一種松樹蜂特異性ss-coⅰ引物對及快速分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種松樹蜂特異性SS-COⅠ引物對及快速分子檢測方法，本發(fā)明以松樹蜂為靶標，與松樹蜂在國內(nèi)同域發(fā)生和同屬近緣的其他4種樹蜂(Sirex nitidus，新渡戶樹蜂Sirex nitobei，煙角樹蜂Tremex fuscicornis，黑頂扁角樹蜂Tremex apicalis)作為參照，設計基于線粒體COⅠ基因序列的種特異性引物，并構(gòu)建和優(yōu)化了松樹蜂快速分子檢測體系。
【專利說明】-種松樹蜂特異性SS-CO I引物對及快速分子檢測方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子檢測領域，特別涉及一種松樹蜂特異性SS-C0 I引物對及快速分 子檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球經(jīng)濟一體化的加快，林業(yè)外來生物入侵的形勢日趨嚴峻。一些重大林業(yè) 入侵物種已對我國的森林資源、物種多樣性與生態(tài)安全造成了重大損失。
[0003] 松樹蜂（Sirex noctilio F.)原產(chǎn)歐亞大陸和北非，主要危害松樹。在美國被列 為具有"極高風險"的林業(yè)入侵生物。在上世紀，該蟲先后入侵澳洲的新西蘭和澳大利亞， 南美的烏拉圭、阿根廷、巴西和智利，以及南非等國；在本世紀初，又傳入北美的加拿大和美 國；在嚴重入侵區(qū)域，可造成80%的松樹死亡。據(jù)國外文獻報導，該蟲危害各類針葉樹，尤 其是松樹；天然林和人工林均可入侵，健康和衰弱樹木均能危害，入侵后導致的林木死亡率 很高；適生區(qū)域極廣，可隨原木和木包裝進行遠距離傳播。
[0004] 此前，我國一直報導沒有松樹蜂的分布，在1980年和2003年的全國林業(yè)有害生物 普查中也未發(fā)現(xiàn)該蟲，但一直高度關(guān)注和防范此蟲的入侵；為此，2007年我國把該蟲列入 《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。國內(nèi)外專家也對該蟲在我國的潛在適生 區(qū)進行了分析，結(jié)果認為：自云南至黑龍江一線以南的廣大區(qū)域均為高度適生區(qū)；在我國 寄主樹種廣泛，潛在風險非常大。
[0005] 植物檢疫，是防止外來有害生物入侵的最有效的手段。近年來，我國在東部地區(qū) 多個口岸在進境原木與木質(zhì)包裝中不斷截獲該蟲。為了將松樹蜂與近緣種樹蜂類昆蟲區(qū)分 開來，需要大量形態(tài)學鑒別工作，這些工作大多費時、費力且需要專業(yè)的昆蟲分類學知識。 并且，處于卵、幼蟲、蛹這三個蟲態(tài)的樹蜂類昆蟲在形態(tài)上非常相似，目前還沒有可靠的鑒 定特征。
[0006] 近些年，越來越多的研究已證明分子生物學手段能夠為鑒定害蟲提供有力依據(jù)。 線粒體DNA嚴格母性遺傳，其中的細胞色素氧化酶I基因（C0I)具有高度保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， 無內(nèi)含子的特點。因此，常作為昆蟲DNA條形碼用于物種分類、鑒定和親緣關(guān)系的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種松樹蜂特異性 SS-C0 I引物對及快速分子檢測方法，本發(fā)明鑒定方法快速穩(wěn)定，對操作人員的專業(yè)技術(shù) 能力要求較低，無需掌握樹蜂類昆蟲形態(tài)的專業(yè)知識，可廣泛應用于基層的檢驗檢疫及相 關(guān)部門。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0009] 一種松樹蜂特異性SS-C0 I引物，其序列如下：
[0010] SNSSF1 :5, -ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3，
[0011] SNSSR1 :5, -AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3'
[0012] 一種松樹蜂快速分子檢測方法，包括如下步驟，
[0013] 步驟一、昆蟲基因組DNA的提取
[0014] 基因組 DNA 提取都采用 BI0MIGA 公司的 EZgene? Insect gDNA Kit (⑶2413-02) 試劑盒。
[0015] 具體操作步驟：
[0016] (1)將在純酒精中浸泡的標本用超聲波儀器清洗干凈晾干后，成蟲去頭和鞘翅，幼 蟲取其腹部組織。取< 50mg的組織于研缽中充分研磨，置于1. 5ml的離心管中。
[0017] (2)向離心管中加入350ul的Buffer ITL與25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混 勻后置于60°C恒溫水浴鍋兩個小時直到組織完全被消化。
[0018] (3)在離心管中加入350 μ 1的氯仿：異戊醇（24:1)緩慢混勻，在室溫，10, 000轉(zhuǎn) 速下離心2min，并小心的將上清液轉(zhuǎn)移到新的干凈的1. 5ml離心管中。
[0019] (4)加入1倍體積的的BufferBL與5 μ 1的RNaseA，緩慢混勻，70°C水浴半小時。
[0020] (5)加入1倍體積的無水乙醇（室溫），緩慢混勻。
[0021] (6)將前一步的溶液和絮狀沉淀700 μ加入吸附柱內(nèi)（吸附柱安放于收集管內(nèi)）， 10, OOOxg室溫下離心lmin，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)。如此時仍有剩余混合液 則重復第6步。
[0022] (7)將吸附柱重新置于新的收集管內(nèi)，加入500 μ 1的BufferKB，10, OOOxg室溫下 離心30s，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)。
[0023] (8)加入600 μ 1的DNAWashBuffer，10, OOOxg離心30s，移除廢液，吸附柱重新置 于收集管內(nèi)。
[0024] (9)重復第8步，將吸附柱置于新的收集管內(nèi)，在吸附柱的蓋子打開的條件下， 13, 000sg室溫離心2min，后置于室溫下數(shù)分鐘，使酒精充分揮發(fā)。
[0025] (10)將吸附柱置于新的1. 5ml離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入30μ 1的 Elution Buffer,Elution Buffer在60°C-70°C條件下預熱，室溫放置 2 分鐘，在 13, OOOxg 下離心2min。
[0026] (11)重復第10步，以便提高產(chǎn)量。
[0027] 步驟二、樹蜂C0 I基因序列的通用引物擴增
[0028] 根據(jù)已有文獻報道，合成樹蜂類昆蟲⑶I基因序列擴增通用引物：
[0029] LC0 1490:5, -GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3，，
[0030] HC0 2198 :5, -TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
[0031] PCR擴增反應使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒（Promega)，總體系為 25 4 1，包括：2父60丁&9 6代611]\&18七6『]\^叉12.5 4 1、兩種引物^：0 1490 和！1〇)2198各 1 μ 1、DNA模板1. 5μ l、ddH20 9 μ 1?；靹蚝蠓湃隤CR儀中進行擴增，擴增的程序為：94°C預 變性2min，94°C變性30s，45°C復性30s，68°C延伸1. 5min，35個循環(huán)；最后68°C延伸10min。 每次反應用無菌蒸餾水做一個空白對照，用以排除系統(tǒng)誤差。取3 μ 1產(chǎn)物上樣到1. 5% TAE 瓊脂糖凝膠上。經(jīng)130V電泳20min后，將膠塊浸泡于ΕΒ染料中3min，在紫外分光光度計下 檢測拍照。
[0032] 步驟三、近緣種多重序列對比及種特異性引物設計
[0033] 將PCR產(chǎn)物送諾賽生物（北京）公司進行雙向測序，得到CO I序列。使用DNAstar 對序列進行拼接，去除冗余序列，將序列結(jié)果在GeneBank中進行Blast序列比對。
[0034] 根據(jù)本實驗中5種樹蜂的測序結(jié)果以及數(shù)據(jù)庫中已公開的10種Sirex屬樹蜂的 堿基序列進行對比分析，運用軟件Primer Primer5. 0軟件設計松樹蜂特異性SS-CO I引 物 1 對（SNSSF1/SNSSR1):
[0035] SNSSF1 :5, -ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3，
[0036] SNSSR1 :5, -AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3'
[0037] 步驟四、松樹蜂SS-CO I種特異性引物擴增體系的建立優(yōu)化
[0038] PCR擴增反應使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒（Promega)，反應體系與C0 I基因序列擴增體系相同（見表1)。擴增的程序為：94°C預變性2min，94°C變性30s，53°C 復性30s，72°C延伸1. 5min，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。每次反應用無菌蒸餾水做一 個空白對照，用以排除系統(tǒng)誤差。取3μ1產(chǎn)物上樣到1.5% TAE瓊脂糖凝膠上。經(jīng)130V電 泳20min后，將膠塊浸泡于ΕΒ染料中3min，在紫外分光光度計下檢測拍照。
[0039] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明鑒定方法快速穩(wěn)定，對操作人員的 專業(yè)技術(shù)能力要求較低，無需掌握樹蜂類昆蟲形態(tài)的專業(yè)知識，可廣泛應用于基層的檢驗 檢疫及相關(guān)部門。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1瓊脂糖凝膠電泳檢測五種樹蜂PCR擴增產(chǎn)物的檢測圖：a. CO I通用引物擴增 產(chǎn)物電泳圖；b.松樹蜂特異性SS-CO I引物擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0041] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道： 1-松樹蜂 Sirex noctilio,2_Sirex nitidus，3_ 新渡戶樹蜂 Sirex nitobei，4_ 煙角樹蜂 Tremex fuscicornis，5_ 黑頂扁角樹蜂 Tremex apicalis，6-陰性對照（超純水）。
[0042] 圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測松樹蜂種特異性引物的靈敏度
[0043] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2, 000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道 1-6分別代表：40ng，4ng，400pg，40pg，4pg和400fg的松樹蜂基因組DNA，泳道7-陰性對照 (超純水）
[0044] 圖3瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性引物對不同蟲態(tài)松樹蜂樣本的擴增。
[0045] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2, 000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道 1-3分別代表：1-幼蟲，2-蛹，3-成蟲，泳道4-陰性對照（超純水）
[0046] 圖4瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性引物對不同地區(qū)松樹蜂樣本的擴增
[0047] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2, 000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道 1-7分別代表七個不同地區(qū)的松樹蜂樣本：1-黑龍江杜蒙，2-黑龍江鶴崗，3-黑龍江齊齊 哈爾，4-黑龍江綏陽，5-吉林榆樹，6-內(nèi)蒙滿洲里，7-內(nèi)蒙克一河，泳道8-陰性對照（超 純水）

【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明方案做進一步詳細描述：試驗例1
[0049] 本發(fā)明以松樹蜂為靶標，與松樹蜂在國內(nèi)同域發(fā)生和同屬近緣的其他4種樹蜂 (Sirex nitidus，新渡戶樹蜂 Sirex nitobei，煙角樹蜂 Tremex fuscicornis，黑頂扁角樹 蜂Tremex apicalis)作為參照，設計基于線粒體CO I基因序列的種特異性引物，并構(gòu)建 和優(yōu)化了松樹蜂快速分子檢測體系。
[0050] 1.昆蟲基因組DNA的提取
[0051] 基因組 DNA 提取都采用 BI0MIGA 公司的 EZgene? Insect gDNA Kit (⑶2413-02) 試劑盒。
[0052] 具體操作步驟：
[0053] (1)將在純酒精中浸泡的標本用超聲波儀器清洗干凈晾干后，成蟲去頭和鞘翅，幼 蟲取其腹部組織。取< 50mg的組織于研缽中充分研磨，置于1. 5ml的離心管中。
[0054] (2)向離心管中加入350ul的Buffer ITL與25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混 勻后置于60°C恒溫水浴鍋兩個小時直到組織完全被消化。
[0055] (3)在離心管中加入350 μ 1的氯仿：異戊醇（24:1)緩慢混勻，在室溫，10, 000轉(zhuǎn) 速下離心2min，并小心的將上清液轉(zhuǎn)移到新的干凈的1. 5ml離心管中。
[0056] (4)加入1倍體積的的BufferBL與5 μ 1的RNaseA，緩慢混勻，70°C水浴半小時。
[0057] (5)加入1倍體積的無水乙醇（室溫），緩慢混勻。
[0058] (6)將前一步的溶液和絮狀沉淀700 μ加入吸附柱內(nèi)（吸附柱安放于收集管內(nèi)）， 10, OOOxg室溫下離心lmin，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)。如此時仍有剩余混合液 則重復第6步。
[0059] (7)將吸附柱重新置于新的收集管內(nèi)，加入500 μ 1的BufferKB，10, OOOxg室溫下 離心30s，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)。
[0060] (8)加入600 μ 1的DNAWashBuffer，10, OOOxg離心30s，移除廢液，吸附柱重新置 于收集管內(nèi)。
[0061] (9)重復第8步，將吸附柱置于新的收集管內(nèi)，在吸附柱的蓋子打開的條件下， 13, 000sg室溫離心2min，后置于室溫下數(shù)分鐘，使酒精充分揮發(fā)。
[0062] (10)將吸附柱置于新的1. 5ml離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入30μ 1的 Elution Buffer,Elution Buffer 在60°C-70°C條件下預熱，室溫放置 2 分鐘，在 13, OOOxg 下離心2min。
[0063] (11)重復第10步，以便提高產(chǎn)量。
[0064] 2.樹蜂CO I基因序列的通用引物擴增
[0065] 根據(jù)已有文獻報道，合成樹蜂類昆蟲⑶I基因序列擴增通用引物：
[0066] LC0 1490:5, -GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3，，
[0067] HC0 2198 :5' -TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
[0068] PCR 擴增反應使用 G〇Taq? GreenMasterMix 試劑盒（Promega)，總體系為 25 μ 1， 各成分如表1所示：
[0069] 表1PCR反應體系
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種松樹蜂特異性SS-CO I引物，其特征在于，其序列如下： SNSSFl :5' -ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3' SNSSRl :5' -AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3'。
2. -種松樹蜂快速分子檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的松樹蜂特異性 SS-CO I引物對松樹蜂及其他與松樹蜂同域發(fā)生和同屬近緣的樹蜂類昆蟲DNA進行PCR擴 增，以快速檢測松樹蜂品種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，松樹蜂SS-CO I特異性引物擴增體系的 建立包括如下步驟： 步驟一、昆蟲基因組DNA的提??； 步驟二、樹蜂CO I基因序列的通用引物擴增； 步驟三、近緣種多重序列對比及種特異性引物設計； 將步驟二所得通用引物擴增后的PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到CO I序列，使用 DNAstar對序列進行拼接，去除冗余序列，將序列結(jié)果在GeneBank中進行Blast序列比對； 根據(jù)5種樹蜂的測序結(jié)果以及數(shù)據(jù)庫中已公開的10種Sirex屬樹蜂的堿基序列進行 對比分析，運用軟件Primer Primer5. 0軟件設計松樹蜂特異性SS-CO I引物1 : SNSSFl :5' -ATT CTG ACT CCT TCC TCC TGC TTT-3' SNSSRl :5' -AGT GAT TGC TCC AGC AAG AAC A-3' ； 步驟四、松樹蜂SS-CO I種特異性引物擴增體系的建立優(yōu)化 PCR擴增反應使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒，除采用SS-CO I種特異性引物 夕卜，反應體系與CO I基因序列擴增體系相同，擴增的程序為：94°C預變性2min，94°C變性 30s，53°C復性30s，72°C延伸1.5min，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，每次反應用無菌蒸 餾水做一個空白對照，用以排除系統(tǒng)誤差，取3μ 1產(chǎn)物上樣到I. 5% TAE瓊脂糖凝膠上，經(jīng) 130V電泳20min后，將膠塊浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度計下檢測拍照。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟一的具體操作步驟為： (1) 將在純酒精中浸泡的標本用超聲波儀器清洗干凈晾干后，成蟲去頭和鞘翅，幼蟲取 其腹部組織；取< 50mg的組織于研缽中充分研磨，置于I. 5ml的離心管中； (2) 向離心管中加入350ul的Buffer ITL與25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混勻后 置于60°C恒溫水浴鍋兩個小時直到組織完全被消化； (3) 在離心管中加入350 μ 1的氯仿：異戊醇（24:1)緩慢混勻，在室溫，10, 000轉(zhuǎn)速下 離心2min，并小心的將上清液轉(zhuǎn)移到新的干凈的I. 5ml離心管中； (4) 加入1倍體積的的BufferBL與5μ 1的RNaseA，緩慢混勻，70°C水浴半小時； (5) 室溫下加入1倍體積的無水乙醇，緩慢混勻； (6) 將前一步的溶液和絮狀沉淀700μ加入吸附柱內(nèi)，吸附柱安放于收集管內(nèi)， 10, OOOxg室溫下離心lmin，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)；如此時仍有剩余混合液 則重復第6步； (7) 將吸附柱重新置于新的收集管內(nèi)，加入500μ 1的BufferKB，10, OOOxg室溫下離心 30s，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內(nèi)； (8) 加入600 μ 1的DNAWashBuffer，10, OOOxg離心30s，移除廢液，吸附柱重新置于收 集管內(nèi)； (9) 重復第8步，將吸附柱置于新的收集管內(nèi)，在吸附柱的蓋子打開的條件下， 13, OOOsg室溫離心2min，后置于室溫下數(shù)分鐘，使酒精充分揮發(fā)； (10) 將吸附柱置于新的I. 5ml離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入30 μ 1的Elution Buffer, Elution Buffer在60°C-70°C條件下預熱，室溫放置2分鐘，在13, OOOxg下離心 2min ； (11) 重復第10步，以便提高產(chǎn)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟二及步驟三中，PCR擴增反 應體系為：使用G〇Taq? GreenMaster Mix試劑盒，總體系為25μ 1，包括：2XG0 Taq GreenMaster Mix 12. 5 μ 1、兩種引物各 1 μ 1、DNA 模板 1. 5 μ UddH2O 9 μ 1。
【文檔編號】C12N15/11GK104232634SQ201410498011
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】陶靜, 駱有慶, 任利利, 石娟 申請人:北京林業(yè)大學