牛輪狀病毒重組vp7蛋白抗原及其制備方法
【專利摘要】牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原及其制備方法，涉及一種蛋白抗原及其制備方法。本發(fā)明為了解決現(xiàn)有的牛輪狀病毒檢測方法不能同時滿足設備及操作簡單、特異性好、可大規(guī)模臨床普及的問題。牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原由644bp堿基編碼，大小為40kDa。方法：一、提取牛輪狀病毒BRV-DQ株的基因組RNA;二、反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增，純化后與pMD18-T載體連接，得pMD18-T-VP7質(zhì)粒;三、對pMD18-T-VP7和pET30a雙酶切，連接，轉(zhuǎn)入宿主菌，得重組菌pET30a-VP7/BL21;四、重組蛋白的誘導表達；五、重組蛋白的純化，即得到牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原。用于牛輪狀病毒檢測領域。
【專利說明】牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白抗原及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 牛輪狀病毒（Rotavirus, RV)屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae)輪狀病毒屬 (Rotavirus)，是犢牛非細菌性腹瀉的主要病原之一。牛輪狀病毒于1968年首次被Mebus 等人發(fā)現(xiàn)并證明為新生牛犢腹瀉的病原，命名為NCDV株（NebraskacalfdiarrheaVirus, NCDV)。該病毒可引起動物精神沉郁、水樣腹瀉、酸中毒以及食欲廢絕，多感染15-45日齡犢 牛。1980年，我國首次在水牛、黃牛腹瀉糞便中檢出輪狀病毒，證明該病毒在我國的存在。 隨后也出現(xiàn)大量犢牛病毒性腹瀉的報道。牛輪狀病毒流行廣、發(fā)病率1?且對犢牛有較大危 害，己成為一種世界性疾病。若繼發(fā)其它疾病,死亡率會大大增加,給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的 經(jīng)濟損失。
[0003] 牛輪狀病毒的傳統(tǒng)診斷方法如細胞分離方法，由于除A型牛輪狀病毒外，其它牛 輪狀病毒的許多毒株迄今未能適應細胞培養(yǎng)，分離的成功率約在40% -70%。由于此方法 操作繁瑣，需特殊的培養(yǎng)條件及工藝，分離周期較長，費用較高，故并不適合作為廣范的臨 床檢測和診斷方法；電鏡技術，此方法雖為檢測該病原的"金標準"，但由于電鏡法所需實驗 要求比較嚴格還需專門設備和人才，并不適宜應用于大規(guī)模樣品檢測，而且糞便中病毒粒 子是否破碎，形態(tài)是否完全或數(shù)量是否足夠等方面均會影響電鏡結果；現(xiàn)代分子檢測手段 如聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)，該方法特異性強，不僅可用于檢測牛輪狀病毒，而且還能夠 鑒別牛輪狀病毒的種群。PAGE作為BRV鑒定方法，不需特殊的設備及操作簡單，可用于大 量樣品的同時檢測。其不足主要由于病毒的RNA較易被空氣或藥品中的RNA酶降解，使結 果不準確，出現(xiàn)假陰性；BRV經(jīng)典的PCR檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)，牛A群輪狀病毒常 以其結構蛋白VP7各型別均保守的2段核苷酸序列為引物，快速，特異的對病毒進行鑒別， 但由于RNA的提取過程復雜且易污染，更適于實驗室診斷，對于大規(guī)模的臨床普及，仍有難 度；血清學檢測方法無疑是臨床檢測中較為理想的診斷手段，其中ELISA診斷方法無需昂 貴的儀器設備，成本低，靈敏性及特異性高，無放射性污染等優(yōu)點，易于在基層推廣，而以表 達衣殼蛋白建立的間接ELISA方法，又具有克服抗原排毒、散毒潛在危險的優(yōu)勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服上述問題，提供一種牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原及其制備方 法。
[0005] 本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原由644bp堿基編碼，大小為40kDa，堿基序列 如序列表中SEQIDN0 :1所示。
[0006] 本發(fā)明牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原的制備方法，按以下步驟進行：
[0007] 一、提取牛輪狀病毒BRV-DQ株的基因組RNA ;二、將步驟一獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，使用上游引物Pl和下游引物P2對cDNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后 與PMD18-T載體進行連接，獲得pMD18-T-VP7質(zhì)粒；三、對pMD18-T-VP7質(zhì)粒和表達載體 pET30a均采用Nco I和Hind III雙酶切，然后通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌 BL21，得到重組菌pET30a-VP7/BL21 ;四、重組蛋白的誘導表達；五、重組蛋白的純化，即得 到牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原。
[0008] 步驟二中上游引物 P1 為 5 ' -AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT-3 '，下游引物 P2 為 5' -CGCAAGCTTTTATTCCCTTGGCCCCAAT-3'。
[0009] 隨著現(xiàn)代分子免疫學和分子生物學等先進技術的開發(fā)利用，為新一代生物工程診 斷試劑的研制開發(fā)開辟了新途徑。以基因工程、細胞工程等先進的技術手段獲得的診斷抗 原或抗體，其突出特點在于均一性好，純度高，特異性強，性能穩(wěn)定，并易于保存和批量生 產(chǎn)，由此建立診斷技術和方法易于國際標準化，是未來疫病診斷發(fā)展的主要方向。同時，以 生物技術生產(chǎn)的診斷抗原，可避免繁瑣的細胞培養(yǎng)來制備大量的抗原物質(zhì)。
[0010] BRVVP7蛋白由326個氨基酸組成，分子量為37kDa，占輪狀病毒蛋白總量的30%， 是病毒結構蛋白含量中第二多的，為病毒的外衣殼蛋白，VP7是輪狀病毒的主要中和抗原， 決定其G血清型，能夠誘導病毒中和抗體，能夠激發(fā)較強的免疫應答，因此對外衣殼蛋白 VP7基因的進行克隆、表達及其表達產(chǎn)物純化。其純化的蛋白產(chǎn)物，無論是作為一種疾病的 診斷抗原，還是作為一種激發(fā)機體免疫應答的免疫制劑，均是極為有用的新型生物制劑。這 制劑的進一步應用，將對BRV的診斷與防治提供重要的物質(zhì)基礎。
[0011] 本發(fā)明制備的重組BRVVP7蛋白具有與天然的VP7蛋白相近的免疫生物學技術特 性，而且可以規(guī)?；a(chǎn)，該方法避免采取體外培養(yǎng)病毒抗原、差速離心和密度梯度離心純 化病毒的生產(chǎn)方法，提高了工作效率，減少了非特異性反應。以此生產(chǎn)的抗原，可避免以活 病毒做抗原散播病毒的危險。
[0012] 以純化的原核表達的牛輪狀病毒VP7蛋白為包被抗原，建立檢測牛輪狀病毒抗體 的間接ELISA診斷方法，利用建立的間接ELISA方法與病毒中和試驗同時檢測牛血清，VP7 蛋白ELISA方法與病毒中和試驗的符合率達87. 2%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為【具體實施方式】一步驟二中PCR擴增結果的電泳圖；圖2為對【具體實施方式】 一步驟二獲得重組質(zhì)粒PMD18-T-VP7進行酶切鑒定的結果圖；圖3為【具體實施方式】一步驟 五純化后的重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；圖4為【具體實施方式】一重組蛋白的Western Blot 鑒定結果。

【具體實施方式】

【具體實施方式】 [0014] 一：本實施方式牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原的制備方法，按以下 步驟進行：
[0015] 一、牛輪狀病毒BRV-DQ株基因組RNA的提?。?br> [0016] 牛輪狀病毒BRV-DQ株經(jīng)過Trizol的裂解后，加入2倍體積的氯仿和2倍體積的 異丙醇抽提，加入2. 5倍的無水乙醇沉淀核酸，再用體積百分比濃度為70%的冰乙醇洗滌 沉淀，室溫干燥后，加適量無菌去離子水溶解沉淀，得到BRV-DQ株基因組RNA，-20°C保存?zhèn)?用。
[0017] 所述牛輪狀病毒BRV-DQ株為DQ-75,已在文章《新生牛輪狀病毒的分離及其基因 型鑒定》（謝金鑫等，黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2010年10月，第22卷第5期）中公開，可 由文章作者處獲得。
[0018] 二、RT-PCR 擴增 VP7 基因：
[0019] 將步驟一獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟按反轉(zhuǎn)錄酶的說明書進行（所述反 轉(zhuǎn)錄酶購買自Promega公司）。獲得的cDNA的核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示，使用上游引 物Pl和下游引物P2對cDNA進行PCR擴增，按照TaqDNA聚合酶的說明書進行（所述TaqDNA 聚合酶購買自Fermentas公司）。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD18-T載體進行連 接，獲得重組質(zhì)粒PMD18-T-VP7。
[0020] 步驟二中上游引物 P1 為 5 ' -AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT-3 '，下游引物 P2 為 5' -CGCAAGCTTTTATTCCCTTGGCCCCAAT-3'。
[0021] 三、對pMD18-T-VP7質(zhì)粒和表達載體pET30a均采用NcoI和HindIII雙酶切，然 后通過T4DNA連接酶連接，連接反應按T4DNA連接酶的說明書進行，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌 BL21，測序正確的菌即為陽性重組菌pET30a-VP7/BL21。
[0022] 四、蛋白誘導表達：
[0023] 將50 μ L重組菌pET30a-VP7/BL21的菌液接種于5mL含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后取100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液接種于IOmL含Kan+的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C以200rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值為0. 6?0. 7時，取樣ImL作為誘導前對照。然后， 加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)以200rpm振蕩培養(yǎng)，分別在2h、3h、4h、5h和6h取樣lmL。 于12000rpm離心lmin，收集菌體沉淀，加入50 μ L0. Olmol/LPBS，加入等量2 X SDS加樣緩 沖液重懸沉淀，l〇〇°C煮沸5min，用12%的SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測表達情況。
[0024] 五、重組蛋白的純化：
[0025] (1)向組菌pET30a-VP7/BL21的菌液中加入IPTG至終濃度lmmol/L，以200rpm振 蕩培養(yǎng)，當菌液的0D600值達到0. 6時，8000rpm離心IOmin收集菌體；
[0026] (2)棄去上清，每克濕菌加3mL滅菌的去離子水，懸浮混勻后加入3 μ L50mmol/L的 蛋白酶抑制劑（購買自Amresco公司）和80 μ L溶菌酶，于室溫在水平搖床緩慢搖動15min。
[0027] (3)用超聲波破碎菌體，功率400W，破碎6s，間隔6s，重復100次，然后以12000rpm 離心lOmin，收集沉淀。
[0028] (4)向沉淀中加入ImL滅菌去離子水和等體積2 X SDS加樣緩沖液，煮沸5min。
[0029] (5) 12000rpm離心10min，取上清全部上樣，做不連續(xù)垂直電泳，開始的時候電壓 為100V，當染料到分離膠后電壓升到200V，直到染料跑出分離膠為止。
[0030] (6)取下凝膠置于冰冷的0. 25M的KCl溶液中5min，待凝膠帶顯色后，用手術刀片 切下含有目的帶的凝膠。
[0031] (7)將切下的凝膠放入透析袋中，加入3mLTris-甘氨酸電泳緩沖液，80V水平電泳 2h，然后再將透析袋反向電泳2min。
[0032] (8)用0· Olmol/LPBS緩沖液對洗脫的蛋白于4°C透析，用PEG20000濃縮蛋白，用 基因定量儀測定其濃度，取20 μ L蛋白進行SDS-PAGE電泳，其余于-70°c凍存?zhèn)溆谩?br> [0033] 六、重組蛋白的WesternBlot鑒定：
[0034] 先進行SDS-PAGE電泳后,然后使用半干式電轉(zhuǎn)印儀進行蛋白質(zhì)免疫印跡反應,將 蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上進行Westernblot分析，其具體步驟如下：
[0035] (1)轉(zhuǎn)膜：在半干式電轉(zhuǎn)印儀的陰極板上依次放置下物：浸過轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙3 張、凝膠、硝酸纖維素膜、浸過轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙3張，盡可能的排盡氣泡，蓋上陽極蓋，恒 壓9V，通電lh，
[0036] (2)封閉：將NC膜放入平皿中，根據(jù)濾膜面積以0. lmL/cm2量加入封閉液，排盡氣 泡，然后密閉平皿，在水平搖床上緩緩搖動，室溫封閉2h或4°C過夜。
[0037] (3)洗滌：PBST在搖床上洗3遍，每次lOmin。
[0038] (4)抗體的結合：用封閉液將一抗按適當比例稀釋，將已封閉好的膜置于抗體溶 液中，排盡氣泡，室溫搖動2h或4°C過夜。
[0039] (5)洗滌：PBST在搖床上洗3遍，每次lOmin。
[0040] (6)二抗的結合：用封閉液將HRP標記的兔抗牛IgG按一定比例稀釋，將已封閉的 膜置抗體溶液中，室溫搖動Ih。
[0041] (7)洗滌：PBST在搖床上洗3遍，每次lOmin。
[0042] (8)顯色：加入DAB后進行顯色。
[0043] (9)終止反應：當NC膜有顏色條帶出現(xiàn)時，充分顯色5?lOmin，將膜轉(zhuǎn)移至去離 子水中終止顯色反應，以免背景顏色過高。
[0044] (10)膜置濾紙上干燥，分析結果。
[0045] 步驟二中PCR擴增結果的電泳圖如圖1所示，其中M為DNA標準DL2000，1、2為表 達產(chǎn)物。
[0046] 對步驟二獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-VP7進行酶切鑒定，如圖2所示，其中M為DNA標 準DL2000，1為酶切產(chǎn)物。
[0047] 步驟五純化后的重組蛋白的SDS-PAGE電泳如圖3所示，其中M為蛋白質(zhì)分子 質(zhì)量標準，1為誘導前的pET-30a+VP7, 2為誘導5h的pET-30a空載體，3為誘導5h的 pET-30a+VP7〇
[0048] 重組蛋白的WesternBlot鑒定結果如圖4所示，其中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準，1 為誘導的空載體對照；2為誘導后產(chǎn)物。
[0049] 以上實驗結果證明本發(fā)明方法獲得了牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原。
[0050] 以純化的原核表達的牛輪狀病毒VP7蛋白為包被抗原，建立檢測牛輪狀病毒抗體 的間接ELISA診斷方法，利用建立的間接ELISA方法與病毒中和試驗同時檢測78份牛血 清，檢測結果見表1，所檢血清ELISA陽性為47份，陰性31份；中和試驗陽性41份，陰性37 份。VP7蛋白ELISA方法與病毒中和試驗的符合率達87. 2%。
[0051] 表 1
[0052]

【權利要求】
1. 牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原，其特征在于該牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原由 644bp喊基編碼，大小為40kDa，喊基序列如序列表中SEQIDNO :1所不。
2. 權利要求1所述的牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原的制備方法，其特征在于該方法按 以下步驟進行： 一、提取牛輪狀病毒BRV-DQ株的基因組RNA ;二、將步驟一獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 使用上游引物Pl和下游引物P2對cDNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與 pMD 18-T載體進行連接，獲得pMD 18-T-VP7質(zhì)粒；三、對pMD 18-T-VP7質(zhì)粒和表達載體 pET30a均采用Nco I和Hind III雙酶切，然后通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌 BL21，得到重組菌pET30a-VP7/BL21 ;四、重組蛋白的誘導表達；五、重組蛋白的純化，即得 到牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原。
3. 根據(jù)權利要求2所述的牛輪狀病毒重組VP7蛋白抗原的制備方法，其特征在于步驟 二中上游引物 Pl 為 5' -AGGCCATGGATGCACAAAACTACGGTAT-3'，下游引物 P2 為 5' -CGCAAGCT TTTATTCCCTTGGCCCCAAT-3'。
【文檔編號】C12N15/46GK104211786SQ201410461064
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權日:2014年9月11日
【發(fā)明者】侯美如, 高俊峰, 侯喜林 申請人:黑龍江省獸醫(yī)科學研究所, 侯喜林