一種熒光核酸銀及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于金屬離子檢測和核酸試劑制備領域，特指一種熒光納米核酸-銀簇及其制備方法及其運用。本發(fā)明以小分子核酸為模版，合成了一種新型熒光DNA納米銀簇；納米銀簇的大小為2～4nm；它的水溶液顯示淡黃色，用600nm紅光激發(fā)，660nm處有較強的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率為0.2（以聯(lián)吡啶釕為對照），其660nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅，該DNA-AgNCs的熒光對于二價鐵和三價鐵離子有明顯不同的熒光感應，對二價鐵的靈敏度遠遠高于三價鐵，因此，可用于定性和定量分析三價和二價鐵的總量以及低濃度二價鐵（10-9～10-5μM）和三價鐵（10-6～10-1μM）的定性分析。
【專利說明】一種熒光核酸銀及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于金屬離子檢測和核酸試劑制備領域，特指一種熒光納米核酸-銀簇及其制備方法及其在用熒光光譜法快速檢測溶液中二價和三價鐵含量的運用。

【背景技術】
[0002]近年來，使用人工合成的探針選擇性地感應和識別環(huán)境中以及生物體系統(tǒng)中重要的離子特別是重金屬離子引起了人們極大的興趣；鐵離子在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用，同時它也是人體必需的微量元素之一，鐵參與氧的運輸與儲存，還可以促進發(fā)育；增加對疾病的抵抗力；調(diào)節(jié)組織呼吸，防止疲勞；構(gòu)成血紅素，預防和治療因缺鐵而引起的貧血；使皮膚恢復良好的血色；鐵(鐵食品)雖然是人體必需的微量元素(微量元素食品)，鐵本身也不具有毒性，但當攝入過量或誤服過量的鐵制劑時也可能導致鐵中毒、心臟和肝臟疾病、糖尿病等，所以，在環(huán)境中以及生物體系統(tǒng)中簡便并快速檢測鐵離子就顯得尤為重要；近年來分光光度法被報道用于溶液中鐵離子的檢測[王愛榮，谷永慶，王少冷.微量鐵的分光光度測定概述[J].廣東微量元素科學，2005，12(9): 5-10]，但這些方法難以精確測量細胞中的金屬離子且不能很好地區(qū)分二價鐵離子和三價鐵離子；熒光探針在生物和環(huán)境檢測中有著廣泛的應用，熒光探針的高靈敏性、高選擇性使它成為化學分析中不可缺少的手段；以DNA為模板的銀納米簇因其良好的生物兼容性和較低的毒性而逐漸興起[Zhao T T, Chen Q Y, Zeng C，Lan Y Q, Cai J G.Mult1-DNA - Ag nanoclusters:reassembly mec ha nism and sensing the change of HIF in cells [J].J.Mater.Chem.B, 2013，I (36): 4678-4683.; Obl1sca J M, Liu C, Yeh H C.Fluorescentsilver nanoclusters as DNA probes [J].Nanoscale, 2013, 5(18): 8443-8461.];突光核酸銀納米團簇與特殊目標物質(zhì)相互作用會引起熒光強度的改變，這為鐵離子的定性和定量檢測提供了一個新的思路，核酸銀用于三價和二價鐵離子的區(qū)別國際上未見報道，我們的研究將為生物體內(nèi)鐵離子種類的快速鑒別提供新的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]我們以一種序列為5，-CCC TCC CTT CCC TCC CCG GGC CAA GAG TGT GCT AAA-3’的小分子核酸(DNA)為模版，上述核酸購自上海生工生物工程有限公司，合成了一種新型熒光DNA納米銀簇O^ESDNA-AgNCs);納米銀簇的大小為2~4 nm ;它的水溶液顯示淡黃色，用600 nm紅光激發(fā)，660 nm處有較強的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率為0.2 (以聯(lián)吡啶釕為對照)，其660 nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅(參見附圖2)，說明該核酸納米銀簇(DNA-
AgNCs)是一種靈敏的熒光探針，由圖2可見該DNA-AgNCs的熒光對于二價鐵和三價鐵離子有明顯不同的熒光感應，對二價鐵的靈敏度遠遠高于三價鐵，因此，可用于定性和定量分析三價和二價鐵的總量以及低濃度二價鐵(10_9~10_5μΜ)和三價鐵的定性分析。
[0004]新型熒光DNA納米銀簇(DNA-AgNCs)的合成反應過程如下:將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液(pH 5，10 mM)中，DNA與Ag+的濃度分別為6.4 μ M和100~200 μ M(最佳為200 μ Μ);將混合溶液轉(zhuǎn)到水浴加熱，溫度升到70~80 V (最佳為DNA的Tm值75°C)后穩(wěn)定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫過程為3.5-6小時，最佳為3.5小時；最后在上述溶液中以摩爾比BH4- = Ag+ = 1:1-2:1 (最佳為2:1)加入NaBH4 (10 mM)溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉(zhuǎn)到4 1:避光保存24-40小時，最佳36小時；用600 nm紅光激發(fā)，測660 nm處發(fā)射，即可得到穩(wěn)定的熒光探針。
[0005]反應液的最終體積為I ml。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點:
本發(fā)明基于轉(zhuǎn)鐵蛋白識別基因設計鐵離子敏感性新型熒光核酸銀簇，結(jié)果表明制備的核酸銀探針能夠很好地檢驗鐵離子，且對于二價鐵離子和三價鐵離子有明顯不同的響應，
0.5 μΜ的DNA-AgNCs水溶液對于Fe3+的感應可低至10-6 μΜ，對Fe2+感應可低至10-9 μΜ，因此可用于低濃度條件下二價鐵離子(10_9~10_5μΜ)和三價鐵離子(10_6~lO—i Μ)的定性分析(見圖3，圖1);由于二價和三價鐵離子的表現(xiàn)不同的生理功能，對二價鐵和三價鐵不同感應的熒光探針，可望用于二價鐵離子反應迅速，現(xiàn)象明顯的快速檢測系統(tǒng)；本發(fā)明是國際上首次基于轉(zhuǎn)鐵蛋白識別基因的原理，將這種微觀結(jié)合信號放大為宏觀熒光變化，來實現(xiàn)金屬鐵離子的探測，是一種簡便，直觀、經(jīng)濟的分析方法，該方法也為基于核酸高識別原理發(fā)展新型分析試劑提供了理論上和技術上的支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為DNA-AgNCs (0.5 μΜ)的水溶液隨著硝酸鐵的加入熒光變化圖，λ ex=600;其中？6(勵3)3濃度為3-1: 0、10-6、10'10'10'10'5*10'10'5*10-1 μΜ。
[0008]圖2 為 DNA-AgNCs (2 μ Μ)水溶液加入 0.1 μ M FeCl3 (I)、Fe (NO3) 3 (2)、(NH4)2Fe(SO4)2⑶后的熒光淬滅圖。
[0009]圖3為DNA-AgNCs (0.5 μΜ)的水溶液隨著(NH4)2Fe (SO4)2的加入熒光變化圖，λ ex=600 nm;其中(NH4) 2Fe (SO4) 2 濃度為 a_f: O、10_9、10_8、10_7、10_6、10_5 μΜ。
[0010]圖4 為熒光強度與(NH4)2Fe (SO4) 2濃度的關系圖，a-f: O、10_9、10_8、10_7、10_6、10_5μΜ。
[0011]圖5 為熒光強度與 Fe(NO3)3 濃度的關系圖，a_1: 0、10_6、10_5、10_4、10_3、10_2、5*10_2U0_\5*10_1 μΜ。

【具體實施方式】
[0012]試劑和原料
反應中所用的溶劑皆為分析純，所用試劑未加特殊說明直接應用而未經(jīng)任何特殊處理；一水合檸檬酸鈉，六水合硫酸亞鐵銨，九水合硝酸鐵，氫氧化鈉，硼氫化鈉(粉末，96%)，硝酸銀(99%，A.C.S.)購于國藥集團化學試劑有限公司，DNA序列(上海生工生物工程有限公司)。
[0013]紫外可見分光光度儀(日本島津UV-2450型)，190-800 nm ；Carry Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安有限公司)JEM-200CX型透射電鏡(日本電子株式會社)；Jasco-810圓二色譜儀(日本分光公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干箱(上海_恒科技有限公司)；DZF-6051型真空干燥箱(上海-恒科技有限公司)JopPette手動單道可調(diào)式移液槍(20-200 μ I) ；PHS-3C酸度計(上海第二分析儀器廠)；恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)。
[0014]化合物的合成方法:
實施例1 (最佳合成條件):
將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液(pH 5，10 mM)中，DNA與Ag+的濃度分別為6.4和200 μ M0將混合溶液轉(zhuǎn)到水浴加熱，溫度升到DNA的Tm值(75 V )后穩(wěn)定三分鐘，緩慢降溫到室溫 ，降溫過程為3.5小時，最后在上述溶液中以摩爾比BH4_:Ag+=2:l加入NaBH4 (10 mM)溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉(zhuǎn)到4 1:避光保存36小時，反應液的最終體積為I mL;配置2 μ MU μΜ、0.5 μ M DNA-AgNCs水溶液，用600 nm紅光激發(fā)，測660 nm處發(fā)射熒光強度分別為135，72，40。
[0015]實施例2:
將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液(pH 5，10 mM)中，DNA與Ag+的濃度分別為
6.4和100 μ Μ,將混合溶液轉(zhuǎn)到水浴加熱，升溫度值(70 °C)后穩(wěn)定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫過程為6小時；最后在上述溶液中以摩爾比BH4_:Ag+=l.5:1加入NaBH4 (10 mM)溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉(zhuǎn)到4 1:避光保存30小時，反應液的最終體積為I ml ；配置2 μ MU μΜ、0.5 μ M DNA-AgNCs水溶液，用600 nm紅光激發(fā)，測660 nm處發(fā)射熒光強度分別為70，34，15。
[0016]實施例3:
將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液(pH 5，10 mM)中，DNA與Ag+的濃度分別為6.4和200 μ M，將混合溶液轉(zhuǎn)到水浴加熱，溫度升至80 °C后穩(wěn)定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫過程為4小時；最后在上述溶液中以摩爾比BH4- = Ag+=1:1加入NaBH4 (10 mM)溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉(zhuǎn)到4 1:避光保存24小時，反應液的最終體積為I ml;配置2 μ MU μΜ、0.5 μ M DNA-AgNCs水溶液，用600 nm紅光激發(fā)，測660 nm處發(fā)射熒光強度分別為80，35，18。
[0017]以實施例1得到的化合物為受試化合物
選擇濃度為 0.5 μ M DNA-AgNCs ( λ ex=600 nm, λ em=660 nm)水溶液，用 Fe (NO3) 3 進行滴定，隨著Fe (NO3) 3濃度的增加，熒光強度降低(如圖1 )。
[0018]實施例7:Fe2+的檢測
以實施例1得到的化合物為受試化合物
選擇濃度為 0.5 μ M DNA-AgNCs (λ ex=600 nm, λ em=660 nm)水溶液，用(NH4) 2Fe (SO4) 2進行滴定，隨著(NH4) 2Fe (SO4) 2濃度的增加，熒光強度降低(如圖3 )。
【權(quán)利要求】
1.一種小分子核酸,其特征在于:其序列為5’-CCC TCC CTT CCC TCC CCG GGC CAAGAG TGT GCT AAA-3，。
2.—種突光核酸銀的制備方法,所述突光核酸銀的大小為2~4 nm;它的水溶液顯不淡黃色，用600 nm紅光激發(fā)，660 nm處有較強的熒光發(fā)射，以聯(lián)吡啶釕為對照熒光量子產(chǎn)率為0.2，其660 nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅，其特征在于制備方法按照下述步驟進行:以 5’-CCC TCC CTT CCC TCC CCG GGC CAA GAG TGT GCT AAA-3’的小分子核酸為模版，將小分子核酸和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液中；將混合溶液轉(zhuǎn)到水浴加熱，溫度升到70-80 1:后穩(wěn)定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫時間為3.5-6小時；最后在上述溶液中以摩爾比ΒΗ4_: Ag+ = 1:1~2:1加入NaBH4溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉(zhuǎn)到4 °C避光保存24-40小時；即可得到穩(wěn)定的熒光探針。
3.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述檸檬酸鈉緩沖液的pH值為5，濃度為10 mM。
4.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述小分子核酸與Ag+的濃度分別為6.4 μ M和100~200 μ Μ。
5.如權(quán)利要求4所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述Ag+的濃度為200 μ Mo
6.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述溫度為小分子核酸的Tm值，75 °C。
7.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述降溫時間為3.5小時。
8.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述BH4-= Ag+的摩爾比例為2:1。
9.如權(quán)利要求2所述的一種熒光核酸銀的制備方法，其特征在于:所述NaBH4溶液的濃度為10 mM ;所述避光保存的時間為36小時。
10.權(quán)利要求2制備的熒光核酸銀在熒光光譜法快速檢測溶液中二價和三價鐵含量的運用，其特征在于；用于定性和定量分析三價和二價鐵的總量以及低濃度二價鐵(10_9~10_5 μ Μ)和三價鐵(1-f^lO-1 μ Μ)的定性分析。
【文檔編號】C12N15/11GK104178483SQ201410391996
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】陳秋云, 陳甜甜 申請人:江蘇大學