一種檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，具體步驟包括：（A）提取廢水系統(tǒng)活性污泥中微生物的全部基因組DNA；（B）以全部基因組DNA為模板，以序列號為SEQIDNo.1的amoA1F和序列號為SEQIDNo.2的amoA2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（C）以羅氏454焦磷酸測序法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，對測序結(jié)果運(yùn)用Mothur程序劃分操作分類單元，選擇操作分類單元中具有99%相似度的代表性序列與數(shù)據(jù)庫GenBank中公開序列進(jìn)行在線BLASTn比對，根據(jù)比對結(jié)果劃分系統(tǒng)進(jìn)化樹，得到氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)分布和豐度；本發(fā)明操作簡單、成本低廉、檢測迅速、序列分析準(zhǔn)確度高，能夠定性分析氨氧化菌的不同群落結(jié)構(gòu)組成，定量分析氨氧化菌不同種屬的豐度，并且可同時(shí)對多個(gè)樣品分析，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，易于推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種檢測分析廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和 豐度的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生活水平的提高和工業(yè)的迅速發(fā)展，廢水排放量逐漸升高，廢水中氮含量逐 年上升，如何能有效去除廢水中的氮，是降低廢水氮元素污染，減輕水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵措 施，現(xiàn)階段，針對廢水脫氮過程中脫氮微生物的研究逐漸成為熱點(diǎn)，廢水生物脫氮系統(tǒng)主要 包括硝化和反硝化過程，其中硝化過程主要微生物為硝化菌，包括氧化氨鹽為亞硝酸鹽的 氨氧化菌和氧化亞硝酸鹽為硝酸鹽的亞硝酸鹽氧化菌，氨氧化菌是廢水生物脫氮過程中的 關(guān)鍵微生物，決定著廢水中亞硝酸鹽的含量和濃度，直接影響后續(xù)硝化反硝化、短程硝化反 硝化等過程的效率，是生物脫氮過程的第一環(huán)節(jié)，也是關(guān)鍵步驟，氨氧化菌在廢水生物處理 系統(tǒng)中群落結(jié)構(gòu)和種屬豐度是保證廢水生物脫氮能力長期穩(wěn)定的首要條件，是影響廢水處 理系統(tǒng)出水氨氮濃度的關(guān)鍵因素。
[0003] 在廢水生物系統(tǒng)中，微生物菌群是由多種微生物構(gòu)成、具有一定空間分布的聚集 體，這些微生物相互依存、相互競爭，具有復(fù)雜的種群關(guān)系，當(dāng)進(jìn)行菌種分離培養(yǎng)后，將無法 獲取自然條件下微生物菌群結(jié)構(gòu)與空間分布的信息，其次，由于微生物的基因表達(dá)和代謝 活性受外界環(huán)境因素的影響較大，菌種的分離培養(yǎng)將會改變微生物的生理生化特性，從而 降低對實(shí)際工程實(shí)踐的指導(dǎo)意義。此外，純培養(yǎng)需要較長的時(shí)間，而且有些菌種（如硝化菌 中的Nitrospira)目前還無法通過純培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)純種分離，即無法進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此 分子生物學(xué)的分析方法成為大部分功能菌群的研究手段，如變性梯度凝膠電泳（DGGE)、熒 光原位雜交（FISH)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real time Q-PCR)等均為研究分析廢水生物系統(tǒng) 活性污泥群落結(jié)構(gòu)的常用手段。
[0004]目前，DGGE分析方法是對氨氧化菌的定性分析主要手段，如《污水人工快速滲濾 系統(tǒng)中氨氧化菌16S rDNA的DGGE分析》（馬鳴超等，高校地質(zhì)學(xué)報(bào)，2〇〇7年第13卷第4 期）中章根據(jù)DGGE圖譜中條帶數(shù)量和變化，定性分析了污水處理系統(tǒng)中氨氧化菌的群落結(jié) 構(gòu)組成，但其在氨氧化菌的定性分析中，采用的DGGE技術(shù)無法確定氨氧化菌群落中具體種 屬，分析過程存在很大偏差，難以準(zhǔn)確分析氨氧化菌的不同群落結(jié)構(gòu)組成。
[0005] 此外，針對氨氧化菌的定量分析主要是FISH技術(shù)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，其中， FISH技術(shù)是運(yùn)用與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針和核酸進(jìn)行堿基配對雜交，然后通過熒光 系統(tǒng)檢測對樣品DNA定量分析，如《0LAND生物脫氮系統(tǒng)運(yùn)行及其硝化菌群的分子生物學(xué)檢 測》（張丹等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)報(bào)， 2〇03年第9卷第5期）一文運(yùn)用FISH技術(shù)定量分析 氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)組成變化，但FISH技術(shù)存在對探針要求高、操作復(fù)雜，對短鏈 cDNA探 針效率明顯下降，無法達(dá)到100%的雜交效率等缺點(diǎn)，難以對全部的氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)組成 做定量分析。
[0006] 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在經(jīng)熱循環(huán)后檢測炎 光累積量，再與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對來定量分析樣品DNA，專利號為CN 2〇111〇3〇5190.4,發(fā)明名 稱"活性污泥中氨氧化菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法" 一文中，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定 量檢測氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)雖然應(yīng)用于氨氧化菌的分析，但是該 技術(shù)操作難度大，需要制備標(biāo)準(zhǔn)品DNA，在DNA定量分析中標(biāo)準(zhǔn)曲線不統(tǒng)一，結(jié)果可比性差， 且實(shí)驗(yàn)成本較高，難以對氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)做可靠、快速的定量檢測分析。
[0007] 由于以上不同分析技術(shù)存在各自的缺點(diǎn)，提供一種簡單、快速、有效檢測廢水處理 系統(tǒng)中氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)檢測豐度變化的方法，一直是本領(lǐng)域亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對上述問題，提供檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)分布和豐度的方法，可以 實(shí)現(xiàn)簡單、快速檢測廢水生物處理系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和種屬豐度檢測分析，本發(fā)明 是這樣實(shí)現(xiàn)的： 一種檢測分析廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，具體步驟如下： Α)提取廢水生物處理系統(tǒng)活性污泥中微生物的全部基因組DNA ; B) PCR擴(kuò)增，以全部基因組DNA為模板，以序列號為SEQ ID No. 1的amoAlF和序列號 為SEQ ID No. 2的amoA2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0009] c)以羅氏454焦磷酸測序技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用Mothur程 序拆分、降噪和去嵌合體，并劃分操作分類單元（OTUs)。選擇操作分類單元（OTUs)中具有 99%相似度的代表性序列與數(shù)據(jù)庫GenBank中公開序列進(jìn)行在線BLASTn比對，根據(jù)比對結(jié) 果劃分系統(tǒng)進(jìn)化樹，得到氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)分布和豐度檢測分析結(jié)果。
[0010] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述檢測分析廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，步驟 B中PCR反應(yīng)體系：10Xbuffer3μL，MgCl21.8μL，濃度為5U/μL的Taq酶0·2μL， dTNP1.4uL，引物 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 各 0. 3uL;DNA 模板 2yL;無菌雙蒸水 21 μ L ； ?〇?反應(yīng)條件：94<€預(yù)變性1〇111丨11;94°(：變性458,55 <€退火453,72<€延伸11^11，共35 個(gè)循環(huán)；最后72°C下延伸4min。
[0011] 本發(fā)明提供通過特異性引物amoAlF和amoA2R，實(shí)現(xiàn)對氨氧化菌的功能基因氨單 加氧酶基因（amoA)特異性擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行羅氏454 FLX焦磷酸測序，測序結(jié)果 通過生物多樣性分析和BLASTn比對，即可獲得氨氧化菌的群落結(jié)構(gòu)組成和種屬豐度；本發(fā) 明操作簡單、成本低廉、檢測迅速、序列分析準(zhǔn)確度高，能夠定性分析氨氧化菌的不同群落 結(jié)構(gòu)組成，定量分析氨氧化菌不同種屬的豐度，并且可同時(shí)對多個(gè)樣品分析，能夠應(yīng)用于廢 水生物處理系統(tǒng)中氨氧化菌的檢測分析和實(shí)時(shí)監(jiān)控，保證廢水脫氮效果；也可應(yīng)用于天然 水體環(huán)境中氨氧化菌的檢測和定量分析，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，易于推廣應(yīng)用。
[0012]

【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1設(shè)計(jì)氨單加氧酶基因（amoA)特異性引物 為保證擴(kuò)增過程準(zhǔn)確，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物設(shè)計(jì)方法選用在線Primer-BLAST引物設(shè) 計(jì)，其中登錄網(wǎng)址為 http://www. ncbi. nlm. nih. g〇v/tools/primer-BLAST〇
[0014] 選取amoA基因模板序列FASTA文件，設(shè)置最佳的引物設(shè)計(jì)參數(shù)，并同時(shí)對每個(gè)引 物BLAST分析，使引物具有特異性。設(shè)計(jì)獲得的引物運(yùn)用軟件01 ig〇7. 0進(jìn)行評估篩選，最后 得到的特異性引物，即序列號為SEQ ID No. 1的amoAlF和序列號為SEQ ID No.2的amoA2R， 如下所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，其特征在于，具體步驟如 下： A) 提取廢水系統(tǒng)活性污泥中微生物的全部基因組DNA ; B) PCR擴(kuò)增，以全部基因組DNA為模板，以序列號為SEQ ID No. 1的amoAlF和序列號 為SEQ ID No. 2的amoA2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； C) 以羅氏454焦磷酸測序法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，對測序結(jié)果運(yùn)用Mothur程序劃分操 作分類單元，選擇操作分類單元中具有99%相似度的代表性序列進(jìn)行BLASTn比對，根據(jù)比 對結(jié)果劃分系統(tǒng)進(jìn)化樹，即獲得廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度檢測結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測廢水系統(tǒng)中氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的方法，其特征在 于，步驟B 中，PCR 反應(yīng)體系：10Xbuffer 3yL，MgCl2 1.8yL，濃度為 5U/yL 的 Taq 酶 0.2 μL，dTNPL4μL，引物SEQIDNo·l和SEQIDNo·2各(λ3μL;DNA模板2μL;無菌雙蒸水 21 μ L ； PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性lOmin ;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共35 個(gè)循環(huán)；最后72°C下延伸4min。
【文檔編號】C12Q1/04GK104232766SQ201410450221
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】劉波, 王德朋, 陸鑫, 丁新春, 周德超, 徐根華 申請人:南京大學(xué)連云港高新技術(shù)研究院, 南京大學(xué)