一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，主要對(duì)真姬菇栽培廢料中殘留的木聚糖酶進(jìn)行浸提條件的優(yōu)化，通過(guò)硫酸銨沉淀、透析、SephadexG-100葡聚糖凝膠層析和DEAEC-52離子交換層析等方法對(duì)纖維素酶進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，已達(dá)到電泳純。從金針菇栽培廢料浸提液中提取木聚糖酶，對(duì)其進(jìn)行有效的分離純化，深入地研究木聚糖酶的結(jié)構(gòu)和功能，為木聚糖酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)的參考依據(jù)。
【專利說(shuō)明】一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌栽培廢料生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從金針菇栽培廢料中分離 純化木聚糖酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，我國(guó)食用菌栽培廢料資源巨大，長(zhǎng)期以來(lái)沒(méi)有得到有效的利用，造成了惡劣 的環(huán)境影響和有機(jī)資源的巨大浪費(fèi)。食用菌栽培廢料中含有大量殘余的胞外酶，這些胞外 酶具有非常廣闊的工業(yè)利用價(jià)值和應(yīng)用前景，真姬菇、金針菇是目前工廠化生產(chǎn)主要品種， 廢菌袋來(lái)源穩(wěn)定，為工廠化提取纖維素酶、木聚糖酶提供了穩(wěn)定原料來(lái)源，通過(guò)科學(xué)有效的 方法利用這些資源，對(duì)解決我國(guó)能源短缺和環(huán)境污染問(wèn)題具有重要的意義。
[0003] 金針菇含有木聚糖酶等多種胞外酶，而金針菇是目前工廠化生產(chǎn)主要品種之一， 廢菌袋來(lái)源穩(wěn)定，為工廠化提取木聚糖酶提供了穩(wěn)定原料來(lái)源。金針菇栽培廢料浸提液中 殘留有木聚糖酶等多種胞外酶，需對(duì)其進(jìn)行有效的分離純化，才能更深入地研究木聚糖酶 的結(jié)構(gòu)和功能，為木聚糖酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)的參考依據(jù)。
[0004] 據(jù)研究表明，食用菌栽培廢料中含有大量殘余的胞外酶，這些殘留的胞外酶在造 紙業(yè)、飼料業(yè)等工業(yè)上有非常廣闊的利用價(jià)值和應(yīng)用前景，利用食用菌采收后的廢菌袋提 取木聚糖酶，在工藝上可節(jié)省微生物培養(yǎng)工序，節(jié)省酶制劑廠的辦廠投入，降低生產(chǎn)成本， 拓寬食用菌產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，提高生產(chǎn)附加值，變廢為寶。如何科學(xué)有效地開(kāi)發(fā)利用這些資 源，對(duì)于解決我國(guó)的能源短缺和環(huán)境污染及食用菌可持續(xù)發(fā)展等問(wèn)題都具有極為重要的意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，從金 針菇栽培廢料浸提液中提取木聚糖酶等多種胞外酶，對(duì)其進(jìn)行有效的分離純化，深入地研 究木聚糖酶的結(jié)構(gòu)和功能，為木聚糖酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)的參考依據(jù)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，通過(guò)硫酸銨沉淀、透析除鹽、冷凍 干燥、凝膠層析和離子交換層析方法對(duì)木聚糖酶進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，最 終獲得木聚糖酶。
[0007] 其具體方法包括以下步驟： (1) 粗酶液的制備：金針菇栽培廢料粉碎混勻，按1:3加入緩沖液，混勻，室溫靜置3h ; 紗布過(guò)濾,4°C下lOOOOr/min離心20min，取上清即為粗酶液； (2) 硫酸銨沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸銨進(jìn)行一次硫酸銨沉淀，80wt. %硫酸銨進(jìn) 行二次硫酸銨沉淀，4°C鹽析10_15h，4°C，10000r/min離心20min，分別收集上清和沉淀，沉 淀用緩沖液溶解至原體積，540nm波長(zhǎng)處測(cè)定酶活； (3) 透析：粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，IOml緩沖液至完全溶解，在同樣的緩沖液，4°C，磁 力攪拌器上透析；每隔2h更換一次透析液，直至向透析液中加入0.1 mol/L BaCl2溶液，檢 測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生為止；收集酶液，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清；冷凍干燥，l-2mL 緩沖液將可溶蛋白溶解，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清； (4) 凝膠層析：緩沖液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析，流速為I. 5mL/min，直至 記錄儀上的基準(zhǔn)線值恒定，停止平衡；取2ml的透析純化后酶液上柱，用緩沖液洗脫，收集 各洗脫峰，檢測(cè)各管酶活，合并有酶活管，冷凍濃縮； (5) 離子交換層析：用Tris-HCl緩沖液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡緩沖 液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度分別為0M、 0. 2M和0. 8M的平衡緩沖液進(jìn)行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫峰；檢測(cè)各洗脫峰的酶活，收 集，冷凍干燥； (6) 酶純度的鑒定：分離膠的濃度采用濃度為12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl緩沖 液，用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。
[0008] 步驟（1)- (4)中的緩沖液為0· 02M ρΗ6· 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；步驟（5) 所述的Tris-HCl緩沖液為0. 02Μ ρΗ7. 0 Tris-HCl平衡緩沖液。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1)對(duì)金針菇栽培廢料浸提條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試 驗(yàn)，結(jié)果表明：金針菇栽培廢料中木聚糖酶的最佳浸提條件為ρΗ6.0、0.02 M ρΗ6.0磷酸氫 二鈉-檸檬酸緩沖液，浸提溫度25°C、浸提時(shí)間為3h、料液比為lg/3mL。金針菇栽培廢料中 木聚糖酶浸提液最終酶活達(dá)到69. 6U，酶活有了顯著的提高，達(dá)到了優(yōu)化的效果。
[0010] (2)金針燕栽培廢料經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀鹽析、透析除鹽、Sephadex G-100葡聚糖凝 膠層析、DEAE C-52離子交換層析分離純化后，SDS-PAGE鑒定已達(dá)到電泳純。純化后的木聚 糖酶比活達(dá)到946. 67U/mg，純化倍數(shù)為12. 74,回收率為3. 08%。
[0011] (3)分離獲得的純化木聚糖酶，蛋白分子大小約為37. 8kDa。此木聚糖酶的最適反 應(yīng)溫度為50°C，溫度上升到80°C及以上時(shí)，酶活力仍有74%，具有較廣的耐高溫域。該酶的 最適pH值為pH6. 0, pH值在3. (Γ8. 0的范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，具有較廣的酸堿穩(wěn)定性。
[0012] (4)不同金屬離子對(duì)木聚糖酶的影響中，Na+在低濃度下對(duì)此木聚糖酶有輕微的促 進(jìn)作用，隨著離子濃度的提高，表現(xiàn)出輕微的抑制作用；Fe 2+、Zn2+對(duì)其具有激活作用；Ca2+、 Μη2+、K+對(duì)其具有促進(jìn)作用；Mg2+、Cu2+、Fe 3+對(duì)其具有強(qiáng)烈抑制作用。
[0013] (5)以Xylanase作為底物進(jìn)行此木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)研究表明，酶促反應(yīng)符合米氏 方程。^^^為15.43以8/11117 /111；[11，1(1]1為9.6111^/1]11^，￥1]^1/1(1]1為1.61。說(shuō)明此底物具有較 高的親和力。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1木聚糖酶的Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析色譜圖。圖中1、2表示色譜峰。
[0015] 圖2木聚糖酶的DEAE C-52陰離子交換層析色譜圖。圖中1、2、3表示色譜峰。
[0016] 圖3 SDS-PAGE電泳圖譜，其中M :Marker ; I :硫酸銨透析液；II :Sephadex G-100凝膠層析濃縮酶液；III :DEAE C-52離子交換層析濃縮酶液。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 1木聚糖酶的浸提優(yōu)化 1. 1單因素優(yōu)化 (1)浸提液PH值的優(yōu)化 木聚糖酶浸提液pH值的優(yōu)化，選擇pH值在4. (TlO. O范圍，每0. 4設(shè)一個(gè)梯度，共設(shè)16 個(gè)梯度。每組加入相同質(zhì)量的碾碎后攪拌均勻的栽培廢料，分別加入不同PH值浸提液，混 勻并常溫靜置，每個(gè)梯度作3個(gè)平行。紗布過(guò)濾，4°C，10000r/min離心20min，取上清。測(cè) 定各組浸提液的木聚糖酶活大小，結(jié)果表明：從PH4. 0開(kāi)始，木聚糖酶活逐漸上升，當(dāng)浸提 液的pH值為6. 0時(shí)，木聚糖酶活達(dá)到最高，約有61. 77U。之后，木聚糖酶活隨pH值的增大 而逐漸減小。說(shuō)明木聚糖酶在pH6. 0時(shí)具有最高的酶活，因此采用pH6. 0作為金針菇栽培 廢料中木聚糖酶的最佳浸提PH值。
[0018] (2)浸提緩沖液的優(yōu)化 浸提緩沖液選用四組溶液：去離子水、0.02 M pH6.0乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.02 M PH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、0.02 M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。用適當(dāng)?shù)牧?液比浸泡，混勻，常溫靜置。紗布過(guò)濾，4°C，10000r/min離心20min，取上清，測(cè)定各浸提液 的木聚糖酶活。結(jié)果表明（，浸提緩沖液選用去離子水時(shí)，酶活最小，選用磷酸氫二鈉-檸檬 酸緩沖液可達(dá)到最大的酶活，說(shuō)明木聚糖酶在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中具有最高的酶 活力，因此采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液作為金針菇栽培廢料中木聚糖酶的最佳浸提緩 沖液。
[0019] 正交試驗(yàn)優(yōu)化 木聚糖酶浸提條件優(yōu)化的L16 (44)正交試驗(yàn)。經(jīng)Minitab 16.0軟件分析，結(jié)果表明： 以測(cè)定的木聚糖酶活為指標(biāo)，浸提溫度的極差最大，表明浸提溫度對(duì)酶活力大小影響最大。 各因素對(duì)木聚糖酶活的影響程度依次為A (浸提溫度）>C (料液比）>B (浸提時(shí)間）且A (浸 提溫度）因素對(duì)木聚糖酶活力的影響達(dá)到了極顯著差異（P〈〇. 01)(表3-2)。由此分析，此 優(yōu)化反應(yīng)的最佳組合為A3B2C2,即浸提溫度25°C、浸提時(shí)間為3h、料液比為lg/3mL。
[0020] 按照選取的木聚糖酶浸提條件優(yōu)化工藝條件（A3B2C2)制備3批樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明浸提液木聚糖酶活達(dá)到69. 6U，明顯優(yōu)于正交試驗(yàn)的其他組，可以驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果， 木聚糖酶活有了顯著的提高，達(dá)到預(yù)期的效果。
[0021] 硫酸銨沉淀 分別取粗酶液10mL，加入硫酸銨至飽和度為20%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%，4°C，鹽析；540nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定上清和沉淀的酶活，結(jié)果可以看出，硫 酸銨濃度在20%時(shí)，上清酶活最大，硫酸銨的濃度從25%起，上清酶活逐漸減小，至硫酸銨濃 度為80%時(shí)，上清酶活最小。硫酸銨濃度在20%時(shí)，沉淀酶活最小，硫酸銨的濃度從25%開(kāi) 始，沉淀酶活逐漸增高，至硫酸銨濃度為80%時(shí)，沉淀酶活最大。因此采用20%硫酸銨進(jìn)行 一次硫酸銨沉淀，80%硫酸銨進(jìn)行二次硫酸銨沉淀。
[0022] 葡聚糖凝膠層析 用0. 02M pH6. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液平衡S印hadex G-100,取適量的透析純化 后酶液上柱，用緩沖液洗脫，收集各洗脫峰。結(jié)果如圖2,有兩個(gè)洗脫峰，檢測(cè)各管酶活，發(fā)現(xiàn) 第二個(gè)洗脫峰含有較高木聚糖酶活，將這些管收集冷凍干燥后用于下一步分離純化。
[0023] 離子交換層析 4. I DEAE C-52陰離子交換層析緩沖液pH的確定 取8支小試管，分別裝入DEAE C-52 200mg，進(jìn)行不同的pH值下（3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、 7. 0、8. 0、9. 0、10. 0) DEAE C-52陰離子交換層析對(duì)木聚糖酶的最佳吸附量實(shí)驗(yàn)。每組做三 個(gè)平行，結(jié)果顯示，木聚糖酶活隨著PH值增大而逐漸增大，至pH7. 0后酶活開(kāi)始逐漸下降。 因此，確定pH7. 0 Tris-HCl為DEAE C-52陰離子交換最適層析緩沖液。
[0024] 陰離子交換層析洗脫鹽濃度的確定 用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 緩沖液平衡 DEAE C-52,取適量的用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 平衡緩沖液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度 分別為0M、0. 2M、0. 4M、0. 6M、0. 8M和I. OM的平衡緩沖液進(jìn)行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫 峰。檢測(cè)洗脫管酶活，不同NaCl濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，不同的蛋白質(zhì)組分在不同的 階段被洗脫出來(lái)。經(jīng)檢測(cè)，含有木聚糖酶活蛋白主要集中在第五個(gè)峰，即約在NaCl濃度為 0.8mol/L洗脫時(shí)的色譜峰。
[0025] 陰離子交換層析結(jié)果 取與3. 3. 4. 2中同樣體積的上樣酶液，采用含有NaCl濃度分別為0M、0. 2M和0. 8M的 緩沖液梯度洗脫，對(duì)目標(biāo)蛋白所在的峰（〇.8mol/LNaCl洗脫的蛋白峰）進(jìn)行分管收集，結(jié)果 如圖2。
[0026] 檢測(cè)各管酶活，發(fā)現(xiàn)第三個(gè)洗脫峰含有較高的木聚糖酶活，將這些管合并為一管， 進(jìn)行冷凍干燥。
[0027] 木聚糖酶純度的鑒定 將分離純化后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定， 純化后酶液的蛋白是單一條帶，則說(shuō)明該純化后的木聚糖酶溶液已達(dá)到電泳純。
[0028] 6分離純化結(jié)果匯總 粗酶液經(jīng)離心、收集上清、硫酸銨沉淀透析、Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析、DEAE C-52離子交換層析，各步驟分離純化結(jié)果如表1。
[0029] 表1木聚糖酶的分離純化匯總

【權(quán)利要求】
1. 一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，其特征在于：通過(guò)硫酸銨 沉淀、透析除鹽、冷凍干燥、凝膠層析和離子交換層析方法對(duì)木聚糖酶進(jìn)行分離純化， SDS-PAGE鑒定蛋白純度，最終獲得木聚糖酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，其特征 在于：其具體方法包括以下步驟： (1) 粗酶液的制備：金針菇栽培廢料粉碎混勻，按1:3加入緩沖液，混勻，室溫靜置3h ; 紗布過(guò)濾,4°C下lOOOOr/min離心20min，取上清即為粗酶液； (2) 硫酸銨沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸銨進(jìn)行一次硫酸銨沉淀，80wt. %硫酸銨進(jìn) 行二次硫酸銨沉淀，4°C鹽析10_15h，4°C，10000r/min離心20min，分別收集上清和沉淀，沉 淀用緩沖液溶解至原體積，540nm波長(zhǎng)處測(cè)定酶活； (3) 透析：粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，IOml緩沖液至完全溶解，在同樣的緩沖液，4°C，磁 力攪拌器上透析；每隔2h更換一次透析液，直至向透析液中加入0.1 mol/L BaCl2溶液，檢 測(cè)無(wú)白色沉淀產(chǎn)生為止；收集酶液，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清；冷凍干燥，l-2mL 緩沖液將可溶蛋白溶解，4°C，10000r/min離心20min，取上清； (4) 凝膠層析：緩沖液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析，流速為I. 5mL/min，直至 記錄儀上的基準(zhǔn)線值恒定，停止平衡；取2ml的透析純化后酶液上柱，用緩沖液洗脫，收集 各洗脫峰，檢測(cè)各管酶活，合并有酶活管，冷凍濃縮； (5) 離子交換層析：用Tris-HCl緩沖液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡緩沖 液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度分別為0M、 0. 2M和0. 8M的平衡緩沖液進(jìn)行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫峰；檢測(cè)各洗脫峰的酶活，收 集，冷凍干燥； (6) 酶純度的鑒定：分離膠的濃度采用濃度為12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl緩沖 液，用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從金針菇栽培廢料中分離純化木聚糖酶的方法，其特征 在于：步驟（1) - (4)中的緩沖液為0. 02M pH6. 0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；步驟（5)所 述的Tris-HCl緩沖液為0. 02M pH7. 0 Tris-HCl平衡緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104312999SQ201410524533
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】楊云龍, 胡開(kāi)輝, 黃彩梅, 萬(wàn)春和 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)