一種楊干象特異性ss-coⅰ引物對及快速分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種楊干象特異性SS-CO Ⅰ引物對及快速分子檢測方法，構建楊干象的快速分子鑒定體系。是一種快速穩(wěn)定、不受蟲態(tài)限制、簡單易行的楊干象檢測技術，可廣泛應用于基層檢驗檢疫及相關部門對楊干象的鑒定。本發(fā)明利用分子生物學手段，在短時間內快速、準確地進行我國重大林業(yè)檢疫性害蟲楊干象的鑒定，特別是除成蟲以外其它蟲態(tài)(卵、幼蟲和蛹)的鑒定，該發(fā)明可用于國內外楊樹苗木調運、帶皮原木制品、木質包裝材料等運輸中楊干象的快速檢測。
【專利說明】-種楊干象特異性SS-CO I引物對及快速分子檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子檢測領域，特別涉及一種楊干象特異性SS-C0 I引物對及快速分 子檢測方法。

【背景技術】
[0002] 楊干象 Cryptorrhynchus lapathi (Linnaeus),屬鞘翅目 Coleoptera 象甲科 Curculionidae、隱_象亞科Cruptorrhynchinae、隱_象屬 Cryptorrhynchus?，F(xiàn)為全國林 業(yè)檢疫性有害生物。該蟲主要以幼蟲蛀食楊樹和旱柳等楊柳科樹木的干部危害，成蟲取食 幼樹的嫩枝和葉片作為營養(yǎng)補充，常導致受害樹木長勢衰弱，受害部位枯死，最后導致整株 死亡。同時，由于幼蟲在木材中蛀食所形成的蛀道，嚴重影響了其使用價值（艾云艷，2007 ; 李亞杰等，1981)。隨著我國楊樹引種和造林事業(yè)的發(fā)展，目前該蟲的分布與危害有與日俱 增的趨勢，嚴重威脅著楊樹人工林和三北防護林生態(tài)系統(tǒng)工程和建設和鞏固。因此，有效控 制該蟲的發(fā)生和蔓延，對于保障我國三北地區(qū)的生態(tài)環(huán)境建設和經(jīng)濟發(fā)展具有非常重要的 意義。
[0003] 據(jù)1999-2001年全國森林植物檢疫對象普查資料結果，楊干象國內分布于黑龍 江、吉林、遼寧、河北、內蒙古、甘肅、新疆。全國發(fā)生面積14. 18萬hm2。該蟲本身不傳帶其 它有害生物，自然擴散靠成蟲爬行，遠距離傳播主要是靠人為調運攜帶有該蟲的苗木和無 性系株或新采伐的帶皮原木。所以傳播擴散的可能很大。資料顯示，楊干象被朝鮮、德國、 法國、加拿大、捷克、美國、俄羅斯、日本、斯洛伐克、意大利、英國等國家列為檢疫性及危險 性病蟲名單，我國進境植物檢疫將其列為《寄主和檢疫性或危險性病蟲名單》。在我國極 具潛在的經(jīng)濟危害性。
[0004] 2009年，國家林業(yè)局森林病蟲害防治總站頒布了《楊干象檢疫技術規(guī)程》，規(guī)定對 于楊樹國際貿易或國內調運，應盡量在非疫區(qū)進行；對于從楊干象發(fā)生地區(qū)外運的楊樹苗 木和無性系株或新采伐的帶皮原木要嚴格檢查是否帶蟲；根據(jù)外部癥狀進行鑒定，確認無 疫情發(fā)生時，簽發(fā)植物檢疫證書后調運。并對楊干象的形態(tài)特征和危害狀進行了描述。
[0005] 然而，為了將楊干象與我國同域發(fā)生的近緣種象甲區(qū)分開來，需要大量形態(tài)學鑒 別工作，這些工作大多費時、費力且需要專業(yè)的昆蟲分類學知識。同時，處于卵、幼蟲、蛹這 三個蟲態(tài)的象甲類昆蟲在形態(tài)上非常相似，目前還沒有可靠的鑒定特征。
[0006] 現(xiàn)有技術主要依靠楊干象成蟲的形態(tài)學特征進行鑒定，而卵、幼蟲和蛹這三個蟲 態(tài)則很難進行準確鑒定。因此，在實際工作中需要將非成蟲蟲態(tài)的楊干象飼養(yǎng)至成蟲才能 進行鑒定，而楊干象飼養(yǎng)難度大且耗時長；同時，與楊干象同科的其它象甲種類，特別是近 緣種在卵、幼蟲、蛹和成蟲的形態(tài)特征上非常相似，難以用形態(tài)學方法進行分類鑒別。另外， 在實際鑒定中，通常由專門從事象甲分類的專業(yè)人員進行鑒定，而基層的檢驗人員大都不 具備這方面的能力，無法滿足實際檢疫工作需要。
[0007] 近些年，越來越多的研究已證明分子生物學手段能夠為昆蟲鑒定提供有力依據(jù)。 線粒體DNA嚴格母性遺傳，其中的細胞色素氧化酶I基因（C0I)具有高度保守，結構穩(wěn)定， 無內含子的特點（Simon等，1994)。因此，經(jīng)常被用于物種分類、鑒定和親緣關系的研究 (Caterino 等，2000 ;Herbert 等，2003)。


【發(fā)明內容】

[0008] 為解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種楊干象特異性 SS-C0 I引物對及快速分子檢測方法，基于C0I基因設計楊干象的種特異性引物，構建楊干 象的快速分子鑒定體系。是一種快速穩(wěn)定、不受蟲態(tài)限制、簡單易行的楊干象檢測技術，可 廣泛應用于基層檢驗檢疫及相關部門對楊干象的鑒定。
[0009] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0010] 一種楊干象特異性SS-CO I引物1對（CLSSF1/CLSSR1):
[0011] CLSSF1 :5' -CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3'
[0012] CLSSR1 :5, -TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3'
[0013] 一種楊干象快速分子檢測的方法，包括如下步驟：
[0014] 步驟一、昆蟲基因組DNA的提??；
[0015] 步驟二、象甲C0 I基因序列的擴增；
[0016] 步驟三、近緣種多重序列對比及種特異性引物設計
[0017] 將PCR產(chǎn)物送諾賽生物（北京）公司進行雙向測序，得到CO I序列。使用DNAstar 對序列進行拼接，去除冗余序列，將序列結果在GeneBank中進行Blast序列比對。根據(jù)9 種象甲的測序結果以及數(shù)據(jù)庫中已公開的4種象甲的堿基序列進行對比分析，運用軟件 Primer Primer5. 0軟件設計楊干象特異性SS-CO I引物1對（CLSSF1/CLSSR1):
[0018] CLSSF1 :5, -CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3，
[0019] CLSSR1 :5, -TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3'
[0020] 步驟四、楊干象SS-CO I引物的種特異性引物擴增體系的建立優(yōu)化
[0021] PCR擴增反應使用G〇Taq? GreenMaster Mix試劑盒（Promega)，反應體系與C0 I基因序列擴增體系相同（見表1)。擴增的程序為：94°C預變性2min，94°C變性30s，50°C 復性45s，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C延伸10min。每次反應用無菌蒸餾水做一個 空白對照，用以排除系統(tǒng)誤差。取3μ 1產(chǎn)物上樣到1. 5% TAE瓊脂糖凝膠上；經(jīng)130V電泳 20min后，將膠塊浸泡于ΕΒ染料中3min，在紫外分光光度計下檢測拍照。
[0022] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明鑒定方法快速穩(wěn)定，對操作人員的 專業(yè)技術能力要求較低，無需掌握楊干象的形態(tài)鑒別特征，同時，不受其蟲態(tài)限制。可廣泛 應用于基層的檢驗檢疫及相關部門。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1瓊脂糖凝膠電泳檢測九種象甲PCR擴增產(chǎn)物的檢測圖：a. CO I通用引物擴增 產(chǎn)物電泳圖；b.楊干象特異性SS-CO I引物擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0024] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道： 1_ 楊干象 Cryptorrhynchus lapathi，2-紅掠象甲 Rhynchophorus. ferrugineus，3-溝眶 象 Eucryptorrhynchus. chinensis, 4-臭椿溝眶象 Eucryptorrhynchus brandti, 5-芒果果 核象甲 Odoiporus. longicollis，6-香蕉球莖象甲 Cryptorrhynchus. lapathi, 7-馬尾松 角胚象 Shirahoshizo patruelis，8_ 玉米象 Sitophilus zeamais，9_ 松瘤象 Hyposipalus gigas，10-陰性對照。
[0025] 圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測楊干象種特異性引物的靈敏度
[0026] 圖注：M :DL2000 DNA marker (從上至下 2, 000, 1000, 750, 500, 250, 100bp);泳道 1-6分別代表：20ng，2ng，200pg，20pg，2pg和200fg的楊干象基因組DNA，泳道7-陰性對照。

【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明方案做進一步詳細描述：
[0028] 試驗例1
[0029] 1.昆蟲基因組DNA的提取
[0030] 基因組 DNA 提取都采用 BI0MIGA 公司的 EZgene? Insect gDNA Kit (⑶2413-02) 試劑盒。
[0031] 具體操作步驟：
[0032] (1)將在純酒精中浸泡的標本用超聲波儀器清洗干凈晾干后，成蟲去頭和鞘翅，幼 蟲取其腹部組織。取< 50mg的組織于研缽中充分研磨，置于1. 5ml的離心管中。
[0033] (2)向離心管中加入350ul的Buffer ITL與25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混 勻后置于60°C恒溫水浴鍋兩個小時直到組織完全被消化。
[0034] (3)在離心管中加入350 μ 1的氯仿：異戊醇（24:1)緩慢混勻，在室溫，10, 000轉 速下離心2min，并小心的將上清液轉移到新的干凈的1. 5ml離心管中。
[0035] (4)加入1倍體積的的BufferBL與5 μ 1的RNaseA，緩慢混勻，70°C水浴半小時。
[0036] (5)加入1倍體積的無水乙醇（室溫），緩慢混勻。
[0037] (6)將前一步的溶液和絮狀沉淀700 μ加入吸附柱內（吸附柱安放于收集管內）， 10, 000xg室溫下離心lmin，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內。如此時仍有剩余混合液 則重復第6步。
[0038] (7)將吸附柱重新置于新的收集管內，加入500 μ 1的BufferKB，10, 000xg室溫下 離心30s，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內。
[0039] (8)加入600 μ 1的DNAWashBuffer，10, 000xg離心30s，移除廢液，吸附柱重新置 于收集管內。
[0040] (9)重復第8步，將吸附柱置于新的收集管內，在吸附柱的蓋子打開的條件下， 13, 000sg室溫離心2min，后置于室溫下數(shù)分鐘，使酒精充分揮發(fā)。
[0041] (10)將吸附柱置于新的1. 5ml離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入30μ 1的 Elution Buffer,Elution Buffer 在60°C-70°C條件下預熱，室溫放置 2 分鐘，在 13, OOOxg 下離心2min。
[0042] (11)重復第10步，以便提高產(chǎn)量。
[0043] 2.象甲CO I基因序列的擴增
[0044] 根據(jù)文獻報道，合成象甲類昆蟲C0 I基因序列擴增通用引物：
[0045] Cl-J-2183:5' -CAA CAT TTA TTT TGA TTT TTT GG-3'，
[0046] TL-2-N-3014 :5, -TCC ATT GCA CTA TAC TGC CAT ATT A-3'
[0047] PCR擴增反應使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒（Promega)，總體系為 25 μ 1，各成分如表1所不：
[0048] 表1 PCR反應體系
[0049]

【權利要求】
1. 一種楊干象特異性SS-CO I引物對，其序列如下： CLSSFl :5' -CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3' CLSSRl :5' -TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3'。
2. -種楊干象快速分子檢測的方法，其特征在于，利用權利要求1所述的楊干象特異 性SS-CO I引物對楊干象及其他與楊干象同域發(fā)生和同屬近緣的象甲類昆蟲DNA進行PCR 擴增，以特異性檢測楊干象品種。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、昆蟲基因組DNA的提??； 步驟二、象甲CO I基因序列的擴增； 步驟三、近緣種多重序列對比及種特異性引物設計； 將PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到CO I序列，使用DNAstar對序列進行拼接，去除冗余 序列，將序列結果在GeneBank中進行Blast序列比對，根據(jù)9種象甲的測序結果以及數(shù)據(jù) 庫中已公開的4種象甲的堿基序列進行對比分析，設計楊干象特異性SS-CO I引物1對 CLSSF1/CLSSR1 ： CLSSFl :5' -CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3' CLSSRl :5' -TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3' ； 步驟四、楊干象SS-CO I引物的種特異性引物擴增體系的建立優(yōu)化： PCR擴增反應使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒，反應體系與CO I基因序列擴 增體系相同，擴增的程序為：94°C預變性2min，94°C變性30s，50°C復性45s，72°C延伸2min， 30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，每次反應用無菌蒸餾水做一個空白對照，用以排除系統(tǒng)誤 差，取3 μ 1產(chǎn)物上樣到I. 5% TAE瓊脂糖凝膠上；經(jīng)130V電泳20min后，將膠塊浸泡于EB 染料中3min，在紫外分光光度計下檢測拍照。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟一的具體操作為： (1) 將在純酒精中浸泡的標本用超聲波儀器清洗干凈晾干后，成蟲去頭和鞘翅，幼蟲取 其腹部組織，取< 50mg的組織于研缽中充分研磨，置于I. 5ml的離心管中； (2) 向離心管中加入350ul的Buffer ITL與25ul濃度為25mg/ml的蛋白酶K，充分混 勻后置于60°C恒溫水浴鍋兩個小時直到組織完全被消化； (3) 在離心管中加入350 μ 1的氯仿：異戊醇為24:1混合物緩慢混勻，在室溫，10, 000 轉速下離心2min，并小心的將上清液轉移到新的干凈的I. 5ml離心管中； (4) 加入1倍體積的的BufferBL與5μ 1的RNaseA，緩慢混勻，70°C水浴半小時； (5) 室溫下加入1倍體積的無水乙醇，緩慢混勻； (6) 將前一步的溶液和絮狀沉淀700μ加入吸附柱內，吸附柱安放于收集管內， 10, OOOxg室溫下離心lmin，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內，如此時仍有剩余混合液 則重復第6步； (7) 將吸附柱重新置于新的收集管內，加入500μ 1的BufferKB，10, OOOxg室溫下離心 30s，移除廢液，吸附柱重新置于收集管內； (8) 加入600 μ 1的DNAWashBuffer，10, OOOxg離心30s，移除廢液，吸附柱重新置于收 集管內； (9) 重復第8步，將吸附柱置于新的收集管內，在吸附柱的蓋子打開的條件下， 13, OOOsg室溫離心2min，后置于室溫下數(shù)分鐘，使酒精充分揮發(fā)； (10) 將吸附柱置于新的I. 5ml離心管中，向吸附柱中間部位懸空加入30 μ 1的Elution Buffer, Elution Buffer在60°C-70°C條件下預熱，室溫放置2分鐘，在13, OOOxg下離心 2min。
5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟二及步驟三中，PCR擴增反 應體系為：使用GoTaq? GreenMaster Mix試劑盒，總體系為25μ 1，包括：2XG0 Taq GreenMaster Mix 12. 5 μ 1、兩種引物各 1 μ 1、DNA 模板 1. 5 μ UddH2O 9 μ 1。
6. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟四中，PCR檢驗的最小檢測限度 為200pg的基因組DNA。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232633SQ201410497624
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權日:2014年9月25日
【發(fā)明者】陶靜, 宗世祥, 駱有慶, 王琰程, 張璐 申請人:北京林業(yè)大學