模具立柱貫穿芯片上下層，生成注樣的進(jìn)樣口 ；模具注塑固化，取下模具立柱，取出模具橫柱，從模板上脫落即可；制作的微流控芯片的基片，采用等離子清洗基片和玻璃基底的表面改性進(jìn)行鍵合。
[0015]進(jìn)一步的，注塑生成的微流控芯片的玻璃基底材料可以是PDMS，PC, PMMA或PS聚合物材料，旋轉(zhuǎn)桿的材料為鐵、銅、鋁固態(tài)金屬或者硬質(zhì)塑料。
[0016]進(jìn)一步的，手柄一端露在外面，帶微孔的長桿嵌入芯片；微孔與反應(yīng)腔對(duì)外通道在手柄垂直芯片時(shí)是一致連通的，旋轉(zhuǎn)90度后微閥關(guān)閉，微閥可以控制進(jìn)樣的通斷，也可以做腔內(nèi)反應(yīng)的通道密封；長桿上的微孔數(shù)與陣列反應(yīng)腔的列數(shù)相對(duì)應(yīng)；若芯片中間相鄰排共用一個(gè)旋轉(zhuǎn)閥，芯片需要的旋轉(zhuǎn)桿數(shù)比陣列反應(yīng)腔排數(shù)多一個(gè)，否則芯片需要的旋桿數(shù)為陣列反應(yīng)腔2倍。
[0017]另外，本發(fā)明提供一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片的檢測裝置，該檢測裝置包括檢測模塊、溫控模塊和上述的微流控芯片；其中⑶D模塊、LED模塊以及濾光片組成的檢測模塊；熱沉銀片、TEC加熱制冷模塊和熱管風(fēng)冷散熱器組成的溫控模塊；檢測模塊位于所述的微流控芯片的正上方，所述的微流控芯片下表面緊貼熱沉的溫控模塊。
[0018]進(jìn)一步的，CXD模塊垂直接收從所述的微流控芯片發(fā)出的熒光，LED模塊位于CXD模塊對(duì)稱的兩側(cè)，且LED激發(fā)光線與水平面成45度至75度之間的夾角，濾光片位于CCD模塊和LED激發(fā)光的頂端。
[0019]進(jìn)一步的，溫控模塊的結(jié)構(gòu)利于微流控芯片加熱和TEC加熱制冷模塊散熱，成層狀分布，從上到下，分別為所述的微流控芯片，均勻溫度的熱沉銀片，TEC加熱制冷模塊，熱管風(fēng)冷散熱器。
[0020]本發(fā)明的原理在于:
[0021]1、該微流控芯片通過微管道和反應(yīng)腔基板構(gòu)成組合模具，通過注塑法生成微流控基片，以等離子體清洗反應(yīng)腔表面后與玻璃基底鍵合成微流控芯片，芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入帶有手柄和孔道的旋桿構(gòu)成旋轉(zhuǎn)閥，以手柄旋轉(zhuǎn)使孔道斷開控制多反應(yīng)腔密封。
[0022]2、生成微流控基片的組合模具包括模板、橫柱和立柱；模板上表面具有芯片反應(yīng)腔形狀的凸起，陣列反應(yīng)腔的列和排可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)；橫柱中部具有立柱可穿過的通孔，立柱貫穿芯片上下層，生成注樣的進(jìn)樣口 ；模具注塑固化，取下立柱，取出橫柱，從模板上脫落即可；制作的微流控基片，采用等離子清洗基片和玻璃基底的表面改性進(jìn)行鍵口 ο
[0023]3、在芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入帶有手柄和孔道的旋桿構(gòu)成旋轉(zhuǎn)閥；旋桿的手柄一端露在外面，帶孔長桿嵌入芯片；孔道與反應(yīng)腔對(duì)外通道在手柄垂直芯片時(shí)是一致連通的，旋轉(zhuǎn)90度后微閥關(guān)閉；旋桿上的孔數(shù)與陣列反應(yīng)腔的列數(shù)相對(duì)應(yīng)；若芯片中間相鄰排共用一個(gè)旋轉(zhuǎn)閥，芯片需要的旋桿數(shù)比陣列反應(yīng)腔排數(shù)多一個(gè)，否則芯片需要的旋桿數(shù)為陣列反應(yīng)腔2倍。
[0024]4、該檢測裝置包括⑶D相機(jī)、LED以及濾光片組成的檢測模塊，熱沉、TEC和熱管散熱器組成的溫控模塊，組合模具制備的微流控芯片；檢測模塊位于芯片的正上方，芯片下表面緊貼熱沉的溫控模塊。
[0025]5、CXD垂直接收微流控芯片芯片發(fā)出的熒光，LED位于CXD對(duì)稱的兩側(cè)，且LED激發(fā)光線與水平面成45度至75度之間的夾角，濾光片位于CCD和LED激發(fā)光的頂端。
[0026]6、溫控模塊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)利于芯片加熱和TEC散熱，成層狀分布，從上到下，分別為芯片，均勻溫度的熱沉，TEC，熱管風(fēng)冷散熱器。
[0027]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0028](I)、溫控精度高，加熱速度快，降溫速度快；
[0029](2)、檢測靈敏度高，收集熒光效率高，雜散光少；
[0030](3)、芯片的微閥密封性好，在高溫區(qū)不漏液，能經(jīng)受冷熱交替變換不變形。各反應(yīng)腔之間物理隔離，密封性好，不存在相互污染；
[0031](4)、微閥結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡單易行，操作方便，既可以做進(jìn)樣通斷控制，也可以做反應(yīng)密封腔體通道；
[0032](5)、芯片適用于擴(kuò)增序列的檢測和熔解分析檢測，芯片上反應(yīng)速度快，節(jié)約了時(shí)間；
[0033](6)、檢測裝置能實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增檢測和熔解分析的單個(gè)堿基的突變檢測；
[0034](7)、芯片上染料、探針在PCR前加入，不需要后續(xù)的分離純化，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作，而且染料的加入不影響后續(xù)的測序工作；
[0035](8)、裝置比現(xiàn)有的儀器結(jié)構(gòu)簡單易行，搭載芯片檢測既可以做PCR也可以做HRM。
[0036]本發(fā)明提供了一種既可以用于獨(dú)立的PCR檢測或者HRM檢測，也可以用于聯(lián)合的先PCR檢測緊接著無需任何改變的進(jìn)入HRM檢測的帶有旋轉(zhuǎn)閥的微流控芯片和檢測裝置，旋轉(zhuǎn)閥能同時(shí)控制微流控芯片上多個(gè)反應(yīng)腔的進(jìn)樣通斷以及腔內(nèi)反應(yīng)時(shí)通道的密封，高精度的溫控和高靈敏度的檢測可實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增、突變等多功能化檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為微流控芯片結(jié)構(gòu)圖；
[0038]圖2為旋轉(zhuǎn)桿結(jié)構(gòu)圖；
[0039]圖3為組合模具結(jié)構(gòu)圖；
[0040]圖4為檢測裝置結(jié)構(gòu)圖。
[0041]圖中，I為基片，2為玻璃基底，3為旋轉(zhuǎn)桿，4為微通道，5為反應(yīng)腔，6為微孔，7為長桿，8為手柄，9為模具立柱，10為模具橫柱，11為凸起腔體模具，12為模具殼，13為CXD模塊，14為LED模塊，15為熱管風(fēng)冷散熱器，16為微流控芯片，17為TEC加熱制冷模塊，18為熱沉銀片，19為濾光片。

【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明以下將結(jié)合附圖以及實(shí)施例作進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0043]圖1為微流控芯片，微流控芯片包括基片I，玻璃基底2，旋轉(zhuǎn)桿3，微通道4，反應(yīng)腔5。反應(yīng)腔5的列和排可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)，如圖中所示每排4個(gè)，兩排共8個(gè)。旋轉(zhuǎn)桿3如圖2所示，由微孔6，長桿7，手柄8等組成?；琁以等離子體清洗反應(yīng)腔5表面后與玻璃基底2鍵合成微流控芯片，微流控芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入旋轉(zhuǎn)桿3以構(gòu)成旋轉(zhuǎn)微閥。以手柄8旋轉(zhuǎn)至垂直于玻璃基底2，旋轉(zhuǎn)桿3上的微孔6與基片I的微通道4連通，此時(shí)可以注入試劑，可視為微閥打開。當(dāng)旋轉(zhuǎn)桿3手柄8旋轉(zhuǎn)與玻璃基底2平行，旋轉(zhuǎn)桿3微孔6與微通道4斷開，兩通道成90度互不連通，試劑無法注入到反應(yīng)腔5內(nèi)，此時(shí)可視為微閥關(guān)閉。利用此旋轉(zhuǎn)桿3可以實(shí)現(xiàn)控制多反應(yīng)腔密封。該微流控芯片適用于多種分析測試，如PCR反應(yīng)，HRM分析等。
[0044]圖3為生成微流控芯片基片I的組合模具，其包括模具立柱9，模具橫柱10，凸起腔體模具11，模具殼12。在尺寸上，構(gòu)成微閥的旋轉(zhuǎn)桿3是比組合模具上的模具橫柱10粗一點(diǎn)。凸起腔體模具11是生成與微流控芯片反應(yīng)腔5形狀大小一致的凸起，生成反應(yīng)腔5形狀的凸起的列和排可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)，如圖中所示每排4個(gè)，兩排共8個(gè)。模具橫柱10從左側(cè)穿過組合模具外殼，模具橫柱10在組合模具外殼內(nèi)側(cè)部分具有模具立柱9可穿過的通孔，模具立柱9貫穿模具橫柱10至組合模具底層連接凸起腔體模具11末端，向組合模具內(nèi)注塑固化，取下模具立柱9，取出模具橫柱10，從組合模板上脫落即可得到具有微通道4和反應(yīng)腔5的基片I。該模具簡單易行，可并排同時(shí)進(jìn)行性大批量的制造生產(chǎn)基片
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[0045]圖4為檢測裝置，該檢測裝置包括⑶D模塊13，LED模塊14，濾光片19，熱管風(fēng)冷散熱器15，微流控芯片16，TEC加熱制冷模塊17，熱沉銀片18。⑶D模塊13、LED模塊14、以及濾光片19組成檢測模塊，熱沉銀片18、TEC加熱制冷模塊17和熱管風(fēng)冷散熱器15組成的溫控模塊，檢測模塊位于微流控芯片16的正上方，微流控芯片下表面緊貼溫控模塊熱的沉銀片18。CXD模塊13垂直接收微流控芯片發(fā)出的熒光，LED模塊14位于CXD模塊13對(duì)稱的兩側(cè)，且LED激發(fā)光線與水平面成45度至75度之間的夾角，濾光片19位于CCD模塊13和LED激發(fā)光的頂端。增加飽和熒光染料的光學(xué)檢測通道，設(shè)計(jì)均勻的激發(fā)光源，使用高靈敏CCD檢測的熒光檢測系統(tǒng)，可同時(shí)檢測多個(gè)反應(yīng)腔中的熒光信號(hào)，滿足PCR擴(kuò)增檢測后的HRM分析在DNA解鏈過程熒光信號(hào)檢測的需求。本裝置適用范圍廣，調(diào)整靈活，通過更換濾光片可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)腔不同種類波長的微流控芯片檢測，數(shù)據(jù)處理都由計(jì)算機(jī)自動(dòng)完成，速度快、精度高。溫控模塊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)利于微流控芯片加熱和TEC加熱制冷模塊17散熱，成層狀分布，從上到下，分別為芯片，均勻溫度的熱沉銀片18，TEC加熱制冷模塊17，熱管風(fēng)冷散熱器15。設(shè)計(jì)在橫向和縱向均具有快速傳熱的熱沉結(jié)構(gòu)，在提高升降溫速率的同時(shí)提升微流控芯片反應(yīng)腔的溫度均勻性，實(shí)現(xiàn)高分辨率熔解曲線分析中堿基對(duì)突變區(qū)分所需溫控精度±0.1°C。通過切換控制及非線性控制器，提高溫度的跟蹤速度；采用預(yù)測控制策略以避免溫控的超調(diào)；在控制器設(shè)計(jì)中將充分考慮魯棒性，有效的抵抗對(duì)外界噪聲干擾與系統(tǒng)參數(shù)的波動(dòng)，實(shí)現(xiàn)溫控精度優(yōu)于0.1°C。
[0046]本發(fā)明的操作只需把微流控芯片上的手柄8旋轉(zhuǎn)至垂直玻璃面，然后將要反應(yīng)的PCR試劑或者HRM分析的試劑、樣品注入到微流控芯片反應(yīng)腔5中。試劑注入的方式可多樣化，直接移液槍注入，微管道接頭插入注入等。當(dāng)腔體注滿時(shí)，輕輕旋轉(zhuǎn)手柄8至平行玻璃基底2，最后將其放置到溫控平臺(tái)上。啟動(dòng)控制軟件，整個(gè)裝置會(huì)根據(jù)設(shè)置好的程序自動(dòng)完成，操作簡單，不需要專業(yè)的技術(shù)人員。
[0047]實(shí)例I
[0048]組合模具腔體尺寸為33mmX32mmX7mm,凸起的反應(yīng)腔體體積為12uL,雙排結(jié)構(gòu)，每排4個(gè),共8個(gè)反應(yīng)腔,通道為0.4mm,模具橫柱直徑為Imm,模具橫柱上的孔為0.3mm,模具立柱的直徑為0.3mm,以PDMS膠水注入模具中，加熱固化，取下模具立柱，取出模具橫柱，從模板上脫落即可得到具有微通道和反應(yīng)腔體的基片。PDMS基片與50mmX40mm的玻璃基底通過等離子清洗基片進(jìn)行表面改性鍵合成微流控芯片。芯片的模具橫柱孔中插入1.2_的帶有手柄的旋轉(zhuǎn)長桿，模具橫柱上的微孔為0.3mm，微孔與模具立柱生成的通道對(duì)應(yīng)。此時(shí)微流控芯片進(jìn)行生物兼容性處理，高溫滅菌等相關(guān)PCR反應(yīng)前對(duì)芯片要求的處理。以TOC-18為例，濃度為109COpieS/uL，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 6個(gè)反應(yīng)腔里注滿了陽性樣本的試劑，2個(gè)反應(yīng)腔里注滿了陰性樣本的試劑。旋轉(zhuǎn)閥關(guān)閉后，以相同的條件在同一塊芯片上進(jìn)行了 PCR反應(yīng)和HRM檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6個(gè)陽性樣本均獲得了明顯的擴(kuò)增曲線，有相同的Ct值
5.7，熔解曲線有單一的熔解峰，統(tǒng)一的熔解溫度Tm值86.8。2個(gè)陰性樣本沒有擴(kuò)增，沒有檢測到信號(hào)。結(jié)果表明了腔體之間物理隔離較好，沒有相互污染，體現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)閥的密封性較好。
[0049]實(shí)例2
[0050]組合模具腔體尺寸為22mmX25mmX7mm,凸起的反應(yīng)腔體體積為20uL,單排結(jié)構(gòu)，2個(gè)反應(yīng)腔，通道為0.4mm，模具橫柱直徑為1mm，模具橫柱上的孔為0.3mm，模具立柱的直徑為0.3mm,以PDMS膠水注入模具中，加熱固化，取下模具立柱，取出模具橫柱，從模板上脫落即可得到具有微通道和反應(yīng)腔體的基片。PDMS基片與25mmX30mm的玻璃基底通過等離子清洗基片進(jìn)行表面改性鍵合成微流控芯片。芯片的模具橫柱孔中插入1.2mm的帶有手柄的旋轉(zhuǎn)長桿，模具橫柱上的微孔為0.3mm，微孔與模具立柱生成的通道對(duì)應(yīng)。此時(shí)微流控芯片進(jìn)行生物兼容性處理，高溫滅菌等相關(guān)PCR反應(yīng)前對(duì)芯片要求的處理。以擬南芥的VTC-2基因突變檢測為例，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 I個(gè)反應(yīng)腔里注滿了正常樣本的試劑，I個(gè)反應(yīng)腔里注滿了突變樣本的試劑。旋轉(zhuǎn)閥關(guān)閉后，以相同的條件在同一塊芯片上進(jìn)行了 PCR反應(yīng)和HRM檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2個(gè)樣本均獲得了明顯的擴(kuò)增曲線，有相同的Ct值，熔解曲線有2個(gè)熔解峰，熔解溫度Tm值為83.8°C和83.9°C，相差0.1°C。結(jié)果表明了腔體之間物理隔離較好，沒有相互污染，體現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)閥的密封性較好。熔解溫度的明顯分辨體現(xiàn)了檢測裝置的檢測靈敏度高，溫控精度高。
【權(quán)利要求】
1.一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:該微流控芯片包括基片(I)，玻璃基底(2)，旋轉(zhuǎn)桿(3)，微通道(4)和反應(yīng)腔(5)，其中，旋轉(zhuǎn)桿(3)包括微孔(6)，長桿(7)和手柄(8);基片(I)以等離子體清洗反應(yīng)腔(5)表面后與玻璃基底(2)鍵合成微流控芯片，微流控芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入旋轉(zhuǎn)桿(3)以構(gòu)成該微流控芯片旋轉(zhuǎn)微閥，以手柄⑶旋轉(zhuǎn)至垂直于玻璃基底(2)，旋轉(zhuǎn)桿(3)上的微孔(6)與基片⑴的微通道(4)連通，此時(shí)可以注入試劑，可視為旋轉(zhuǎn)微閥打開；當(dāng)旋轉(zhuǎn)桿(3)手柄(8)旋轉(zhuǎn)與玻璃基底(2)平行，旋轉(zhuǎn)桿(3)的微孔(6)與微通道(4)斷開，兩通道成90度互不連通，試劑無法注入到反應(yīng)腔(5)內(nèi)，此時(shí)可視為微閥關(guān)閉；該微流控芯片(16)放置于CDD模塊(13)、LED模塊(14)以及濾光片(19)組成的檢測模塊下方，貼著熱沉銀片(18)、TEC加熱制冷模塊(17)和熱管風(fēng)冷散熱器(15)組成的溫控模塊進(jìn)行PCR或HRM檢測分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:反應(yīng)腔(5)可以是單排，也可以是多排，利用此旋轉(zhuǎn)桿(3)可以實(shí)現(xiàn)控制多反應(yīng)腔密封。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:通過微管道和反應(yīng)腔基板構(gòu)成組合模具，通過注塑法生成微流控基片，以等離子體清洗反應(yīng)腔表面后與玻璃基底鍵合成微流控芯片，微流控芯片對(duì)外的通道中心處，橫嵌入帶有手柄(8)和微孔￠)的旋轉(zhuǎn)桿(3)構(gòu)成旋轉(zhuǎn)微閥，以手柄(8)旋轉(zhuǎn)使微孔(6)和微通道(4)組成的孔道斷開控制多反應(yīng)腔(5)密封。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:生成該微流控芯片的基片(I)的組合模具包括模具殼(12)、模具橫柱(10)和模具立柱(9);模板上表面具有微流控芯片反應(yīng)腔(5)形狀的凸起陣列腔體(11)，凸起陣列腔體(11)的列和排可以是單個(gè)，也可以是多個(gè)；模具橫柱(10)中部具有模具立柱(9)可穿過的微孔(6)，模具立柱(9)貫穿芯片上下層，生成注樣的進(jìn)樣口 ；模具注塑固化，取下模具立柱(9)，取出模具橫柱(10)，從模板上脫落即可；制作的微流控芯片的基片(1)，采用等離子清洗基片⑴和玻璃基底⑵的表面改性進(jìn)行鍵合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:注塑生成的微流控芯片的玻璃基底(2)材料可以是PDMS，PC, PMMA或PS聚合物材料，旋轉(zhuǎn)桿的材料為鐵、銅、鋁固態(tài)金屬或者硬質(zhì)塑料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片，其特征在于:手柄(8) —端露在外面，帶微孔(6)的長桿(7)嵌入芯片；微孔(6)與反應(yīng)腔對(duì)外通道在手柄(8)垂直芯片時(shí)是一致連通的，旋轉(zhuǎn)90度后微閥關(guān)閉，微閥可以控制進(jìn)樣的通斷，也可以做腔內(nèi)反應(yīng)的通道密封；長桿(7)上的微孔(6)數(shù)與陣列反應(yīng)腔(5)的列數(shù)相對(duì)應(yīng)；若芯片中間相鄰排共用一個(gè)旋轉(zhuǎn)閥，芯片需要的旋轉(zhuǎn)桿數(shù)比陣列反應(yīng)腔排數(shù)多一個(gè)，否則芯片需要的旋轉(zhuǎn)桿數(shù)為陣列反應(yīng)腔2倍。
7.一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片的檢測裝置，其特征在于:該檢測裝置包括檢測模塊、溫控模塊和權(quán)利要求1所述的微流控芯片；其中⑶D模塊(13)、LED模塊(14)以及濾光片(19)組成的檢測模塊；熱沉銀片(18)、TEC加熱制冷模塊(17)和熱管風(fēng)冷散熱器(15)組成的溫控模塊；檢測模塊位于所述的微流控芯片(16)的正上方，所述的微流控芯片(16)下表面緊貼熱沉(18)的溫控模塊。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片的的檢測裝置，其特征在于:CCD模塊(13)垂直接收從所述的微流控芯片(16)發(fā)出的熒光，LED模塊(14)位于CXD模塊(13)對(duì)稱的兩側(cè)，且LED激發(fā)光線與水平面成45度至75度之間的夾角，濾光片(19)位于CCD模塊(13)和LED激發(fā)光的頂端。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種適用于PCR或HRM檢測分析的微流控芯片的檢測裝置，其特征在于:溫控模塊的結(jié)構(gòu)利于微流控芯片(16)加熱和TEC加熱制冷模塊(17)散熱，成層狀分布，從上到下，分別為所述的微流控芯片(16)，均勻溫度的熱沉銀片(18)，TEC加熱制冷模塊(17)，熱管風(fēng)冷散熱器(15)。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104293649SQ201410528422
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】趙樹彌, 朱靈, 鄧國慶, 王貽坤, 朱燦燦, 張龍, 李志剛, 劉勇, 王安 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院, 銅陵易康達(dá)光電科技有限公司