一種提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種能提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法。通過將HAC1、ERO1雙基因或HAC1、ERO1、BIP三基因在畢赤酵母胞內(nèi)共表達(dá)，有效提高畢赤酵母分泌型外源蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明將HAC1、ERO1雙基因或HAC1、ERO1、BIP三基因轉(zhuǎn)化入分泌表達(dá)外源木聚糖酶的巴斯德畢赤酵母中獲得重組畢赤酵母菌株，進(jìn)而顯著提高了外源木聚糖酶的表達(dá)量。當(dāng)畢赤酵母胞內(nèi)共表達(dá)HAC1、ERO1雙基因時，外源木聚糖酶的分泌表達(dá)量比初始水平普遍提高了15％-25％；而當(dāng)共表達(dá)HAC1、ERO1、BIP三基因時，木聚糖酶的分泌表達(dá)量比初始水平提高了45％-57％。
【專利說明】一種提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá) 量的方法。 技術(shù)背景
[0002] 畢赤酵母作為目前廣泛用于表達(dá)外源蛋白的重要宿主，擁有諸多優(yōu)點：培養(yǎng)方式 簡便、囷株遺傳穩(wěn)定、蛋白表達(dá)量商、表達(dá)蛋白能夠經(jīng)過正確折置和翻譯后修飾。然而隨著 大量不同外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母對不同外源蛋白的表達(dá)量差異較 大。已有的研究主要關(guān)注于外源蛋白的分泌表達(dá)與基因拷貝數(shù)、信使RNA含量等因素之間 的關(guān)系，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，外源蛋白的分泌表達(dá)量低往往是其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的聚集造成 的。通過采用不同啟動子或增加基因拷貝數(shù)的策略來增強畢赤酵母表達(dá)外源蛋白，相當(dāng)含 量的外源蛋白仍然滯留在胞內(nèi)而未被分泌表達(dá)。
[0003] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是將分泌表達(dá)蛋白折疊成天然構(gòu)象，并對不正確折疊構(gòu)象蛋白進(jìn)行嚴(yán)格篩 選的主要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白包括3類：折疊酶、分子伴侶和凝集素伴侶。表達(dá)分泌性外 源蛋白常常使細(xì)胞內(nèi)積累大量未正確折疊的蛋白，大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的滯留會對內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)造成脅迫。作為一種自我防御機(jī)制，受到未折疊蛋白脅迫的細(xì)胞會產(chǎn)生未折疊蛋白響 應(yīng)（URP)。因此，如何通過激活URP來增強細(xì)胞分泌表達(dá)外源蛋白的能力，是近些年本領(lǐng)域 的研究熱點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法。通過將 HAC1、ER01雙基因或HAC1、ER01、BIP三基因在畢赤酵母胞內(nèi)共表達(dá)，有效提高畢赤酵母分 泌型外源蛋白的表達(dá)量，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明的提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法；是通過增加 HACUER01基 因在畢赤酵母胞內(nèi)的表達(dá)量來提高的；
[0006] 更進(jìn)一步的，在畢赤酵母胞內(nèi)還可以同時增加 BIP基因的表達(dá)量；
[0007] 作為實施例的優(yōu)選，上述增加 HAC1、ER01基因在畢赤酵母胞內(nèi)的表達(dá)量，是通過 將共表達(dá)HACUER01雙基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染入畢赤酵母中實現(xiàn)的；
[0008] 作為實施例的優(yōu)選，增加 HAC1、ER01、BIP基因在畢赤酵母胞內(nèi)的表達(dá)量，是將共 表達(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染入畢赤酵母中來實現(xiàn)的；
[0009] 其中共表達(dá)HACUER01雙基因的重組質(zhì)粒、共表達(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組 質(zhì)粒的制備方法如下：
[0010] 1)對質(zhì)粒pGAPZ α A進(jìn)行改造，去掉信號肽，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZA ;
[0011] 2)在質(zhì)粒pGAPZA的基礎(chǔ)上，將酶切位點AvrII突變掉，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZB ;
[0012] 3)將HAC1基因片段連接pGAPZA質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZA-HACl ;
[0013] ER01基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-EROl ;
[0014] BIP基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-BIP ;
[0015] 4)將pGAPZB-EROl質(zhì)粒和pGAPZA-HACl質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，連接，構(gòu)建得到共表達(dá) HACUER01兩個基因的重組質(zhì)粒pGAPHE ;
[0016] 5)將pGAPZB-BIP質(zhì)粒和pGAPHE質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，連接，構(gòu)建得到共表達(dá)HAC1、 ER01、BIP三個基因的重組質(zhì)粒pGAPHEB。
[0017] 其中上述HAC1基因的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID N0:1。
[0018] 上述ER01基因的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO: 2。
[0019] 上述BIP基因的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID NO: 3。
[0020] 本發(fā)明另一方面還提供了一種重組畢赤酵母菌株，為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染了共表達(dá)HAC1、 ER01雙基因的重組質(zhì)粒和/或共表達(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組質(zhì)粒的畢赤酵母。
[0021] 本發(fā)明將構(gòu)建得到的共表達(dá)質(zhì)粒pGAPHE、pGAPHEB分別轉(zhuǎn)化入分泌表達(dá)外源木 聚糖酶的巴斯德畢赤酵母中獲得重組畢赤酵母菌株。重組畢赤酵母菌株能在胞內(nèi)共表達(dá) HAC1、ER01基因或HAC1、ER01、BIP基因，進(jìn)而顯著提高了外源木聚糖酶的表達(dá)量。當(dāng)共表 達(dá)HACUER01基因時，木聚糖酶的分泌表達(dá)量比初始水平普遍提高了 15% -25%;而當(dāng)共表 達(dá)HAC1、ER01、BIP時，木聚糖酶的分泌表達(dá)量比初始水平提高了 45% -57%。本發(fā)明提供 的方法能有效提高外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正確折疊，進(jìn)而提高畢赤酵母分泌型外源蛋白的 表達(dá)量，有利于促進(jìn)畢赤酵母作為酶制劑生產(chǎn)菌株的廣泛應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖 1 :pGAPZ α A 質(zhì)粒圖譜。
[0023] 圖 2 :pGAPZA、pGAPZB 質(zhì)粒圖譜。
[0024] 圖 3 :pGAPZA-HACl、pGAPZB-EROl、pGAPZB-BIP 質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖 4 :pGAPHE、pGAPHEB 質(zhì)粒圖譜。

【具體實施方式】
[0026] 為了有效提商外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正確折置，進(jìn)而提商外源蛋白的表達(dá)量，申 請人對調(diào)控因子HAC1、折疊酶roi、ER01、分子伴侶BIP、KAR2、SEC63等進(jìn)行了大量的篩選 和組合，通過在畢赤酵母中表達(dá)來驗證其效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAC1和H)I、ER01和SEC63、Η)Ι 和KAR2三種組合在胞內(nèi)的共表達(dá)對外源蛋白表達(dá)量的提高均沒有效果，但HAC1、ER01或 HAC1、ER01、BIP的共表達(dá)能顯著提高畢赤酵母中分泌型外源蛋白的表達(dá)量，從而促成了本 發(fā)明。
[0027] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述
[0028] 實施例lpGAPZA和pGAPZB質(zhì)粒構(gòu)建
[0029] 質(zhì)粒pGAPZ α A (購于invitrogen公司）（圖1)帶有a -factor信號肽，適合分泌 表達(dá)外源蛋白，轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主時先通過AvrII酶切位點用AvrII酶切后進(jìn)行線性化，線 性化的片段能更好的整合到宿主基因組上。調(diào)控因子HAC1、ER01、BIP需要在胞內(nèi)進(jìn)行表 達(dá)，因而需要對質(zhì)粒pGAPZ α A進(jìn)行改造，去掉信號肽，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZA (圖2)，同時在 質(zhì)粒pGAPZA的基礎(chǔ)上，將酶切位點AvrII突變掉，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZB。
[0030] 具體的構(gòu)建過程如下：
[0031] 采用PCR反應(yīng)克隆啟動子pGAP和終止子A0X1TT的基因片段，然后通過重疊 PCR 反應(yīng)將兩個片段融合到一起，從而將中間的a-factor信號肽片段去掉。引物和反應(yīng)條件 如下：
[0032] 引物 l(pGAP-F) :GCGCAGATCTITITTGTAGAAATGTCTTGGT
[0033] 引物 2(pGAP-R) :GCCGCGGCTCGAGGTACCCGTTTCGAAATAGTTGTT
[0034] 引物 3(TT-F) :AACAACTATTTCGAAACGGGTACCTCGAGCCGCGGC
[0035] 引物 4 (TT-R) : TAAAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCACT
[0036] 反應(yīng)條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，30 個循環(huán)后，72°C保溫lOmin。引物1、引物2擴(kuò)增獲得pGAP片段，大小510bp，引物3、引物4 擴(kuò)增獲得A0X1TT片段，大小459bp。以這兩個片段為模板，引物1、引物4擴(kuò)增，獲得融合片 段，大小933bp。將該片段與載體pGAPZaA通過Bgl II和BamH I位點雙酶切后連接，構(gòu)建 新的質(zhì)粒pGAPZA。
[0037] 采用PCR反應(yīng)克隆pGAPZA質(zhì)粒中片段，將AvrII位點CCTAGG突變?yōu)镃CTAG，構(gòu)建 新的質(zhì)粒pGAPZB。引物和反應(yīng)條件如下：
[0038] 引物 5 (AvrII-F) :CGTTACCGTCCCTAGAAATTTTACTCTGCTGGA
[0039] 引物 6 (BamHI-R) :TGTGTGGGGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCA
[0040] 反應(yīng)條件為：941：變性51^11;然后941：變性3〇8,561：復(fù)性3〇8,721：延伸458， 30個循環(huán)后，72°C保溫lOmin。以質(zhì)粒pGAPZA為模板，引物5、引物6擴(kuò)增獲得片段，大小 770bp。將該片段與載體pGAPZA通過Avr II和BamH I位點雙酶切后連接，構(gòu)建新的質(zhì)粒 pGAPZB。
[0041] 實施例2HAC1、ER01、BIP基因擴(kuò)增
[0042] 從KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得HAC1、ER01、BIP基因的核苷酸序列，分別為SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3。利用下述引物，擴(kuò)增這三個基因。
[0043] 引物 7(HAC1-F) :ATGCCCGTAGATTCTTCTC
[0044] 引物 8(HAC1-R) :TCACCTGATCGCTATGCAT
[0045] 引物 9(ER01-F) :ATGAGGATAGTAAGGAGCG
[0046] 引物 10(ER01-R) :TTACAAGTCTACTCTATAT
[0047] 引物 ll(BIP-F) :ATGCTGTCGTTAAAACCAT
[0048] 引物 12(BIP-R) :CTACAACTCATCATGATCA
[0049] 以畢赤酵母GS115基因組為模板，引物7、引物8擴(kuò)增獲得HAC1基因，大小996bp ; 引物9、引物10擴(kuò)增獲得ER01基因，大小1584bp ;引物11、引物12擴(kuò)增獲得BIP基因，大 小2037bp ;將3個片段分別連接T載體后測序，序列與基因庫中報道的序列一致。
[0050] 實施例3pGAPHE、pGAPHEB質(zhì)粒構(gòu)建
[0051] 通過PCR在HAC1、ER01、BIP基因片段兩端分別引入EcoR I、Not I酶切位點， 雙酶切后HAC1連接pGAPZA質(zhì)粒，ER01、BIP連接pGAPZB質(zhì)粒，分別構(gòu)建出pGAPZA-HACl、 pGAPZB-ER01、pGAPZB-BIP 質(zhì)粒（圖 3)。
[0052] 將pGAPZB-EROl質(zhì)粒用Bgl II、BamH I雙酶切后，膠回收含有啟動子、目的基因、 終止子的表達(dá)盒，大小為2486bp。pGAPZA-HACl質(zhì)粒用BamH I酶切后，與表達(dá)盒連接，轉(zhuǎn)化 DH5a菌株，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。由于Bgl II與BamHI酶切位點是同尾酶，有相同的粘性末 端，在連接的時候會形成正、反向兩種質(zhì)粒，可以通過提取質(zhì)粒，用Avr II、BamH I雙酶切來 驗證，正向連接的質(zhì)粒，通過Avr II、BamH I雙酶切會得到4195bp、2100bp兩個片段；反向 連接的質(zhì)粒，通過Avr II、BamH I雙酶切會得到4595bp、1700bp兩個片段。將正向連接的 正確質(zhì)粒命名為PGAPHE (圖4)，其含有兩個表達(dá)盒，含有HACUER01兩個基因。
[0053] 將pGAPZB-BIP質(zhì)粒用Bgl II、BamH I雙酶切后，膠回收含有啟動子、目的基因、 終止子的表達(dá)盒，大小為2939bp。上述pGAPHE質(zhì)粒用BamH I酶切后，與該表達(dá)盒連接，轉(zhuǎn) 化DH5a菌株，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒，用Avr II、BamH I雙酶切來驗證，正向連接的 質(zhì)粒，通過Avr II、BamH I雙酶切會得到7135bp、2100bp兩個片段；反向連接的質(zhì)粒，通過 Avr II、BamH I雙酶切會得到4195bp、5040bp兩個片段。將正向連接的正確質(zhì)粒命名為 pGAPHEB (圖4)，其含有三個表達(dá)盒，同時含有HAC1、ER01、BIP三個基因。
[0054] 實施例4轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母
[0055] 將從煙曲霉（Aspergillus fumigatus)篩選的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母 (Pichia pastoris)中，構(gòu)建得到巴斯德畢赤酵母H43(Pichia pastoris H43)。該菌株能 高效表達(dá)木聚糖酶，且生產(chǎn)的木聚糖酶在酸性條件下具有較高的活性，同時具有很強的耐 熱性和胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受性。
[0056] 上述巴斯德畢赤酵母H43已于2013年6月6日，保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC N0:M2013252。具體的構(gòu)建過程記載于2013年6月 8日申請的中國專利（申請?zhí)枺?013102292527,專利名稱：一種木聚糖酶重組表達(dá)工程菌） 中。
[0057] 將實施例3構(gòu)建得到的pGAPHE質(zhì)粒用Avr II進(jìn)行線性化，質(zhì)粒線性化片段通過 電穿孔法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母H43,在含有100 μ g/ml Zeocin的YH)平板上進(jìn)行篩選，得到 陽性轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)一命名為巴斯德畢赤酵母PHE(Pichiapastoris PHE)。提取PHE酵母的基 因組，利用載體的測序通用引物13、14擴(kuò)增，能得到大小為lOOObp、1600bp的兩條帶，說明 HACUER01基因成功的整合到酵母的基因組中。
[0058] 引物 13 : GACTGGTTCCAATTGACAAGC
[0059] 引物 14 :GGCAAATGGCATTCTGACATCCT
[0060] 將實施例3構(gòu)建得到的pGAPHEB質(zhì)粒用Avr II進(jìn)行線性化，質(zhì)粒線性化片段通過 電穿孔法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母H43,在含有100ug/ml Zeocin的YPD平板上進(jìn)行篩選，得到 陽性轉(zhuǎn)化子，統(tǒng)一命名為巴斯德畢赤酵母^^奶(^&? &8如1^?!^)。提取^^酵母的 基因組，利用載體的測序通用引物13、14擴(kuò)增，能得到大小為1000bp、1600bp、2100bp的三 條帶，說明HAC1、ER01、BIP基因成功的整合到酵母的基因組中。
[0061] 實施例5酶活測定與比較
[0062] 木聚糖酶酶活力檢測方法
[0063] 取2ml濃度為1 %的木聚糖底物（pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），加入到比色 管中，37°C平衡10min，再加入2ml經(jīng)pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好 的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑， 混勻以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻 后，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光值A(chǔ)E。
[0064] 酶活單位定義：在37°C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖 溶液中釋放1 μ mol還原糖所需要的酶量即為一個酶活力單位u。
[0065] 酶活計算公式：
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種提高畢赤酵母分泌型外源蛋白表達(dá)量的方法，其特征在于，所述的方法是通過 增加 HAC1、ER01基因在畢赤酵母胞內(nèi)的表達(dá)量來提高分泌型外源蛋白的表達(dá)量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在畢赤酵母胞內(nèi)同時增加 BIP基因的表達(dá) 量。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的增加 HACUER01基因在畢赤酵母胞內(nèi) 的表達(dá)量，是將共表達(dá)HAC1、ER01雙基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染入畢赤酵母中。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的增加 HAC1、ER01、BIP基因在畢赤酵母 胞內(nèi)的表達(dá)量，是將共表達(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染入畢赤酵母中。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的共表達(dá)HAC1、ER01雙基因的重組質(zhì)粒 的制備方法如下： 1) 對質(zhì)粒pGAPZ α A進(jìn)行改造，去掉信號肽，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZA ; 2) 在質(zhì)粒pGAPZA的基礎(chǔ)上，將酶切位點AvrII突變掉，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZB ; 3) 將HAC1基因片段連接pGAPZA質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZA-HACl ; ER01基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-EROl ; BIP基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-BIP ; 4) 將pGAPZB-EROl質(zhì)粒和pGAPZA-HACl質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，連接，構(gòu)建得到共表達(dá) HAC1、ER01兩個基因的重組質(zhì)粒pGAPHE。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的共表達(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組 質(zhì)粒的制備方法如下： 1) 對質(zhì)粒pGAPZ α A進(jìn)行改造，去掉信號肽，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZA ; 2) 在質(zhì)粒pGAPZA的基礎(chǔ)上，將酶切位點AvrII突變掉，構(gòu)建新的質(zhì)粒pGAPZB ; 3) 將HAC1基因片段連接pGAPZA質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZA-HACl ; ER01基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-EROl ; BIP基因片段連接pGAPZB質(zhì)粒，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGAPZB-BIP ; 4) 將pGAPZB-EROl質(zhì)粒和pGAPZA-HACl質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，連接，構(gòu)建得到共表達(dá) HAC1、ER01兩個基因的重組質(zhì)粒pGAPHE ; 5) 將pGAPZB-BIP質(zhì)粒和pGAPHE質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，連接，構(gòu)建得到共表達(dá)HAC1、 ER01、BIP三個基因的重組質(zhì)粒pGAPHEB。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的HAC1基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的ER01基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
9. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的BIP基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:3。
10. -種重組畢赤酵母菌株，其特征在于，所述的重組畢赤酵母菌株為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染了共 表達(dá)HAC1、ER01雙基因的重組質(zhì)?；蚬脖磉_(dá)HAC1、ER01、BIP三基因的重組質(zhì)粒的畢赤酵 母。
【文檔編號】C12N15/81GK104152484SQ201410395574
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】徐曉東, 王華明, 李冬冬, 王海 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司