一種與小麥苗期耐低磷能力相關(guān)的snp位點及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與小麥苗期耐低磷能力相關(guān)的SNP位點及其應(yīng)用。該SNP位點為序列4中自5’末端起第56位核苷酸，該第56bp位核苷酸為A和/或G；SEQ ID No.4所示DNA片段在小麥染色體1BL上的132.6cM位置。本發(fā)明還提供了一個新的耐低磷能力主效基因位點QPt.caas-1B及該位點的輔助篩選耐低磷能力強的小麥品種的SNP位點。利用該位點可以篩選耐低磷能力強的小麥，在小麥育種中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一種與小麥苗期耐低磷能力相關(guān)的SNP位點及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種與小麥苗期耐低磷能力相關(guān)的SNP位點 及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 培育高產(chǎn)高效廣適的新品種，不僅需要優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，而且需要較高的肥料利 用效率。磷是作物生長發(fā)育過程中所需重要元素之一，但磷容易被土壤固定，在小麥中當季 利用率只有10-20%，明顯低于水稻和玉米（Lu等，2004)。雖然增加磷肥施用量可有效提高 作物產(chǎn)量，但因品種肥料利用效率的限制，造成過量施用肥料產(chǎn)生不必要的浪費，既增加了 生產(chǎn)成本同時非同化固定的磷肥又加劇了環(huán)境污染。人口和環(huán)境壓力給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來 極大挑戰(zhàn)，探索創(chuàng)新、有效的植物營養(yǎng)方案，進一步提1?新品種的肥料利用效率，對提1?小 麥生產(chǎn)效率具有重要意義。
[0003] 由于磷肥在農(nóng)作物生產(chǎn)中具有重要作用，利用遺傳育種方法培育磷利用效率高、 適應(yīng)性更廣的新品種是重要的育種目標。雖然已知部分基因控制磷利用效率，如PHRl是 植物磷脅迫響應(yīng)基因，適量上調(diào)TaPHRl的表達可以促進小麥根系生長發(fā)育、增強磷吸收和 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達，進而改善植株的磷營養(yǎng)，增加分蘗數(shù)、穗粒數(shù)，提高產(chǎn)量（王靜， 2011)，轉(zhuǎn)運蛋白PHTL 2基因家族可以提高磷的吸收效率等（Wang等，2013)，但真正可用于 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主效基因很少。分子標記輔助選擇技術(shù)可跟蹤轉(zhuǎn)育或聚合優(yōu)良基因，為培育 高產(chǎn)廣適且水肥高效利用的小麥新品種提供了有效的技術(shù)手段。而發(fā)掘控制磷利用效率 相關(guān)基因及基因標記是開展分子標記輔助育種的前提。由于磷的活化和轉(zhuǎn)運因子等研究較 復(fù)雜，植物肥料利用效率相關(guān)基因的定位研究起步較晚，已有的QTL定位研究多集中于不 同肥料處理下的產(chǎn)量性狀及相應(yīng)肥料利用效率（Gallais等，2004 ;L〇udet等，2003 ;Li等， 2005)。目前，已報道的小麥磷利用效率相關(guān)QTL位點主要分布于1A、2B、2D、3A、3B、4B、5A、 5Β、?、6Α、6Β和7A等染色體上，部分QTL位點與其它農(nóng)藝性狀相關(guān)基因連鎖形成密集區(qū)，如 位于5A和染色體上的位點與春化基因 VRN-Al和VRN-Dl連鎖（Su等，2006 ;2009)。在 水稻中，雖然已發(fā)現(xiàn)的與磷利用相關(guān)的QTL位點較多，但只有Pupl位點在不同遺傳背景下 表現(xiàn)穩(wěn)定（Chin等2011 ;Vinod等，2012)。盡管氮、磷利用效率相關(guān)QTL定位研究已取得較 大進展，但已知的控制氮、磷利用效率主效QTL位點卻很少，明確植物對養(yǎng)分吸收、利用途 徑，發(fā)掘相應(yīng)過程中作用基因并開發(fā)分子標記仍是研究的重點。
[0004] 京411曾是上世紀90年代的主栽品種，也是北部冬麥區(qū)骨干親本之一；中麥175 是本麥區(qū)的第一大品種和區(qū)試對照品種，具有極強的耐低肥和耐干旱能力，已在黃淮旱肥 地大面積推廣；北京0045于2008-10年為河北省北部第一大品種，至今仍大面積種植；中 麥415、中麥816和新冬37則于近幾年分別通過了國家和新疆審定。營養(yǎng)液培養(yǎng)法已經(jīng) 被廣泛應(yīng)用于作物苗期培育以及根系特征、肥料敏感性等性狀的研究（Su等，2006 ;肖永貴 等，2014)。磷肥在作物苗期所起的作用尤為重要，可以促進提早分蘗。Peng等研究認為，在 插秩后35天內(nèi)積累氣最多的水稻品種氣肥利用效率最商（Peng等，1994)。在可控營養(yǎng)條 件下，通過不同濃度磷處理，分析不同基因型苗期肥料利用效率及相關(guān)性狀，并利用全基因 組SNP標記分析所選材料攜帶的磷利用效率相關(guān)遺傳區(qū)段，解析其在不同基因型間差異的 原因，可以為培育高產(chǎn)高效廣適的品種奠定理論基礎(chǔ)和提供分子輔助選擇手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助鑒定小麥耐低磷能力的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的方法，是檢測待測小麥的IB染色體132. 6cM位置的基因的第56位 脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G，以確定待測小麥IB染色體132. 6cM位置的基因的 基因型是AA還是AG還是GG，根據(jù)所述待測小麥的基因型確定耐低磷能力：GG基因型的待 測小麥的耐低磷能力高于或候選高于AG或AA基因型的待測小麥；所述GG基因型為IB染 色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為G的純合體，所述AG因型IB染色體 132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為為A和G的雜合體，所述AA因型為IB染 色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為A的純合體。
[0007] 上述方法中，所述檢測待測小麥的IB染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧 核糖核苷酸是A還是G還是A和G包括PCR擴增和對PCR擴增產(chǎn)物進行基因分型鑒定兩個 步驟；
[0008] 所述PCR擴增所用的引物對滿足如下條件：以所述待測小麥的基因組DNA為模板 進行PCR擴增的產(chǎn)物含有IB染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸。
[0009] 上述方法中，所述PCR擴增所用的引物由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、序 列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成的引物組； [0010] 所述序列1所示的單鏈DNA分子的5'末端添加特異熒光序列FAM ;
[0011] 所述序列2所示的單鏈DNA分子的5'末端添加特異熒光序列HEX ;
[0012] 所述基因分型鑒定采用熒光酶標儀；
[0013] 所述耐低磷中磷的終濃度為0. 25m mol/L ;
[0014] 所述IB染色體132. 6cM位置的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種輔助鑒定小麥的耐低磷能力的試劑。
[0016] 本發(fā)明提供的試劑，是待測小麥的IB染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧 核糖核苷酸是A還是G還是A和G的物質(zhì)。
[0017] 上述試劑中,所述物質(zhì)為由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子、序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成的引物組；
[0018] 上述序列1所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子為不同熒光標記， 所述序列1所示的單鏈DNA分子的5'末端具體添加特異熒光序列FAM ;所述序列2所示的 單鏈DNA分子的5'末端具體添加特異熒光序列HEX。
[0019] 可以根據(jù)熒光顏色判斷帶型，上述序列1所示的單鏈DNA分子與序列3所示的單 鏈DNA分子組合擴增，擴增SNP位點基因型為G:G的片段，攜帶FAM的序列PCR擴增后的產(chǎn) 物經(jīng)熒光照射顯示紅色；
[0020] 上述序列2所示的單鏈DNA分子與序列3所示的單鏈DNA分子組合擴增，擴增SNP 位點基因型為A:A的片段，攜帶HEX的序列PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)熒光照射顯示藍色。
[0021] 本發(fā)明第三個目的是提供輔助鑒定小麥的耐低磷能力的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明提供的試劑盒，含有上述的試劑。
[0023] 上述的試劑或上述的試劑盒在輔助檢測小麥耐低磷能力的應(yīng)用也是本發(fā)明保護 的范圍；
[0024] 或上述的試劑或上述的試劑盒在制備輔助檢測小麥耐低磷能力產(chǎn)品中的應(yīng)用也 是本發(fā)明保護的范圍。
[0025] 上述的方法、試劑或試劑盒在選育耐低磷小麥中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0026] 本發(fā)明第四個目的是提供一種與小麥耐低磷能力相關(guān)的SNP位點。
[0027] 本發(fā)明提供的與小麥耐低磷能力相關(guān)的SNP位點，該位點為小麥的IB染色體 132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸，該第56bp位核苷酸為A和/或G ;小麥的 IB染色體132. 6cM位置的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。
[0028] 本發(fā)明第5個目的是提供一種與小麥耐低磷能力相關(guān)的含有SNP位點的DNA片 段。
[0029] 本發(fā)明提供的與小麥耐低磷能力相關(guān)的含有SNP位點的DNA片段，其核苷酸序列 為序列表中序列4,其中，該序列第56bp處堿基為A和/或G ;且該DNA片段在小麥IB染色 體上的132. 6cM位置。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述小麥具體可為如下品種中任一種或幾種：京冬17、煙農(nóng)19、科遺 5214、中麥895、中麥875、濟麥22、濟麥23、濟麥24、山農(nóng)715、石麥15、石麥19、石優(yōu)20、衡 觀35、良星99、鄭麥0943、周麥16、周麥18、周麥22、洛旱2號、矮抗58、小偃101、Wheatear。
[0031] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一個新的耐低磷能力基因位點QPt. caas-ΙΒ及 輔助篩選具有較強耐低磷能力的小麥品種的SNP位點。利用該SNP位點可以篩選耐低磷 能力優(yōu)良的小麥，對培育高效型小麥品種具有重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為中麥175(左）和京冬17(右）在3個磷濃度下長勢圖
[0033] 圖2為耐低磷能力相關(guān)SNP標記與QPt. caas-ΙΒ連鎖圖

【具體實施方式】
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 實施例1、與小麥耐低磷能力相關(guān)的SNP位點的獲得
[0037] 選用冬小麥骨干親本京411及其14個衍生品種（系），包括衍生一代6份，衍生二 代8份。
[0038] 1、小麥苗期培養(yǎng)以及耐低磷能力調(diào)查
[0039] 采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法，設(shè)置3個KH2PO4濃度營養(yǎng)液：0、0. 005、0. 25 (m mol/L) ΚΗ2Ρ04?；A(chǔ)營養(yǎng)液為：K2S040. 75、KCl 0· 1、MgSO4O. 6、FeEDTA 4. OX 1(Γ2、H3BO3L OX 10' MnSO4L 0Xl(T3、ZnS04l· 0X1(T3、CuS041· 0Χ1(Γ4、（Na)6Mo2045. 0Xl(T6、Ca(N03)22· 0。在不施 和低磷處理中用KCl將K+補充到0. 25m mol/L相同水平，具體配方如下：
[0040] Om mol/L KH2PO4 營養(yǎng)液（m mol/L):除了基礎(chǔ)營養(yǎng)液以外，補充 0· 25m mol/LKCl， 組成〇m mol/L KH2PO4營養(yǎng)液；
[0041] 0. 005m mol/L KH2PO4營養(yǎng)液：將基礎(chǔ)營養(yǎng)液與0. 005m mol/L KH2PCV混合，另補充 0· 245m mol/L KCl，組成 0· 005m mol/L KH2PO4 營養(yǎng)液；
[0042] 0.25m mol/L KH2PO4營養(yǎng)液：將基礎(chǔ)營養(yǎng)液與0.25m mol/L KH2PO4混合，組成 0· 25m mol/L KH2PO4 營養(yǎng)液。
[0043] 處理方法：每品種選取種子50粒，用10%的H2O2處理20-30分鐘，無菌水沖洗5-6 次。選取飽滿且大小一致的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱暗室催芽。待種子露 白后，移栽至石英砂中培養(yǎng)一周。挑選長勢均勻的幼苗移栽至有含有不同濃度KH 2PO4營養(yǎng) 液的培養(yǎng)盒中。每3天更換一次營養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)20天后收獲。測量每個處理下地上部干 重 SDWtl (0m mol/L KH2PO4)、SDW1 (0· 005m mol/L KH2PO4)、SDW2 (0· 25mmol/L KH2PO4)，計算不 施磷和低磷下的耐低磷能力（Ability of tolerance to low phosphorus, ATP)，計算公式 如下：
[0044] ATP0 = (SDW0/SDW2) X 100 !ATP1 = (SDW1ZSDW2) X 100。
[0045] ATPtl和ATP1分別為不施磷和低磷下的耐低磷能力。
[0046] 2、引物獲得和SNP位點分析
[0047] SNP(單核苷酸多態(tài)性）標記在博奧生物有限公司（CapitalBio Corporation, Bei jing, China ;http://bioservices. capitalbio. com)利用 Illumina SNP 基因分型檢測，主要分為以下步驟：1)將待測小麥品種基因組DNA進行全基因組擴增； 2)擴增產(chǎn)物用隨機內(nèi)切酶酶切斷化；3)將DNA片段與芯片進行雜交，芯片的微珠上連接有 50-mers長度特異性捕獲探針，gDNA酶切后產(chǎn)物與探針互補序列結(jié)合；4)清洗去除未雜交 上的或錯配雜交上的DNA片段；5)二硝基酚（dinitrophenol)和生物素（biotin)標記的 核苷酸底物（A/T和C/G)在捕獲探針上進行單堿基延伸，只有與gDNA發(fā)生互補結(jié)合的探針 才能得到延伸；通過染色，A/T和C/G將分別標記不同的熒光染料；6)芯片掃描，并利用軟 件根據(jù)兩種熒光判讀并輸出分型結(jié)果。
[0048] 利用Illumina SNP基因分型研究平臺對京411及其衍生品種（系）DNA進行90k SNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列標記，共計81587個，其中24080個 SNP標記在京411衍生群體內(nèi)存在差異。
[0049] 3、關(guān)聯(lián)基因定位和連鎖標記的發(fā)現(xiàn)
[0050] 利用SAS9. 2軟件（SAS Institute. 2000)進行基本統(tǒng)計量、多重比較分析，并結(jié)合 SAS的Glmselect程序?qū)NP數(shù)據(jù)和根系性狀進行逐步回歸，根據(jù)P值（P〈0. 01)判斷關(guān)聯(lián) 位點。定位出控制小麥耐低磷能力的SNP標記BS00015519_51與基因 Qpue. caas-lB關(guān)聯(lián) (Ρ〈0· 001)。
[0051] 4、BS00015519_51位點的等位基因特異標記鑒定
[0052] 分別提取京411及14個衍生品種的全基因組DNA。以各個基因組DNA為模板，用 小麥耐低磷能力的SNP標記BS00015519_51位點的等位基因特異標記組合進行基因分型檢 測，出現(xiàn)G:G分型的片段則說明該標記能夠有效鑒定小麥品種耐低磷能力基因。
[0053] 表1為耐低磷能力標記等位變異在京411衍生群體中的分離
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種輔助鑒定小麥耐低磷能力的方法，是檢測待測小麥的1B染色體132. 6cM位置的 基因的第56位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G，以確定待測小麥1B染色體132. 6cM 位置的基因的基因型是AA還是AG還是GG，根據(jù)所述待測小麥的基因型確定耐低磷能力： GG基因型的待測小麥的耐低憐能力商于或候選商于AG或AA基因型的待測小麥；所述GG基 因型為1B染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為G的純合體，所述AG因 型1B染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為為A和G的雜合體，所述AA 因型為1B染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸為A的純合體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測待測小麥的1B染色體132. 6cM 位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G包括PCR擴增和對PCR擴增 產(chǎn)物進行基因分型鑒定兩個步驟； 所述PCR擴增所用的引物對滿足如下條件：以所述待測小麥的基因組DNA為模板進行 PCR擴增的產(chǎn)物含有1B染色體132. 6cM位置的基因的第56位脫氧核糖核苷酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR擴增所用的引物由序列表中序 列1所示的單鏈DNA分子、序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的 單鏈DNA分子組成的引物組； 所述序列1所示的單鏈DNA分子的5'末端添加特異熒光序列FAM ; 所述序列2所示的單鏈DNA分子的5'末端添加特異熒光序列HEX ; 所述基因分型鑒定采用熒光酶標儀； 所述耐低磷中磷的終濃度為〇. 25m mol/L ; 所述1B染色體132. 6cM位置的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。
4. 一種輔助鑒定小麥的耐低磷能力的試劑，是待測小麥的1B染色體132.6cM位置的基 因的第56位脫氧核糖核苷酸是A還是G還是A和G的物質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于：所述物質(zhì)為由序列表中序列1所示的單 鏈DNA分子、序列表中序列2所不的單鏈DNA分子和序列表中序列3所不的單鏈DNA分子 組成的引物組； 所述序列1所示的單鏈DNA分子的5'末端具體添加特異熒光序列FAM ; 所述序列2所示的單鏈DNA分子的5'末端具體添加特異熒光序列HEX。
6. 輔助鑒定小麥的耐低磷能力的試劑盒，含有權(quán)利要求4或5所述的試劑。
7. 權(quán)利要求4或5所述的試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒在輔助檢測小麥耐低磷能力 的應(yīng)用； 或權(quán)利要求4或5所述的試劑或權(quán)利要求6所述的試劑盒在制備輔助檢測小麥耐低磷 能力廣品中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1-7所述的方法、試劑或試劑盒在選育耐低磷小麥中的應(yīng)用。
9. 一種與小麥耐低磷能力相關(guān)的SNP位點，該位點為小麥的1B染色體132. 6cM位置的 基因的第56位脫氧核糖核苷酸，該第56bp位核苷酸為A和/或G ;小麥的1B染色體132. 6cM 位置的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。
10. -種與小麥耐低磷能力相關(guān)的含有SNP位點的DNA片段，其核苷酸序列為序列表 中序列4,其中，該序列第56bp處堿基為A和/或G ;且該DNA片段在小麥1B染色體上的 132. 6cM 位置。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293939SQ201410520103
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】何中虎, 李法計, 肖永貴, 夏先春, 陳新民, 李思敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所