一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈廢水處理中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈廢水處理中的應(yīng)用屬于生物工程技術(shù)；該基因工程菌株Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，已于2014年07月25日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCCNo.9484。該菌株是通過基因工程于段將Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因插入到Bacillus subtilis N4中表達(dá)而得。該菌株能夠產(chǎn)生生物膜并且降解乙腈，經(jīng)過在合成廢水中37℃，60r/min培養(yǎng)48h，生物膜形成量OD570nm值為1.45；在含有800mg/L乙腈的合成廢水中，37℃，160rpm振蕩培養(yǎng)48h后乙腈的殘留濃度為23.56mg/L。該菌株抗乙腈沖擊能力強(qiáng)，在移動床生物膜反應(yīng)器運(yùn)行35d后，可將合成廢水中800mg/L的乙腈降至出水的0.32mg/L，合成廢水的COD值由487mg/L降至出水的16.39mg/L。本發(fā)明的菌株為利用生物膜法處理含腈廢水提供了新方法。
CGMCCNo.9484
2014.07.25
【專利說明】一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈廢水處理中的 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及一株腈降解-生物膜形成雙功能基因工 程菌及其在含腈廢水處理中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 乙腈是一種含氰基（R-CN)的有機(jī)化工原料，廣泛用于制藥、合成纖維、石油化工 等領(lǐng)域，是含腈廢水中的主要成分之一。含腈廢水中的乙腈進(jìn)入自然水域后會引起魚類等 水生生物大批死亡，對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。乙腈可由吸入、食入及皮膚吸收而進(jìn)入體 內(nèi)，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為劇毒物質(zhì)--氰化氫和乙醛，威脅人畜健康。腈水解酶（nitrilase) 是腈降解菌代謝腈類化合物的重要降解酶之一，通過一步反應(yīng)即可將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸 和氨。
[0003] 生物膜（Biofilms)是指由附著于惰性或者活性實體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌 的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。形成生物膜是絕大多數(shù)微生物生長的最理想模 式，生物膜能夠有效地阻止抗菌劑、殺蟲劑、重金屬、宿主防御機(jī)制等的傷害，提高細(xì)菌在環(huán) 境中的適應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在生物膜中比浮游狀態(tài)下的代謝活力更強(qiáng)，降解質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn) 移的頻率更高，有利于廢水的生物處理。然而在自然狀態(tài)下，生物膜內(nèi)微生物菌群往往不能 承受高濃度有毒物質(zhì)，所以當(dāng)在處理高濃度難降解廢水時效率較低，甚至失效。因此，有針 對性的篩選降解某種污染物的微生物，將其與生物膜形成菌一起加入生物反應(yīng)器中強(qiáng)化污 水治理是解決上述問題的一種行之有效的方法。但此方法也存在一定問題，主要包括：①污 染物降解菌與成膜菌之間有可能存在競爭生長；②污染物降解菌若無法很好地定殖于成膜 菌中，則降解菌容易流失，廢水處理效果不佳。如果將對污染物具有降解能力的基因轉(zhuǎn)入生 物膜形成菌中，就可以在一定程度上解決上述問題，從而降低處理成本、減少污染。因此利 用基因工程手段構(gòu)建多功能工程菌株，開發(fā)出既具有降解腈類化合物能力，同時又具備生 物膜形成能力的雙功能菌株，用于含腈廢水的生物膜法處理中，將具有較高的經(jīng)濟(jì)效益、社 會效益和生態(tài)效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株高效表達(dá)腈水解酶同時可形成生物膜的基因工程菌 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，并將該菌株應(yīng)用于降解乙腈及含腈廢 水的處理。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明所提供的腈降解生物膜形成雙功能基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，已于2014年07月25日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心（簡稱CGMCC) "，其保藏號為CGMCCNo. 9484。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101。
[0007] 本發(fā)明利用的原始菌株為乙腈高效降解菌Rhodococcus rhodochrous BX2和具有 強(qiáng)生物膜形成能力的Bacillus subtilis N4。本發(fā)明利用基因工程手段將Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因（腈水解酶可降解乙腈）插入到Bacillus subtilis N4中表達(dá)，獲得腈降解-生物膜形成雙功能菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT0I-Nitr〇
[0008] 所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis M-pHTOl-Nitr是通過如 下方法構(gòu)建的：以Rhodococcus rhodochrous BX2的總DNA作為模板，根據(jù)腈水解酶基因的 基因序列和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體PHTOl的多克隆酶切位點設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增出腈 水解酶基因DNA片段。將腈水解酶基因片段克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR鑒定出的陽性克 隆進(jìn)行測序，將測序成功的PCR產(chǎn)物腈水解酶基因片段通過酶切位點連接到原核表達(dá)載體 pHTOl上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和Xbal/Aatll雙酶切鑒定，篩選陽性重組子， 成功構(gòu)建枯草芽孢桿菌原核表達(dá)載體pHTOl-Nitr，通過電轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體pHTOl-Nitr 轉(zhuǎn)入具有生物膜形成能力的野生型Bacillus subtilis M中。經(jīng)過提取質(zhì)粒PCR、雙酶 切和測序篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建含腈水解酶基因的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 雙功能菌。
[0009] 所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr能夠產(chǎn)生 生物膜：枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在合成廢水中 養(yǎng)48h內(nèi)，生物膜形成量OD57tol值可達(dá)到1. 4以上。
[0010] 所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis M-pHTOl-Nitr可以降解 乙腈：在含有800mg/L乙腈的合成廢水中，接種雙功能菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr后，乙腈濃度迅速下降，48h后乙腈的殘留濃度為23. 56mg/L。
[0011] 所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈廢 水處理中的應(yīng)用：合成廢水中乙腈的添加濃度為800mg/L，在抗沖擊能力實驗中，枯草芽孢 桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的抗乙腈沖擊能力強(qiáng)，在連續(xù)六次更換合成廢水 后，其最終在誘導(dǎo)8小時內(nèi)對合成廢水中乙腈的降解率達(dá)到49% ;在生物反應(yīng)器處理含腈 廢水試驗中，投加活性污泥與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的MBBR反 應(yīng)器在運(yùn)行35d乙腈濃度為0. 32mg/L，出水COD值為16. 39mg/L。
[0012] 所述的原始菌株Rhodococcus rhodochrous BX2和Bacillus subtilis N4均由本 實驗室分離所得。（孫晶，熊明華，成小松，李悅，臧海蓮，李春艷。Rhodococcus Sp.BX2菌對 乙腈的降解特性及其降解途徑研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2012,32(5) :1041-1048. Chunyan Li, Yue Li, Xiaosong Cheng, Liping Feng, Chuanwu Xi, Ying Zhang. Immobilization of Rhodococcus rhodochrous BX2 (an acetonitriledegrading bacterium)with biofilm-forming bacteria for wastewater treatment, Bioresource Technology 131(2013)390-396.)
[0013] E. coli competent cells DH5a 購自 TransGen。
[0014] 質(zhì)粒載體pMD18_T simple vector,購自大連寶生物科技有限公司。
[0015] 枯草桿菌表達(dá)載體pHTOl購自德國分子生物技術(shù)（Molecular Biotechnology)公 司。
[0016] 本發(fā)明提供的菌株，一方面充實了乙腈降解的微生物資源，另一方面，通過基因克 隆手段使成膜菌不僅具有成膜能力，同時還具有腈降解功能，進(jìn)一步研究其用于移動床生 物膜反應(yīng)器（MBBR)處理含腈廢水的效果，為含腈廢水處理新方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1腈水解酶基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0018] 圖2質(zhì)粒pMD18-T-Nitr的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019] 圖3pHT01-Nitr載體雙酶切結(jié)果圖。
[0020] 圖4枯草芽孢桿菌中重組質(zhì)粒pHTOl-Nitr的雙酶切結(jié)果圖。
[0021] 圖 5 枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis N4-pHT01_Nitr SDS-PAGE 電泳圖。
[0022] 圖6枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的生物膜形成量變化曲 線。
[0023] 圖7枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr對乙腈的耐受情況圖。
[0024] 圖8枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr對乙臆的降解能力圖。
[0025] 圖9枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的生物膜抗乙腈沖擊能力 圖。
[0026] 圖IOMBBR生物膜反應(yīng)器模擬含腈廢水處理過程中，出水乙腈殘留量變化曲線。
[0027] 圖IIMBBR生物膜反應(yīng)器模擬含腈廢水處理過程中，出水COD變化曲線。

【具體實施方式】
[0028] 實例1、基因工程菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的構(gòu)建
[0029] (I) Rhodococcus rhodochrous BX2中臆水解酶基因的PCR擴(kuò)增及亞克隆
[0030] 以Rhodococcus rhodochrous BX2的總DNA作為模板，根據(jù)臆水解酶基因的基因 序列和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體PHTOl的多克隆酶切位點設(shè)計的引物5，GCGTCTAGAATGGTCGA ATACACAAACAAITTC3' 和 5' ATTGACGTCTCAGATGGAGGCTGTCGC3' (下劃線處依次為 XbaI 酶切 位點和AatII酶切位點）為引物，通過PCR擴(kuò)增出長為IlOlbp的腈水解酶基因DNA的基因 片段，該腈水解酶基因的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示，其中1，2為腈水解酶基因的PCR產(chǎn) 物，M為IOOOObp的DNA Marker，與預(yù)期目的片段大小一致。將腈水解酶基因加A尾完成后 與 PMD18-T simple vector 進(jìn)行連接，連接成功后將 pMD18-T-Nitr 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5a，篩 選陽性重組子pMD18-T-Nitr，得到純化的質(zhì)粒pMD18-T-Nitr (如圖2)。
[0031] (2)pHT01-Nitr表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032] 將含有pMD18-T_Nitr和pHTOl質(zhì)粒的E. coli DH5 a分別在含1〇〇 y g/mL氨芐青 霉素和50 ii g/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中35°C，160rpm過夜培養(yǎng)。提取pMD18-T-Nitr和 pHTOl質(zhì)粒，所提質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和AatII進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)束后，立即進(jìn) 行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用OMEGA試劑盒回收酶切成功的目的片段并進(jìn)行連接，連 接結(jié)束后，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)后得到重組子PHT01-Nitr，以該 重組子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為IlOlbp的片段，與腈水解酶基因片段大小相符。重 組子經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Aat II雙酶切得到IlOlbp和7955bp兩條片段，分別對應(yīng)于 腈水解酶基因和PHTOl的大小，證實了腈水解酶基因與pHTOl載體成功重組，如圖3所示， 其中1，2為pHTOl-Nitr載體雙酶切結(jié)果；M為15000bp DNA Marker。
[0033] (3)電轉(zhuǎn)化表達(dá)載體 pHTOl-Nitr 轉(zhuǎn)入 Bacillus subtilis M 中
[0034] 制備B. subtilis M電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將構(gòu)建好的表達(dá)載體pHTOl-Nitr通過電 擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入B. subtilis M，在含有氯霉素（5 ii g/mL)的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單菌 落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，雙酶切結(jié)果如圖4所示，得到2條分別與 腈水解酶基因和pHTOl載體大小相符的條帶，證明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入B. subtilis M中，重組 的雙功能菌命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr。
[0035] (4)重組質(zhì)粒pHTOl-Nitr的遺傳穩(wěn)定性及在蛋白水平的表達(dá)
[0036] 質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的不均勻分配是質(zhì)粒丟失的主要原因，常使部分子代細(xì)胞不含 質(zhì)粒。為了證明重組質(zhì)粒能否在B. subtilis M中進(jìn)行穩(wěn)定遺傳，將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在指數(shù)期以1 %的接種量連續(xù)轉(zhuǎn)接25代后分別在選擇性LB培養(yǎng) 基（含5 y g/mL氯霉素）和非選擇性LB培養(yǎng)基（不含氯霉素）上涂布培養(yǎng)，計算兩平板上 的菌落數(shù)，按下述公式計算質(zhì)粒丟失率。

【權(quán)利要求】
1. 一株腈降解生物膜形成雙功能基因工程菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，該菌株已于2014年07月25日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心（簡稱CGMCC) "，保藏號為CGMCCNo. 9484。
2. 如權(quán)利要求1所述的一株腈降解生物膜形成雙功能基因工程菌枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 產(chǎn)生生物膜。
3. 如權(quán)利要求1所述的一株腈降解生物膜形成雙功能基因工程菌枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 用于降解乙臆。
4. 如權(quán)利要求3所述的一株腈降解生物膜形成雙功能基因工程菌枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈廢水處理中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK104293725SQ201410519862
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】李春艷, 成毅, 楊亞麗, 岳振雷, 馮鳳兆, 徐春紅, 黃馨凝, 侯寧, 安雪姣, 成小松 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)