一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，主要對真姬菇栽培廢料中殘留的纖維素酶進行浸提條件的優(yōu)化，通過硫酸銨沉淀、透析、SephadexG-100葡聚糖凝膠層析和DEAEC-52離子交換層析等方法對纖維素酶進行分離純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，已達到電泳純，分子量約為27.8KDa，酶比活達到1121.82U/mg，純化倍數(shù)為12.13，最適作用溫度和pH值分別為50℃和pH4.8，具有一定的耐酸堿特性，旨在為纖維素酶的應(yīng)用提供更為科學的依據(jù)。此酶在造紙業(yè)和飼料業(yè)中具有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌栽培廢料生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從真姬菇栽培廢料中提 取纖維素酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 真菌類的纖維素酶系，主要包括有外切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶 β-葡聚糖苷酶，其中以CMC酶代表的內(nèi)切β-1，4-葡萄糖酶最為常見。真姬菇栽培廢料中 富含有纖維素酶等多種胞外酶，而真姬菇是目前工廠化生產(chǎn)主要品種之一，廢菌袋來源穩(wěn) 定，為工廠化提取纖維素酶提供了穩(wěn)定原料來源，在市場上有著巨大的應(yīng)用前景。
[0003] 纖維素酶是重要的水解纖維素類、半纖維素類物質(zhì)的酶，在食品、造紙、飼料等許 多工業(yè)領(lǐng)域上有非常廣泛地應(yīng)用價值。我國的食用菌栽培廢料數(shù)量巨大，長期以來因為沒 有得到有效的利用，對環(huán)境和有機資源造成了惡劣的影響和巨大的浪費。據(jù)研究表明，食用 菌栽培廢料中含有大量殘余的胞外酶，這些殘留的胞外酶在造紙業(yè)、飼料業(yè)等工業(yè)上有非 常廣闊的利用價值和應(yīng)用前景，利用食用菌采收后的廢菌袋提取纖維素酶，在工藝上可節(jié) 省微生物培養(yǎng)工序，節(jié)省酶制劑廠的辦廠投入，降低生產(chǎn)成本，拓寬食用菌產(chǎn)業(yè)鏈的延伸， 提高生產(chǎn)附加值，變廢為寶。如何科學有效地開發(fā)利用這些資源，對于解決我國的能源短缺 和環(huán)境污染及食用菌可持續(xù)發(fā)展等問題都具有極為重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，我國的食 用菌栽培廢料數(shù)量巨大，長期以來因為沒有得到有效的利用，對環(huán)境和有機資源造成了惡 劣的影響和巨大的浪費。對于解決我國的能源短缺和環(huán)境污染及食用菌可持續(xù)發(fā)展等問題 都具有極為重要的意義。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，所述方法包括：通過硫酸銨沉淀、透 析、凝膠層析和離子交換層析對纖維素酶進行分離純化，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，最終獲得 纖維素酶。
[0006] 所述方法具體包括如下： (1) 粗酶液的制備：真姬菇栽培廢料粉碎混勻，按1:3加入緩沖液，混勻，室溫靜置3h ; 紗布過濾,4°C下lOOOOr/min離心20min，取上清即為粗酶液； (2) 硫酸銨沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸銨進行一次硫酸銨沉淀，80wt. %硫酸銨進 行二次硫酸銨沉淀，4°C鹽析10_15h，4°C，10000r/min離心20min，分別收集上清和沉淀，沉 淀用緩沖液溶解至原體積，540nm波長處測定酶活； (3) 透析：粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，IOml緩沖液至完全溶解，在同樣的緩沖液，4°C，磁 力攪拌器上透析；每隔2h更換一次透析液，直至向透析液中加入0. lmol/L BaCl2溶液，檢 測無白色沉淀產(chǎn)生為止；收集酶液，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清；冷凍干燥，少量緩 沖液將可溶蛋白溶解，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清； (4) 凝膠層析：緩沖液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析，流速為I. 5mL/min，直至 記錄儀上的基準線值恒定，停止平衡；取2ml的透析純化后酶液上柱，用緩沖液洗脫，收集 各洗脫峰，檢測各管酶活，合并有酶活管，冷凍濃縮； (5) 離子交換層析：用Tris-HCl緩沖液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡緩沖 液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度分別為0M、 0. IM和IM的平衡緩沖液進行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫峰；檢測各洗脫峰的酶活，收集， 冷凍干燥； (6) 酶純度的鑒定：分離膠的濃度采用濃度為12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl緩沖 液，用考馬斯亮藍R-250進行染色。
[0007] 步驟（1)- (4)中的緩沖液為0· 02M ρΗ4· 8乙酸-乙酸鈉緩沖液；步驟（5)所述的 Tris-HCl緩沖液為0. 02Μ pH7. 0 Tris-HCl平衡緩沖液。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： (1)真姬菇栽培廢料中纖維素酶的最佳條件為：ρΗ4. 8,0. 02 M ρΗ4. 8乙酸-乙酸鈉緩 沖液，浸提溫度25°C、浸提時間為3h、料液比為lg/3mL。真姬菇栽培廢料中纖維素酶浸提液 最終酶活達到107. 36U，酶活有了顯著的提高，達到了優(yōu)化的效果。
[0009] (2)真姬菇栽培廢料酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析除鹽、冷凍干燥、S印hadex G-100葡 聚糖凝膠層析、透析除鹽、冷凍干燥、DEAE C-52離子交換層析等分離純化后，SDS-PAGE鑒 定已達到電泳純。純化后的纖維素酶比活達到1121. 82U/mg，純化倍數(shù)為12. 13,回收率為 2. 64%。
[0010] (3)分離純化獲得的纖維素酶蛋白分子大小約為27. 8kDa。該酶的最適作用溫度 為501：，在20?501：內(nèi)酶活較穩(wěn)定。該酶最適作用？!1值為？!14.8，？!1值在3.0?10.0的范圍 內(nèi)相對穩(wěn)定，具有較廣的酸堿穩(wěn)定性。
[0011] (4)不同金屬離子對纖維素酶的影響中，Na+、K+對此纖維素酶有輕微的促進作用； Mg2+、Mn2+有激活作用；Fe2+、Ca2+在低濃度下有促進作用，隨著濃度的提高，對纖維素酶的抑 制作用增強；Zn 2+、Cu2+、Fe3+具有強烈抑制作用。
[0012] (5)以CMC-Na作為底物進行此纖維素酶的動力學的研究表明，此底物的酶促反 應(yīng)，符合米氏方程。Vmax 為 24. 45 yg/mL/min，Km 為 9. 77 mg/mL，Vmax/Km 為 2. 50。說明 此底物具有較高的親和力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1纖維素酶的Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析層析色譜圖。其中NaCl concertration為氯化鈉梯度。
[0014] 圖2纖維素酶的DEAE C-52陰離子交換層析色譜圖。其中NaCl concertration 為氯化鈉梯度。
[0015] 圖3纖維素酶的DEAE C-52陰離子交換層析色譜圖。其中NaCl concertration 為氯化鈉梯度。
[0016] 圖 4 SDS-PAGE 電泳圖譜。

【具體實施方式】
[0017] 實施例1 1纖維素酶的浸提優(yōu)化 1. 1單因素優(yōu)化 (1)浸提液PH值的優(yōu)化 纖維素酶浸提液PH值的優(yōu)化，選擇pH值在4. (Γ10. 0范圍，每0. 4設(shè)一個梯度，共設(shè) 16個梯度。每組中加入相同質(zhì)量的碾碎后攪拌均勻的栽培廢料，分別加入不同pH值浸提 液，攪拌并于常溫下靜置，每個梯度作3個平行。紗布過濾，4°C，10000r/min離心20min，取 上清。測定各組浸提液的纖維素酶活，結(jié)果表明，從PH4. 0開始，纖維素酶活逐漸上升，在 pH4. 8時，纖維素酶活達到最高值，約84. 06U。之后，纖維素酶活大小隨pH值的增大而逐漸 減小。說明纖維素酶在PH4. 8時具有最高的酶活，因此采用pH4. 8作為真姬菇栽培廢料中 纖維素酶的最佳浸提PH值。
[0018] (2)浸提緩沖液的優(yōu)化 浸提緩沖液選用四組溶液：去離子水、0.02 M pH4. 8乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.02 M PH4. 8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、0.02 M pH4. 8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。用適當?shù)牧?液比浸泡，混勻并常溫下靜置。紗布過濾，4°C，lOOOOr/min離心20min，取上清，測定各浸提 液的纖維素酶活大小，結(jié)果表明，浸提緩沖液選用去離子水時，酶活最小，選用乙酸-乙酸 鈉緩沖液酶活最大，說明纖維素酶在乙酸-乙酸鈉緩沖液中具有最高的酶活，因此采用乙 酸-乙酸鈉緩沖液作為真姬菇栽培廢料中纖維素酶的最佳浸提緩沖液。
[0019] 1.2正交試驗優(yōu)化 纖維素酶浸提條件優(yōu)化的L16 (44)正交試驗結(jié)果。經(jīng)Minitab 16.0軟件分析，結(jié)果表 明：以測定的纖維素酶活為指標，浸提溫度的極差最大，表明浸提溫度對酶活力大小影響最 大。各因素對纖維素酶活的影響程度依次為A (浸提溫度）>C (料液比）>B (浸提時間），且 A (浸提溫度）因素對纖維素酶活的影響達到了極顯著差異（p〈0. 01)(表2-2)。由此分析， 此優(yōu)化反應(yīng)的最佳組合為A3B2C2,即浸提溫度25°C、浸提時間為3h、料液比為lg/3mL。
[0020] 按照選取的纖維素酶浸提條件優(yōu)化工藝條件（A3B2C2)制備3批樣品，實驗結(jié)果表 明：浸提液纖維素酶活達到107. 36U，明顯優(yōu)于正交試驗的其他組，可以驗證正交試驗的結(jié) 果，酶活有了顯著的提高，達到預(yù)期的效果。
[0021] 2硫酸銨沉淀 分別取粗酶液10mL，加入硫酸銨飽和度為20%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%進行鹽析，540nm波長處分別測定上清和沉淀的酶活。結(jié)果可以看出，硫酸銨 濃度在20%時，上清酶活最大，硫酸銨的濃度從25%起，上清酶活逐漸減小，至硫酸銨濃度為 75%時，上清酶活最小。硫酸銨濃度在20%時，沉淀酶活幾乎為0,硫酸銨的濃度從25%開始， 沉淀酶活逐漸增高，至硫酸銨濃度為75%時，沉淀酶活最大。因此采用20%硫酸銨進行一次 硫酸銨沉淀，75%硫酸銨濃度進行二次硫酸銨沉淀。
[0022] 3 Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析 用0.02M pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析，流速為 I. 5mL/min，直至記錄儀上的基準線值恒定，停止平衡。取適量的透析純化后酶液上柱，用 0. 02M pH4. 8乙酸-乙酸鈉緩沖液洗脫，收集各洗脫峰，結(jié)果如圖1。將硫酸銨鹽析液經(jīng) S印hadex G-IOO葡聚糖凝膠層析(見圖1)，主要有三個洗脫峰，檢測各管酶活，發(fā)現(xiàn)第三個 洗脫峰含有較高纖維素酶活，將這些管收集冷凍干燥后用于下一步分離純化。
[0023] 4 DEAE C-52離子交換層析 4. I DEAE C-52陰離子交換層析緩沖液pH的確定 取8支小試管，分別裝入DEAE C-52 200mg，進行不同的pH值下（3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、 7. 0、8. 0、9. 0、10. 0)DEAE C-52陰離子交換層析對纖維素酶的最佳吸附量實驗。每組做三個 平行。結(jié)果顯示，pH值在3. (Γ4. 0時，酶活很小，酶活隨著pH值增大而逐漸增大，至pH7. 0 后酶活開始逐漸下降。因此，確定PH7.0 Tris-HCl為DEAE C-52陰離子交換最適層析緩沖 液。
[0024] 4. 2 DEAE C-52陰離子交換層析洗脫鹽濃度的確定 用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 緩沖液平衡 DEAE C-52,取適量的用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 平衡緩沖液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度 分別為0M、0. IM和IM的平衡緩沖液進行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫峰。檢測各洗脫峰的 酶活，尋找纖維素酶蛋白洗脫的最佳鹽濃度，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，用不同NaCl濃度的緩 沖液進行梯度洗脫，不同的蛋白質(zhì)組分在不同的階段被洗脫出來。但是含有纖維素酶活力 的蛋白主要集中在第三個峰頂端，即約在NaCl濃度為0. 6mol/L洗脫時的色譜峰。
[0025] 2. 3. 4. 3 DEAE C-52陰離子交換層析結(jié)果 取與2. 3. 4. 2中同樣體積的上樣液，采用含有NaCl濃度分別為0M、0. 2M和0. 6M的平 衡緩沖液進行鹽離子梯度洗脫，對目標蛋白所在的峰（〇. 6mol/LNaCl洗脫的蛋白峰)進行分 管收集，結(jié)果如圖3。檢測各管酶活，發(fā)現(xiàn)第三個洗脫峰含有較高的纖維素酶活，將這些管合 并為一管，進行冷凍干燥。
[0026] 5纖維素酶純度的鑒定 將分離純化后的酶液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4。電泳條帶從右往左分別為：M : Marker ; I :硫酸銨透析液；II :Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析濃縮酶液；III :DEAE C-52 離子交換層析濃縮酶液。由SDS-PAGE電泳圖譜，可以看到蛋白電泳是單一條帶，說明純化 后酶液已達到考馬斯亮藍電泳純。
[0027] 6分離純化結(jié)果匯總 粗酶液經(jīng)離心、收集上清、硫酸銨沉淀透析、Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析、DEAE C-52離子交換層析，各步驟分離純化結(jié)果如表1。
[0028] 灰I纖維素_的分離純化匯總

【權(quán)利要求】
1. 一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，其特征在于：所述方法包括：通過 硫酸銨沉淀、透析、凝膠層析和離子交換層析對纖維素酶進行分離純化，SDS-PAGE鑒定蛋白 純度，最終獲得纖維素酶。
2. 根據(jù)從權(quán)利要求1所述的一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，其特征在 于：所述方法具體包括如下： (1) 粗酶液的制備：真姬菇栽培廢料粉碎混勻，按1:3加入緩沖液，混勻，室溫靜置3h ; 紗布過濾,4°C下10000r/min離心20min，取上清即為粗酶液； (2) 硫酸銨沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸銨進行一次硫酸銨沉淀，80wt. %硫酸銨進 行二次硫酸銨沉淀，4°C鹽析10_15h，4°C，10000r/min離心20min，分別收集上清和沉淀，沉 淀用緩沖液溶解至原體積，540nm波長處測定酶活； (3) 透析：粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，10ml緩沖液至完全溶解，在同樣的緩沖液，4°C，磁 力攪拌器上透析；每隔2h更換一次透析液，直至向透析液中加入0. lmol/L BaCl2溶液，檢 測無白色沉淀產(chǎn)生為止；收集酶液，4°C，10000r/min離心20min，取上清；冷凍干燥，少量緩 沖液將可溶蛋白溶解，4°C，10000r/min離心20min，取上清； (4) 凝膠層析：緩沖液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析，流速為1. 5mL/min，直至 記錄儀上的基準線值恒定，停止平衡；取2ml的透析純化后酶液上柱，用緩沖液洗脫，收集 各洗脫峰，檢測各管酶活，合并有酶活管，冷凍濃縮； (5) 離子交換層析：用Tris-HCl緩沖液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡緩沖 液溶解的經(jīng)S印hadex G-100葡聚糖凝膠層析后的酶液上柱，采用含有NaCl濃度分別為0M、 0. 1M和1M的平衡緩沖液進行鹽離子梯度洗脫，收集各洗脫峰；檢測各洗脫峰的酶活，收集， 冷凍干燥； (6) 酶純度的鑒定：分離膠的濃度采用濃度為12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl緩沖 液，用考馬斯亮藍R-250進行染色。
3. 根據(jù)從權(quán)利要求1所述的一種從真姬菇栽培廢料中提取纖維素酶的方法，其特征 在于：步驟（1)- (4)中的緩沖液為0.02M pH4. 8乙酸-乙酸鈉緩沖液；步驟（5)所述的 Tris-HCl緩沖液為0. 02M pH7. 0 Tris-HCl平衡緩沖液。
【文檔編號】C12N9/42GK104278018SQ201410524498
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】胡開輝, 楊云龍, 黃彩梅, 萬春和 申請人:福建農(nóng)林大學