專利名稱：腺病毒和編碼其的核酸的新應(yīng)用的制作方法
腺病毒和編碼其的核酸的新應(yīng)用本申請是國際申請?zhí)枮镻CT/EP03/05583，國際申請日為2003年5月27日，進(jìn)入中 國國家階段日期為2004年11月29日，中國國家申請?zhí)枮椤?3812310.X”，發(fā)明名稱為“腺 病毒和編碼其的核酸的新應(yīng)用”的分案申請。

本發(fā)明涉及腺病毒以及編碼其的核酸和重組病毒癌蛋白質(zhì)的應(yīng)用。當(dāng)前在治療腫瘤中使用許多治療原理。除了使用外科手術(shù)以外，化學(xué)療法和放射 療法是占優(yōu)勢的。然而所有這些技術(shù)與相當(dāng)大的副作用相關(guān)。復(fù)制選擇性溶瘤病毒的應(yīng)用 提供治療腫瘤的新平臺。與其相關(guān)引發(fā)病毒劑的選擇性腫瘤內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致病毒復(fù)制，受染腫 瘤細(xì)胞的裂解和病毒向相鄰腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。因?yàn)椴《緩?fù)制能力限于腫瘤細(xì)胞，正常組織 免于病毒復(fù)制和因此免于病毒裂解。目前，幾種病毒系統(tǒng)進(jìn)行目的在于腫瘤裂解的臨床試驗(yàn)。該腺病毒的一個(gè)實(shí)例 是 dll520(0nyx-015)，其已經(jīng)成功用于 I 期和 II 期臨床(Khuri, F.等 Nature Medicine 6，879-885，2000)。0nyx_015是一種具有完全缺失ElB_55kDa基因的腺病毒。腺病毒的 ElB-55kDa蛋白的完全缺失是基于發(fā)現(xiàn)即具有p53缺失的腺病毒載體可能導(dǎo)致細(xì)胞的復(fù)制 和因此裂解(Kirn，D.等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17，391a, 1998)，其中正常細(xì)胞不受傷 害。更具體地，ElB-55kDa基因產(chǎn)物涉及p53的抑制，病毒mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 合成的切斷。P53的抑制是通過由p53和腺病毒編碼的ElB-55kDa蛋白的復(fù)合體和/或由 ElB-55kDa和E4orf6的復(fù)合體的形成而發(fā)生。由TP53編碼的p53是復(fù)合體調(diào)節(jié)機(jī)制的起 點(diǎn)(Zambetti，G. P.等，F(xiàn)ASEB J. 7，855-865，1993)，其尤其導(dǎo)致病毒如腺病毒細(xì)胞復(fù)制的有 效抑制?；騎P53在約50%的所有人腫瘤中缺失或突變，導(dǎo)致由化學(xué)療法或放射療法導(dǎo)致 的期望細(xì)胞調(diào)亡的缺乏，致使通常不成功的腫瘤治療。腫瘤裂解腺病毒的另一原理是基于發(fā)現(xiàn)即如果ElA蛋白以特定的缺失形式存在 或包含一個(gè)或多個(gè)突變而不影響Rb/E2F和/或pl07/E2F和/或pl30/E2F的結(jié)合，該腺 病毒將不誘導(dǎo)感染的細(xì)胞進(jìn)入S期和能夠在不含有功能Rb蛋白的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。另 夕卜，ElA蛋白可以在N-末端缺失和在ElA蛋白的1-76的氨基酸位置上分別包含一個(gè)或多 個(gè)突變，以便抑制ElA與p300的結(jié)合和因此提供在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制。這些方法 在歐洲專利EP 0 931 830中以例舉的方式描述。這些病毒的實(shí)例是Ad Δ 24，dl922_947， ElAd/01/07 和 CB016(Howe，J. Α.等，Molecular Therapy 2，485-495，2000 ；Fueyo, J.等， 癌基因 19,2-12,2000 ；Heise, C.等，Nature Medicine 6，11341139，2001 ;Balague，C.等， J. Virol. 75，7602-7611，2001)。這些在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于溶癌作用的腺病毒系統(tǒng)因此包 含ElA蛋白中不同的缺失，其中在以下假設(shè)下進(jìn)行這些缺失功能Rb蛋白和由無活性的Rb 蛋白和E2F組成的復(fù)合體分別將阻斷有效的體內(nèi)復(fù)制和以便提供僅在Rb-陰性/突變細(xì)胞 中的腺病毒體內(nèi)復(fù)制。按照現(xiàn)有技術(shù)的這些腺病毒系統(tǒng)是基于ElA以便使用早期E2啟動(dòng) 子(engl. E2 早期啟動(dòng)子)和自由 E2F (Dyson, N. Genes &Development, 12，2245-2262，1998) 控制體內(nèi)復(fù)制。腫瘤裂解腺病毒系統(tǒng)的另一種形式是基于對特異性表達(dá)病毒癌基因ElA的選擇 性啟動(dòng)子的使用，其提供在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制(Rodriguez，R.等，Cancer Res. 57,2559-2563，1997)。如上所述，適于構(gòu)成作用方式基礎(chǔ)的各種原理的細(xì)胞背景的選擇對于腺病毒腫瘤 裂解病毒的各種原理是重要的。換句話說，只有當(dāng)實(shí)現(xiàn)不同的分子生物學(xué)先決條件時(shí)才能 使用當(dāng)前已知的各種腺病毒系統(tǒng)。這限制這些系統(tǒng)應(yīng)用于不同的患者群。一旦患者發(fā)展所謂的多藥耐藥性(engl. multidrug resistance (MDR)),出現(xiàn)治療 腫瘤疾病中的一個(gè)特殊問題，該多藥耐藥性代表腫瘤對細(xì)胞生長抑制劑抗性研究特別詳盡 的形式(Gottesman 和 Pastan，Annu. Rev. Biochem. 62，385-427，1993)。它是基于膜結(jié)合 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白的過量表達(dá)，該蛋白屬于所謂的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Stein，U.等，JBC 276， 28562-69,2001,J. Wijnholds,Novartis Found Symp.，243，69-79，2002)。Bargou,R. C.等 和 Oda，Y.等(Bargou, R. C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997 ；Cl in. Cancer Res. 4, 2273-2277,1998)能夠顯示人轉(zhuǎn)錄因子YB-I的核定位直接涉及P-糖蛋白表達(dá)的激活。進(jìn) 一步的研究證實(shí)YB-I通過各種脅迫條件如UV照射、細(xì)胞生長抑制劑的給藥(Koi ke，K.等， FEBS Lett 17，390-394，1997)和過熱(Stein, U.等，JBC 276，28562-69，2001)而轉(zhuǎn)運(yùn)到核 內(nèi)。進(jìn)一步的研究證實(shí)YB-I的核定位對另一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有影響。該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 稱為 MRP (engl. multidrug resistance-related protein)和涉及所謂的非典型非 P-糖蛋 白依賴性多藥耐藥性(Stein, U.等，JBC 276，28562-69，2001)的形成。構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問題是提供一種技術(shù)教導(dǎo)和特別是一種方法，其允許具體地使 用腫瘤裂解活性劑治療生物體，更具體地分別治療人類生物體和一組患者。構(gòu)成本發(fā)明基 礎(chǔ)的另一問題是提供適于在患者中導(dǎo)致腫瘤裂解的方法，所述患者患有抗細(xì)胞生長抑制劑 的腫瘤疾病，特別是具有多藥耐藥性的那些。按照本發(fā)明在第一方面，通過使用病毒、優(yōu)選腺病毒制備藥物來解決該問題，其中 病毒在核內(nèi)不含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制缺陷，病毒編碼癌基因或癌基因產(chǎn)物，優(yōu)選癌基因蛋 白質(zhì)，其在YB-I核陽性細(xì)胞中反式激活至少一個(gè)病毒基因，優(yōu)選腺病毒基因，其中基因選 自包含 ElB55kDa，E4orf6, E4orf3 和 E3ADP 的組。在第二方面，通過使用病毒、優(yōu)選腺病毒在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制來解決 該問題，其中病毒在核內(nèi)不含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制缺陷，病毒編碼癌基因或癌基因產(chǎn)物， 特別是癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，優(yōu)選腺病毒基因，其中基因選自包含 ElB55kDa, E4orf6, E4orf3 和 E3ADP 的組。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的實(shí)施方案中，病毒，優(yōu)選腺病毒在核內(nèi)含有YB-I的細(xì) 胞中復(fù)制。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，病毒癌基因蛋白質(zhì)是ElA和/或癌 基因是編碼ElA的基因和/或癌基因蛋白質(zhì)是E1A。在優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒癌基因蛋白質(zhì)ElA能夠與功能Rb腫瘤抑制基因產(chǎn)物結(jié)
口 O在備選實(shí)施方案中病毒癌基因蛋白質(zhì)ElA不能夠與功能Rb腫瘤抑制基因產(chǎn)物結(jié)
π ο在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，病毒癌基因蛋白質(zhì)ElA不誘導(dǎo)YB-I 的核定位。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的還有的另一實(shí)施方案中，藥物是針對其細(xì)胞為Rb-陽性或Rb-陰性的患者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞是涉及受藥物影響的病癥形成的那些細(xì)胞。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞是Rb-陰性的和在核內(nèi)YB-I陽 性的，優(yōu)選是獨(dú)立于細(xì)胞周期的在核內(nèi)YB-I陽性的。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的還有的另一實(shí)施方案中，藥物用于治療腫瘤。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的還有的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞，特別是形成腫瘤或其 部分的細(xì)胞，抗藥物，特別是具有多藥耐藥性，優(yōu)選對抗腫瘤劑的抗性，更優(yōu)選對細(xì)胞生長 抑制劑的抗性。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)、優(yōu)選過量表達(dá)膜結(jié)合轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白P-糖蛋白和/或MRP。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞是p53-陽性或p53-陰性。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型癌基因蛋白質(zhì)ElA相比， 癌基因蛋白質(zhì)具有一個(gè)或數(shù)個(gè)突變或缺失，其中該缺失優(yōu)選選自包含CR3區(qū)域的缺失和N 末端的缺失以及C-末端的缺失的組。與其相關(guān)，優(yōu)選ElA癌基因蛋白質(zhì)可以與Rb結(jié)合。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，與野生型癌基因蛋白質(zhì)相比，癌基 因蛋白質(zhì)具有一個(gè)或數(shù)個(gè)突變或缺失，其中該缺失優(yōu)選在CRl區(qū)域和/或CR2區(qū)域。癌基 因蛋白質(zhì)ElA不能夠結(jié)合Rb在本發(fā)明范圍內(nèi)。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，病毒癌基因蛋白質(zhì)，特別是ElA在 組織特異性和/或腫瘤特異性啟動(dòng)子的控制下。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，病毒，特別是腺病毒，編碼YB-1。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的還有的一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I在組織特異性和/或腫 瘤特異性啟動(dòng)子的控制下。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒，特別是腺病毒，編碼至少一種 選自包含E4orf6，E4orf3，E1B55K和腺病毒E3ADP蛋白的組。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的備選實(shí)施方案中，細(xì)胞在核內(nèi)含有YB-1，特別是形成 腫瘤或其部分的細(xì)胞在核內(nèi)含有YB-1。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的另一實(shí)施方案中，經(jīng)誘導(dǎo)YB-I轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)以后腫瘤 在核內(nèi)含有YB-I。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過至少一種選自以下各項(xiàng)的方法 引發(fā)YB-I轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)輻射，給藥細(xì)胞生長抑制劑和過熱。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該方法應(yīng)用于細(xì)胞，器官 或生物體。在按照本發(fā)明的兩種應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒，特別是腺病毒，選自包含 Ad Δ 24，dl922-947, ElAd/01/07, dill 19/1131，CB 016，dl520 的組和缺少表達(dá)的病毒 ElA 癌基因的病毒，該病毒ElA癌基因能夠與功能Rb腫瘤抑制基因產(chǎn)物結(jié)合。在第三方面，通過使用病毒，優(yōu)選腺病毒制備藥物來解決該問題，其中設(shè)計(jì)病毒， 優(yōu)選腺病毒以便通過或借助YB-I通過激活E2-晚期啟動(dòng)子，優(yōu)選主要通過激活E2-晚期啟 動(dòng)子來控制復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I是轉(zhuǎn)基因YB-I或細(xì)胞的，特別是細(xì)胞解除管制 的YB-1。轉(zhuǎn)基因YB-I優(yōu)選是指由載體在細(xì)胞中表達(dá)的YB-1，該載體優(yōu)選為一種或上述的腺病毒。E2-晚期啟動(dòng)子優(yōu)選是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚期啟動(dòng)子，或如本 文所述與轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)的E2-晚期啟動(dòng)子。在第四方面，通過針對在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞的復(fù)制使用病毒，優(yōu)選腺病毒來解 決該問題，其中設(shè)計(jì)病毒，特別是腺病毒以便由YB-I通過激活E2-晚期啟動(dòng)子，優(yōu)選主要通 過激活E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I是轉(zhuǎn)基因YB-I或細(xì)胞的，特 別是細(xì)胞解除管制的YB-I。在一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I是轉(zhuǎn)基因YB-I或細(xì)胞的，特別是細(xì)胞 解除管制的YB-I。本文所用的轉(zhuǎn)基因YB-I優(yōu)選為在細(xì)胞中由載體表達(dá)的YB-I，該載體優(yōu)選 為一種或上述的腺病毒。E2-晚期啟動(dòng)子優(yōu)選是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚 期啟動(dòng)子，或如本文所述與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的應(yīng)用相關(guān)的E2-晚期啟動(dòng)子。在本發(fā)明第三和/或第四方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文所公開來設(shè)計(jì)腺病毒， 特別是如此設(shè)計(jì)以便按照本發(fā)明使用。

在第五方面，通過病毒癌基因蛋白質(zhì)，特別是具有下列特性的分離的病毒癌基因 蛋白質(zhì)來解決該問題a)在YB-I核陽性細(xì)胞中反式激活至少一個(gè)病毒基因，該基因選自包含E1B-55K， E3ADP和E4orf6以及E4orf3的組；和b)在核內(nèi)，特別是在存在病毒癌基因蛋白質(zhì)的細(xì)胞的核內(nèi)缺乏YB-I的誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中病毒癌蛋白質(zhì)是E1A。在另一實(shí)施方案中，與野生型癌基因蛋白質(zhì)相比，病毒癌基因蛋白質(zhì)具有一個(gè)或 數(shù)個(gè)突變或缺失，其中缺失優(yōu)選選自包含CR3區(qū)域的缺失，N-末端的缺失和C-末端的缺失 的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)E4orf6和/或ElB 55kD不存在于顯示核的細(xì)胞中時(shí)，缺乏 通過病毒癌基因蛋白質(zhì)的YB-I的誘導(dǎo)。與其相關(guān)，意欲病毒癌基因蛋白質(zhì)能夠結(jié)合Rb。在備選實(shí)施方案中，病毒癌基因蛋白質(zhì)包含一個(gè)或數(shù)個(gè)突變或缺失，其中缺失優(yōu) 選在ElA癌基因蛋白質(zhì)的CRl區(qū)域和/或CR2區(qū)域中。與其相關(guān)，意欲病毒癌基因蛋白質(zhì) 不能夠結(jié)合Rb。在第六方面，本發(fā)明涉及病毒復(fù)制系統(tǒng)，優(yōu)選腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的應(yīng)用，該病毒復(fù)制 系統(tǒng)包含編碼病毒、特別是按照本發(fā)明使用的腺病毒的核酸，并且包含一種輔助病毒的核 酸，其中輔助病毒的核酸包含編碼YB-I的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒核酸，特別是腺病毒核酸，和/或輔助病毒的核酸作為可 以復(fù)制的載體存在。在第七方面，本發(fā)明涉及核酸在制備藥物、特別是在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng) 用，該核酸編碼病毒、特別是按照本發(fā)明使用的腺病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞，特別是形成腫瘤或其部分的細(xì)胞對藥物有抗性，特別是 具有多藥耐藥性，所述藥物優(yōu)選抗腫瘤劑，更優(yōu)選細(xì)胞生長抑制劑。在第八方面，本發(fā)明涉及核酸對核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞的復(fù)制的應(yīng)用，該核酸編碼 病毒、特別是按照本發(fā)明使用的腺病毒，其中病毒在核內(nèi)不含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制缺陷， 病毒編碼癌基因或癌基因產(chǎn)物，其在YB-I核-陽性細(xì)胞中反式激活至少一個(gè)病毒基因，優(yōu) 選腺病毒基因，其中基因選自包含ElB55kDa，E4orf6, E4orf3和E3ADP的組。
在第九方面，通過使用核酸制備藥物來解決該問題，所述編碼病毒、優(yōu)選按照本發(fā) 明使用的腺病毒，其中設(shè)計(jì)病毒以便由YB-I通過激活E2-晚期啟動(dòng)子，優(yōu)選主要通過激活 E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I是轉(zhuǎn)基因YB-I或細(xì)胞的，特別是細(xì)胞 解除管制的YB-I。本文所用的轉(zhuǎn)基因YB-I優(yōu)選為在細(xì)胞中由載體表達(dá)的YB-I，該載體優(yōu)選 為一種或上述的腺病毒。E2-晚期啟動(dòng)子優(yōu)選是如在野生型腺病毒中存在的腺病毒E2-晚 期啟動(dòng)子，或如本文所述與轉(zhuǎn)基因表達(dá)應(yīng)用相關(guān)的E2-晚期啟動(dòng)子。在第十方面，通過針對細(xì)胞復(fù)制使用核酸解決該問題，該核酸編碼病毒、特別是按 照本發(fā)明使用的腺病毒，其中設(shè)計(jì)病毒以便由YB-I通過激活E2-晚期啟動(dòng)子，優(yōu)選主要通 過激活E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，YB-I是轉(zhuǎn)基因YB-I或 細(xì)胞的，特 別是細(xì)胞解除管制的YB-1。本文所用的轉(zhuǎn)基因YB-I優(yōu)選為在細(xì)胞中由載體表達(dá)的YB-1， 該載體優(yōu)選為一種或上述的腺病毒。E2-晚期啟動(dòng)子優(yōu)選是如在野生型腺病毒中存在的腺 病毒E2-晚期啟動(dòng)子，或如本文所述與轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)使用的E2-晚期啟動(dòng)子。在第十一方面，通過使用載體用于按照本發(fā)明第一或第二方面的應(yīng)用來解決該問 題，該載體包含一種前述核酸。在第十二方面，本發(fā)明涉及與YB-I相互作用的試劑在表征細(xì)胞、腫瘤組織細(xì)胞或 患者中的應(yīng)用，該表征是為了確定這些是否應(yīng)當(dāng)與病毒、特別是按照本發(fā)明使用的腺病毒 接觸和/或用其治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑選自包含抗體，抗促成素(anticaline)，適體 (aptamer)，aptazyme 禾口 spiegelmer 的組。在第十三方面，通過使用按照本發(fā)明的病毒癌基因蛋白質(zhì)或?yàn)榇司幋a的核酸制備 按照本發(fā)明第一和第二方面使用的病毒、特別是腺病毒來解決該問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒包含編碼轉(zhuǎn)基因的核酸。在另一實(shí)施方案中，病毒包含轉(zhuǎn)基因的翻譯產(chǎn)物和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的核酸和/或輔助病毒的核酸包含轉(zhuǎn)基因或 編碼轉(zhuǎn)基因的核酸。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含轉(zhuǎn)基因或編碼轉(zhuǎn)基因的核酸。在備選實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因選自包含前藥基因，細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的基因，腫 瘤抑制基因，金屬蛋白酶抑制劑的基因和血管生成抑制劑的基因的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因選自包含關(guān)于SiRNA、適體、反義分子和核酶的核酸的 組，其中siRNA、適體、反義分子和/或核酶是靶向靶分子。在另一實(shí)施方案中，靶分子選自包含抗性相關(guān)因子，抗細(xì)胞調(diào)亡因子，癌基因，血 管生成因子，DNA合成酶，DNA修復(fù)酶，生長因子和它們的受體，轉(zhuǎn)錄因子，金屬蛋白酶，特別 是基質(zhì)金屬蛋白酶，和尿激酶類型的纖溶酶原激活物的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗性相關(guān)因 子優(yōu)選選自包含P-糖蛋白，MRP和GST的組，而且還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案 中，抗細(xì)胞調(diào)亡因子選自包含BCL2的組，并且還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌 基因選自包含Ras，特別是突變的Ras，Rb和Myc的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施 方案中，血管生成因子選自包含VEGF和HMG蛋白的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施 方案中，DNA合成酶選自包含端粒酶的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中DNA修 復(fù)酶選自包含Ku-80的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長因子選自包含PDGF, EGF和M-CSF的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，受體特別是生長因子 的受體，其中生長因子優(yōu)選選自包含PDGF，EGF和M-CSF的組，還包含編碼其的核酸。在一 個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子選自包含YB-I的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，金 屬蛋白酶優(yōu)選為基質(zhì)金屬蛋白酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基質(zhì)金屬蛋白酶選自包含MMP-I和 ΜΜΡ-2的組，還包含編碼其的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶類型的纖溶酶原激活物選自 包含uPa-R的組，還包含編碼其的核酸。在還有另一實(shí)施方案中，藥物另外包含至少一種藥物活性化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物活性化合物選自包含細(xì)胞因子，金屬蛋白酶抑制劑，血管 生成抑制劑，細(xì)胞生長抑制劑和細(xì)胞周期抑制劑的組。本發(fā)明是基于意外的發(fā)現(xiàn)即，ElA-修飾的腺病毒在YB-I核陽性腫瘤細(xì)胞中的DNA 復(fù) 制是基于Ε2-晚期啟動(dòng)子的激活。本文所用的ElA-修飾的腺病毒是這種腺病毒，其(a) 在YB-I核-陰性細(xì)胞中不復(fù)制或與各種野生型相比，在YB-I核-陰性細(xì)胞中顯示減少的優(yōu) 選強(qiáng)烈減少的復(fù)制，(b)反式激活至少一種病毒基因，其中基因特別選自包含ElB-55kDa， E4orf6，E4orf3和E3ADP的組，和/或(c)不將細(xì)胞YB-I通過腺病毒轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。任選地 按照本發(fā)明使用的腺病毒具有另外的特性即，腺病毒編碼的ElA蛋白的結(jié)合干擾E2F與Rb 的結(jié)合和能夠分別分解由E2F和Rb組成的各種復(fù)合體。具有一個(gè)或數(shù)個(gè)前述特征a)至 c)、優(yōu)選全部特征a)至c)的腺病毒在核內(nèi)不含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所用的強(qiáng)烈減少的復(fù)制具體地是指與野生型相比，復(fù)制 減少2倍，優(yōu)選5倍，更優(yōu)選10倍和最優(yōu)選100倍。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用相同或相似的 細(xì)胞系，相同或相似的感染的病毒效價(jià)(感染復(fù)數(shù)，Μ0Ι，或蝕斑形成單位，pfu)和/或相同 或相似的常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件來進(jìn)行這種復(fù)制比較。本文所用的復(fù)制特別是指顆粒的形成。在另 一實(shí)施方案中復(fù)制的測量可以是病毒核酸合成的程度。測定病毒核酸合成的程度的方法以 及測定顆粒形成的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。本文所述的發(fā)現(xiàn)，方法，應(yīng)用或核酸，蛋白質(zhì)，復(fù)制系統(tǒng)等不一定限于腺病毒。原則 上，這些系統(tǒng)還存在于也包含于此的其它病毒中。當(dāng)按照本發(fā)明使用病毒時(shí)或當(dāng)使用按照本發(fā)明于此所述的病毒時(shí)，在與按照現(xiàn)有 技術(shù)IO-IOOpfu/細(xì)胞相比的I-IOpfu/細(xì)胞的感染率下可以實(shí)現(xiàn)比得上野生型復(fù)制的復(fù) 制。本文所用的細(xì)胞YB-I應(yīng)當(dāng)是指由細(xì)胞編碼和優(yōu)選還由細(xì)胞表達(dá)的任何YB-1，其 中優(yōu)選在用腺病毒優(yōu)選如本文所述的腺病毒和/或輔助病毒感染各個(gè)細(xì)胞之前該YB-I存 在細(xì)胞中。然而，細(xì)胞YB-I是引入細(xì)胞的或通過施加外部措施如例如用病毒、特別是腺病 毒感染以后由這些細(xì)胞生產(chǎn)的YB-I也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下不希望受此束縛，本發(fā)明人假定E2-早期啟動(dòng)子，即早期E2啟動(dòng)子不通過 與按照本發(fā)明本文所用的病毒復(fù)制相關(guān)的人細(xì)胞E2F轉(zhuǎn)錄因子開放。復(fù)制的開關(guān)獨(dú)立于 細(xì)胞的Rb狀態(tài)，即意味著使用本文公開的病毒感染的和優(yōu)選隨后裂解的腫瘤細(xì)胞可以包 含功能的以及無活性的Rb蛋白。另外，當(dāng)使用本文公開的腺病毒或在本文公開的條件下 時(shí)，腺病毒復(fù)制不需要任何功能P53蛋白，也不受其存在的影響。如此，該技術(shù)教導(dǎo)背離 構(gòu)成腫瘤消解或腫瘤裂解的腺病毒的應(yīng)用基礎(chǔ)的原理，所述腺病毒為Ad Δ 24，dl922-947， ElAd/01/07, CB016類型或例如在歐洲專利EP 0931830中描述的那些腺病毒，其中在以下假設(shè)下在ElA蛋白中已經(jīng)引入一個(gè)或數(shù)個(gè)缺失完好的功能Rb蛋白是體內(nèi)有效復(fù)制的阻礙 物，因此分別僅在Rb-陰性和Rb-突變細(xì)胞中提供腺病毒的體內(nèi)復(fù)制。按照現(xiàn)有技術(shù)的這 些腺病毒系統(tǒng)是基于ElA以便通過早期E2啟動(dòng)子(E2早期啟動(dòng)子)和“自由E2F”控制腺 病毒的體內(nèi)復(fù)制。然而，按照本發(fā)明可以使用按照現(xiàn)有技術(shù)的這些病毒，即用于在核內(nèi)包含 YB-I的細(xì)胞的獨(dú)立于細(xì)胞周期的復(fù)制。按照本發(fā)明可以使用在所述歐洲專利EP 0 931 830中描述的病毒和特別是腺病 毒。更具體地，在所述專利中描述的病毒是復(fù)制缺陷的和缺乏表達(dá)的能夠結(jié)合功能Rb腫瘤 抑制基因產(chǎn)物的病毒癌蛋白質(zhì)。腺病毒可以具體地為缺乏表達(dá)的病毒ElA癌蛋白質(zhì)的腺 病毒，該ElA癌蛋白質(zhì)能夠結(jié)合功能腫瘤抑制基因產(chǎn)物，特別是Rb。病毒ElA癌蛋白質(zhì)可 以包含失活突變，例如在CRl結(jié)構(gòu)域中Ad 5的氨基酸位點(diǎn)30-85，核苷酸位點(diǎn)697-790和 /或CR2結(jié)構(gòu)域中Ad5的氨基酸位點(diǎn)120-139，核苷酸位點(diǎn)920-967，其涉及pl05Rb蛋白， P130和pl07蛋白的結(jié)合。還可以意欲腺病毒是類型2的dl 312或腺病毒是 類型5的NT dl 1010。當(dāng)使用按照本發(fā)明的腺病毒制備藥物，特別是制備治療腫瘤疾病的藥物時(shí)，和當(dāng) 使用按照本發(fā)明的腺病毒用于在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞的復(fù)制時(shí)，復(fù)制最終在核內(nèi)包含 YB-I的細(xì)胞中發(fā)生，該細(xì)胞優(yōu)選獨(dú)立于細(xì)胞周期，其因此是YB-I核-陽性。特別值得注意 的是，如此的腺病毒在核內(nèi)不含有YB-I而基本上僅在細(xì)胞質(zhì)中含有YB-I的細(xì)胞中不復(fù)制 或以顯著降低的水平上復(fù)制。因此對于這些病毒的成功復(fù)制在核內(nèi)需要YB-I存在。例如 如在下面更詳細(xì)地概述，這可以通過對細(xì)胞施加措施導(dǎo)致YB-I在核內(nèi)表達(dá)或YB-I在核內(nèi) 存在來實(shí)現(xiàn)。各種措施可以例如分別是YB-I通過按照本發(fā)明使用的腺病毒的編碼和表達(dá)， 該腺病毒除了腺病毒基因以外還包含編碼YB-I和特別是YB-I表達(dá)的遺傳信息。導(dǎo)致細(xì)胞 核內(nèi)YB-I轉(zhuǎn)運(yùn)、誘導(dǎo)或表達(dá)的其它措施是脅迫條件如向細(xì)胞和包含該細(xì)胞的生物體施加 細(xì)胞生長抑制劑，照射，過熱等。進(jìn)一步表征按照本發(fā)明使用的、特別是用于腫瘤裂解的腺病毒，以使它們在核內(nèi) 不含有YB-I的、換句話說YB-I核-陰性的細(xì)胞中不復(fù)制。按照本發(fā)明使用的腺病毒的另一特征是它們編碼在此也稱為癌基因蛋白質(zhì)的病 毒癌蛋白質(zhì)，其中癌基因蛋白質(zhì)優(yōu)選為E1A，其中癌基因蛋白質(zhì)能夠激活至少一個(gè)對病毒復(fù) 制和/或受病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞裂解有影響的病毒基因。優(yōu)選對復(fù)制的影響是這樣的即， 與其中各種病毒的癌基因蛋白質(zhì)缺失的情形相比在癌基因蛋白質(zhì)存在下病毒復(fù)制更好。該 過程在本文中也稱為反式激活和當(dāng)反式激活是通過ElA介導(dǎo)時(shí)具體地ElA反式激活。術(shù)語 “轉(zhuǎn)活”或“反式激活”優(yōu)選描述以下過程，即各種病毒癌蛋白質(zhì)對一個(gè)或多個(gè)不同于編碼病 毒癌蛋白質(zhì)基因本身的其它基因的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄有影響，即優(yōu)選控制其表達(dá)和/或翻譯， 特別是激活這/這些。這些病毒基因分別優(yōu)選為ElB55kDa，E4orf6, E4orf3和E3ADP以及 前述基因和基因產(chǎn)物的任何組合。按照本發(fā)明使用的腺病毒的另一個(gè)盡管優(yōu)選任選的特征是結(jié)合腫瘤抑制劑Rb。原 則上按照本發(fā)明使用的腺病毒與Rb結(jié)合或不與Rb結(jié)合也在本發(fā)明范圍內(nèi)。兩種腺病毒備 選實(shí)施方案的應(yīng)用可能獨(dú)立于待處理細(xì)胞的Rb狀態(tài)。為了賦予不與Rb結(jié)合的能力，ElA癌蛋白質(zhì)的下列缺失例如是可能的CR1區(qū)域 (Ad5中氨基酸位點(diǎn)30-85)的缺失和CR2區(qū)域(AD5中氨基酸位點(diǎn)120-139)的缺失。在進(jìn)行過程中，CR3區(qū)域被保持和可具有其對其它早期病毒基因的反式激活功能。與此對比，為了給予ElA結(jié)合Rb的能力，下列對ElA癌蛋白質(zhì)的缺失原則上是可 能的CR3區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)140-185)的缺失；N-末端(氨基酸位點(diǎn)1_29)的缺失；氨基 酸位點(diǎn)85-119的缺失；和C-末端(氨基酸位點(diǎn)186-289)的缺失。這里所述的區(qū)域不干擾 E2F與Rb的結(jié)合。然而與野生型Ad5相比反式作用功能仍然降低。在現(xiàn)有技術(shù)中已知的這些病毒通常認(rèn)為是復(fù)制缺陷型。然而本發(fā)明人的貢獻(xiàn)在于 他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們?nèi)匀荒軌蛟谶m當(dāng)背景下特別是細(xì)胞背景下復(fù)制。YB-I在核內(nèi)的存在，優(yōu)選 獨(dú)立于細(xì)胞周期的YB-I在核內(nèi)的存在產(chǎn)生或提供該適當(dāng)?shù)募?xì)胞背景。本文所用的術(shù)語細(xì) 胞或細(xì)胞系統(tǒng)包含細(xì)胞碎片或細(xì)胞裂解物的級分以及體外、體內(nèi)或原位的細(xì)胞。其中，術(shù)語 細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞還包含分別存在于細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物或其它任何體內(nèi) 和原位組織或器官中的細(xì)胞，其為分離的，成組或作為組織、器官或生物體的一部分，或者 也如此在優(yōu)選的活體中存在。生物體優(yōu)選為脊椎生物和更優(yōu)選哺乳動(dòng)物。特別優(yōu)選生物體 是人生物體。

另外，還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，基于本文提供的技術(shù)教導(dǎo)，產(chǎn)生新病毒，該病毒 具有本文所述腺病毒以及YB-I核-陽性細(xì)胞中現(xiàn)有技術(shù)的腺病毒之一的復(fù)制特性。換句 話說，優(yōu)選從已經(jīng)已知的腺病毒開始，可以設(shè)計(jì)另外的病毒，其具有對于按照本發(fā)明應(yīng)用所 需的本文定義的特征。與本發(fā)明相關(guān)，按照本發(fā)明使用的各種腺病毒的修飾的ElA癌蛋白質(zhì)能夠在YB-I 核-陽性細(xì)胞中反式激活早期病毒基因，如例如ElB55K，E4orf3，E4orf6，E3ADP。與其相關(guān)， 優(yōu)選對病毒基因組無另外的其它改變，各種腺病毒可以另外對應(yīng)于野生型的腺病毒或其衍 生物。在本文中公開的編碼反式激活本發(fā)明意義上的癌基因蛋白質(zhì)或包含該癌基因蛋 白質(zhì)的病毒，包含例如腺病毒Ad Δ 24，dl922-947, ElAd/01/07, CB106和/或在歐洲專利EP 0 931 380中所述的腺病毒，其各自能夠反式激活早期基因，如E1B，E2，E3和/或E4，并且 比得上野生型腺病毒，特別是野生型Ad5。ElA蛋白的特定區(qū)域負(fù)責(zé)這些情形中的反式激 活。在各種腺病毒血清型中在ElA蛋白中存在3個(gè)高度保守的區(qū)域。氨基酸位點(diǎn)41-80的 CRl區(qū)域，氨基酸位點(diǎn)120-139的CR2區(qū)域和氨基酸位點(diǎn)140-188的CR3區(qū)域。反式激活功 能主要基于ElA蛋白中CR3區(qū)域的存在。CR3的氨基酸序列在前述腺病毒中未改變。這導(dǎo) 致早期基因E1B，E2，E3和E4的反式激活，其獨(dú)立于核或細(xì)胞質(zhì)中YB-I的存在。然而在重組腺病毒dl520中，CR3區(qū)域已經(jīng)缺失。因此dl520表達(dá)所謂的E1A12S 蛋白，其不包含CR3區(qū)域的氨基酸序列。結(jié)果，dl520僅可以發(fā)揮極弱的反式激活功能，特別 是對E2區(qū)域，因此在YB-I核-陰性細(xì)胞中不復(fù)制。在YB-I核-陽性細(xì)胞中YB-I反式激 活E2區(qū)域和因此允許dl520的有效復(fù)制。這分別是為了本文公開目的的系統(tǒng)如dl520和 基于dl520的系統(tǒng)的應(yīng)用基礎(chǔ)。前述腺病毒組，即δ 24 (本文也稱為Ad Δ 24)和dl520間 的另一重要區(qū)別在于事實(shí)即與YB-I核-陰性細(xì)胞相比，在YB-I核-陽性細(xì)胞中早期基因 ElB, E3和E4被dl520更強(qiáng)烈地反式激活。相反，使用δ 24沒有或僅有微小差異。然而， 與野生型腺病毒相比，dl520和更具體地E1A12S蛋白的反式激活作用顯著降低。然而該反 式激活是足夠的，以便允許在YB-I核-陽性細(xì)胞中有效復(fù)制，如實(shí)施例10所示。在此和特 別是在上下文中描述的ElA蛋白和編碼其的核酸的設(shè)計(jì)以便ElA蛋白與野生型癌基因蛋白質(zhì)ElA相比具有一個(gè)或數(shù)個(gè)缺失和/或突變，其中缺失優(yōu)選是選自包含CR3區(qū)域的缺失和 N-末端的缺失和C-末端的缺失的組，包括和特別優(yōu)選如與(11520或々(1八24，dl922_947， ElAd/01/07，CB106相關(guān)所述的ElA蛋白的那些實(shí)施方案，和/或在歐洲專利EP O 931 830 中所述腺病毒，這些是病毒特別是腺病毒的實(shí)施方案，其復(fù)制由YB-I通過激活E2-晚期啟 動(dòng)子、優(yōu)選主要通過激活E2-晚期啟動(dòng)子控制?；诒疚奶峁┑墓_內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以產(chǎn)生ElA蛋白的另外的允許這種腺病毒復(fù)制形式的實(shí)施方案。

在新構(gòu)建的另外的腺病毒中，其在本文中也稱為衍生物和可以按照本發(fā)明使用， 典型地具有El缺失，E1/E3缺失和/或E4缺失，即相應(yīng)的腺病毒分別不能產(chǎn)生功能活性的 El和/或E3和/或E4表達(dá)產(chǎn)物和各自的產(chǎn)物，或者換句話說，這些腺病毒僅能夠產(chǎn)生在 功能上無活性的El，E3和/或E4表達(dá)產(chǎn)物，其中功能上無活性的El，E3和/或E4表達(dá)產(chǎn) 物因而或者作為表達(dá)產(chǎn)物根本不存在，無論是轉(zhuǎn)錄水平和/或翻譯水平，或者它以至少缺 少一種在野生型腺病毒中具有的功能的形式存在。野生型腺病毒表達(dá)產(chǎn)物的功能為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所已知，例如在 Russell，W. C.，Journal of Virology，81，2573-2604，2000 中描 述。Russell (上文)也描述構(gòu)建腺病毒和腺病毒載體的原理，其結(jié)合于此作為參考。還屬 于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，修飾的ElA癌蛋白質(zhì)，ElB-55K，E4orf6和/或E3ADP(腺病毒死亡蛋 白(ADP)) (Tollefson, A.等，J. Virology，70，2296-2306，1996)在這樣的載體中單獨(dú)或以 任何組合表達(dá)。與其相關(guān)，單獨(dú)命名的基因以及本文公開的轉(zhuǎn)基因可以克隆到El和/或E3 和/或E4區(qū)域中，并且可以借助適當(dāng)啟動(dòng)子或在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下單獨(dú)地表達(dá)。基本上， 區(qū)域E1，E3和E4類似地適合作為腺病毒核酸內(nèi)的克隆位點(diǎn)。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子尤其是與E1A、 特別是修飾的ElA的控制和表達(dá)分別有關(guān)的在本文中公開的那些。最后，在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的腺病毒是關(guān)于E1B、特別是ElB 19kDa缺陷型的。如本文所用，術(shù)語缺陷型通常是指其中ElB不具有所有的野生型內(nèi)在特 性、但是缺乏這些特征中的至少一個(gè)的狀況。在本文中公開的按照本發(fā)明使用的腺病毒基本上在本領(lǐng)域的一些實(shí)施方案中已 知。按照本發(fā)明使用的腺病毒優(yōu)選是重組腺病毒，特別還當(dāng)與野生型相比按照本文提供的 技術(shù)教導(dǎo)已經(jīng)進(jìn)行變化時(shí)。缺失或突變對于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的那些腺病毒核酸序列也在 本領(lǐng)域那些技術(shù)人員的范圍內(nèi)。如本文所述，這些缺失可以例如與編碼E3和E4的核酸的 一部分有關(guān)。如果這些缺失不延伸至蛋白質(zhì)E4orf6，特別優(yōu)選E4缺失，換句話說，按照本發(fā) 明使用的腺病毒編碼E4orf6。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些腺病毒核酸可以還包裝成病毒衣殼 和可以因此形成感染性的顆粒。對按照本發(fā)明的核酸的應(yīng)用同樣如此。應(yīng)當(dāng)注意通常腺病 毒系統(tǒng)可以缺失單個(gè)或數(shù)個(gè)表達(dá)產(chǎn)物。與此相關(guān)，應(yīng)當(dāng)考慮這可能是基于事實(shí)即編碼該表 達(dá)產(chǎn)物的核酸完全被突變或缺失或突變或缺失至基本上不再生產(chǎn)表達(dá)產(chǎn)物的程度，或者基 于控制表達(dá)的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子的缺少，或者其分別在核酸水平上(缺少啟動(dòng)子；順式-作 用元件)或在翻譯系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)水平上(反式-作用元件)以不同于野生型的方式有活 性。特別是稍后方面可能依賴于細(xì)胞背景。除了使用已經(jīng)已知的按照本發(fā)明的腺病毒以外，還可以以與對已經(jīng)公開的本文所 述其它腺病毒相同程度使用新的腺病毒。按照本發(fā)明的新的腺病毒產(chǎn)生于本文提供的技術(shù) 教導(dǎo)。特別優(yōu)選的代表是例如在

圖16和圖17中描述的病毒Xvir03和Xvir03/01，其設(shè)計(jì) 原理也進(jìn)一步在實(shí)施例11和12中舉例說明。
在載體Xvir03的情形中，將CMV啟動(dòng)子克隆到El區(qū)域中，該El區(qū)域編碼被IRES 序列分開的ElB 55K和E4orf6的核酸。由于這兩個(gè)基因和由其生產(chǎn)的基因產(chǎn)物的分別引 入，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型，其確實(shí)地相當(dāng)于一種野生型病毒，其中細(xì)胞、特別是腫瘤細(xì)胞保持了 復(fù)制的選擇性，在具體地在YB-I核-陽性細(xì)胞和更具體地在YB-I被解除管制的細(xì)胞中發(fā) 生復(fù)制的范圍內(nèi)。其中YB-I被解除管制的細(xì)胞優(yōu)選與正?；蚍悄[瘤細(xì)胞相比顯示增加的 YB-I表達(dá)，優(yōu)選與隔室無關(guān)的那些。病毒Xvir03的另外發(fā)展是病毒Xvir03/01，其 中在優(yōu)選實(shí)施方案中治療基因或轉(zhuǎn) 基因在特定啟動(dòng)子、尤其是腫瘤特異性或組織特異性啟動(dòng)子的控制下被克隆。還在該病毒 范圍內(nèi)的是E4區(qū)域也是功能上無活性的，優(yōu)選缺失。本文所述的轉(zhuǎn)基因也可以克隆到E4 區(qū)域中，其中這可以除了轉(zhuǎn)基因克隆到E3區(qū)域中以外或作為其備選而發(fā)生。該治療基因可以是前藥基因，細(xì)胞因子的基因，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的基因，腫瘤抑制基 因，金屬蛋白酶抑制劑和/或血管生成抑制劑的基因。另外，siRNA，適體，反義和核酶可以 過量表達(dá)，其直接針對癌癥相關(guān)的靶分子。優(yōu)選地，單個(gè)或多個(gè)靶分子選自包含抗性相關(guān)因 子，抗細(xì)胞調(diào)亡因子，癌基因，血管生成因子，DNA合成酶，DNA修復(fù)酶，生長因子和它們的受 體，轉(zhuǎn)錄因子，金屬蛋白酶，特別是基質(zhì)金屬蛋白酶和尿激酶類型的纖溶酶原激活物的組。 其優(yōu)選的實(shí)施方案已經(jīng)在本文中公開。可以用于優(yōu)選實(shí)施方案中的可能的前藥基因是例如，胞嘧啶脫氨酶，胸苷激酶，羧 肽酶，尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；嘌呤核苷磷酸化酶(PNP) ；Kirn等，Trends in Molecular Medicine，卷 8，No. 4 (增刊)，2002 ；ffybranietzff. Α.等，Gene Therapy, 8,1654-1664, 2001 ； Niculescu-Duvaz 等，Curr. Opin. Mol. Therapy, 1,480. 486,1999 ；Koyama 等，Cancer Gene Therapy，7，1015-1022，2000 ；Rogers等，Human Gene Therapy,7,2235-2245,1996 ；Lockett 等，Clinical Cancer Res. ,3,2075-2080,1997 ;Vijayakrishna等，J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics,304，1280—1284，2003?？梢杂糜趦?yōu)選實(shí)施方案中的可能的細(xì)胞因子是例如，GM-CSF, TNF-α，11-12, 11-2, 11-6, CSF,干擾素-γ ；Gene Therapy, Advances in Pharmacology,卷 40,編輯 J. Thomas August,Academic Press ；Zhang und Degroot,Endocrinology,144,1393-1398, 2003 ；Descamps 等，J. Mol. Med.，74，183-189，1996 ；Majumdar 等，Cancer Gene Therapy, 7， 1086-1099，2000。可以用于優(yōu)選實(shí)施方案中的可能的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)基因是例如核心蛋白聚糖 Tralhao 等，F(xiàn)ASEB J，17，464-466，2003 ；成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤 94 :Zhang 等，Cancer Res.，63， 760-765，2003 ；Bax 禾Π Bad Zhang 等，Hum. Gene Ther.，20，2051-2064，2002 ；細(xì)胞凋亡素 (apoptin) =Noteborn 禾口 Pietersen，Adv. Exp. MecL Biol. ，465，153—161，2000) ；ADP =Toth 等，Cancer Gene Therapy,10,193-200, 2003 ;bcl_xs :Sumantran 等，Cancer Res,55, 2507-2512,1995 ；E4orf4=Braithwaite 禾口 Russell，Apoptosis，6，359—370，2001 ；FasL, Apo-I 禾口 Trail :Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai 等，PNAC, 94，13862-13867，1997 ；Bims ；Yamaguchi 等，Gene Therapy，10，375-385，2003 ；GNR163 Oncology News，17Juni，2000?？梢杂糜趦?yōu)選實(shí)施方案中的可能的腫瘤抑制基因是例如E1A，p53，pl6，p21，p27， MDA-7。 Opalka 等，Cell Tissues Organs，172，126—132，2002， Ji 等，Cancer Res. ，59，3333-3339，1999，Su 等，癌基因，22，1164-1180，2003?？梢杂糜趦?yōu)選實(shí)施方案中的可能的血管生成抑制劑 是例如血管內(nèi)皮抑素 (endostatin)，血管生長抑素(angiostatin) Hajitou 等，F(xiàn)ASEB J.，16，1802-1804，2002， 和針對 VEGF 的抗體(Ferrara，N.，Semin Oncol 2002 Dec ；29(6Suppl 16) :10_4?？梢杂糜趦?yōu)選實(shí)施方案中的可能的金屬蛋白酶抑制劑是例如Timp-3，Ahonen等， Mol Therapy,5,705-715, 2002 ；PAI-I ；Soff 等，J. Clin. Invest.，96，2593-2600，1995 ； Timp-1, Brandt K. Curr. Gene Therapy,2,255-271,2002。SiRNA(短干擾RNA)由2條、優(yōu)選2條分開的RNA鏈組成，其由于堿基互補(bǔ)性而 彼此雜交，即其基本上堿基配對和優(yōu)選具有高達(dá)50個(gè)核苷酸，優(yōu)選18-30個(gè)核苷酸，更優(yōu) 選少于25個(gè)核苷酸和最優(yōu)選21，22或23個(gè)核苷酸的長度，其中這些數(shù)字是指siRNA的單 鏈，特別是單鏈一段序列的長度，該單鏈分別與一條具體地與第二條單鏈雜交并與其堿基 配對。SiRNA具體地誘導(dǎo)或介導(dǎo)mRNA的降解。siRNA和因此它的結(jié)合位點(diǎn)的序列提供其 所需的特異性。待降解的靶序列基本上與siRNA形成鏈的第一或第二條鏈互補(bǔ)。盡管作 用的確切方式還不清楚，推測siRNA代表細(xì)胞在發(fā)育期間抑制某些等位基因和保護(hù)其自身 免于病毒的生物學(xué)策略。siRNA介導(dǎo)的RNA干擾用于通過引入基因特異的雙鏈RNA來特 異性抑制或甚至完全剔除蛋白質(zhì)的表達(dá)。對于高等生物因此特別優(yōu)選具有19-23個(gè)核苷 酸長度的siRNA，因?yàn)樗粚?dǎo)致非特異性防御反應(yīng)，所謂白介素應(yīng)答的激活。由21個(gè)在3’ 末端具有對稱的2-nt長的突出端的核苷酸組成的雙鏈RNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠介導(dǎo)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中的RNA干擾，并且與其它技術(shù)如核酶和反義分子相比高效(Elbashir，S. Harborth J.Lendeckel W. Yalvcin, A.Weber K Tuschl T :Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells. Nature 2001，411 :494_498)。 僅需要極少siRNA分子以抑制靶基因的表達(dá)。為了避免外源施用的siRNA的限制，該限制 特別在于干擾現(xiàn)象和siRNA分子特異性傳遞的瞬時(shí)性質(zhì)，現(xiàn)有技術(shù)使用允許內(nèi)源性siRNA 表達(dá)的載體。例如，提供具有64個(gè)核苷酸長度的寡核苷酸，其包含19個(gè)核苷酸長的靶序 列，正義和反義方向，通過例如引入載體的9個(gè)核苷酸長的間隔序列分開。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物 折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，其例如具有19個(gè)堿基對的莖結(jié)構(gòu)。環(huán)快速在細(xì)胞中降解以便產(chǎn)生功能 siRNA(BrummeIkamp 等，Science，296，550-553，2002)。pRb和E2F的活性分別通過磷酸化調(diào)節(jié)。pRb的低磷酸化形式主要存在于Gl和 M期。相反，pRb的超磷酸化形式存在于S和G2期。通過pRb的磷酸化從由E2F和低磷酸 化的pRb組成的復(fù)合體中釋放E2F。E2F從由E2F和低磷酸化的pRb組成的復(fù)合體中的釋 放導(dǎo)致E2F依賴性基因的轉(zhuǎn)錄。ElA蛋白不僅結(jié)合低磷酸化形式的pRb，其中ElA與pRb 的結(jié)合大部分通過ElA蛋白的CR2區(qū)域發(fā)生。另外，它還與CRl區(qū)域結(jié)合，盡管親和力較 低(Ben-Israel 和 Kleiberger， Frontiers in Bioscience,7，1369—1395，2002 ;Helt 和 Galloway, Carcinogenesis,24,159-169, 2003)。在按照本發(fā)明使用的腺病毒的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼YB-I的核酸是腺病毒的一 部分，也可以包含介導(dǎo)YB-I轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)的核酸序列。按照本發(fā)明的核酸，腺病毒和腺病毒 系統(tǒng)以及現(xiàn)有技術(shù)已知的腺病毒如例如0nyx-015，AdA24，dl922-947，ElAd/01/07，CB016， dl 520和在專利EP 0 931830中描述的腺病毒可以照這樣使用或與按照本發(fā)明與其結(jié)合 的這些核酸結(jié)合作為腺病毒和腺病毒系統(tǒng)和因此作為相應(yīng)的核酸使用。介導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)的適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄袨楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如在(Whittaker，G. R.等，Virology，246，1-23， 1998 ；Friedberg, E. C.，TIBS 17，347，1992 Jans, D. Α.等，Bioessays 2000Jun ；22 (6) 532-44 ；Yoneda,Y.，J.Biocehm. (Tokyo) 1997May ；121 (5) :811_7 ；Boulikas,T.，Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993 ；3 (3) 193-227 ；Lyons RH, Mol. Cell Biol. ,7,2451-2456, 1987)中描述。與介導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸序列相關(guān)，可以使用不同的原理。一種這樣的原理可 以例如是YB-I與信號肽一起形成融合蛋白，導(dǎo)入核內(nèi)，按照本發(fā)明的腺病毒的復(fù)制于是發(fā) 生?？梢栽诎凑毡景l(fā)明使用的腺病毒的設(shè)計(jì)中實(shí)現(xiàn)的另一原理是可以提供YB-I轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白序列，其優(yōu)選從細(xì)胞質(zhì)中的合成開始，將YB-I導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)或者將YB-I轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核 內(nèi)，并促進(jìn)那的病毒復(fù)制。介導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)具體有效的核酸序列的實(shí)例是HIV的TAT序列，其尤 其適合在 Efthymiadis，A.，Briggs, LJ, Jans, DA.，JBC 273，1623-1628，1998 中描述的那種 類型的核酸序列。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，按照本發(fā)明使用的腺病毒包含編碼肽的核酸序 列，該肽編碼核轉(zhuǎn)運(yùn)。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，YB-I以全長，特別是以對應(yīng)于野生型YB-I的形式存在。 屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，YB-I作為衍生物，如例如縮短或截短形式使用或存在。在本發(fā)明 內(nèi)使用或存在的YB-I衍生物是能夠結(jié)合E2-晚期啟動(dòng)子和因此激活腺病毒E2區(qū)域基因表 達(dá)的YB-1。該衍生物特別包含本文公開的YB-I衍生物。通過在N-末端、在C-末端或在氨 基酸序列內(nèi)缺失單個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸可以產(chǎn)生另外的衍生物。

關(guān)于前述各種另外表達(dá)的由腺病毒編碼的基因和基因產(chǎn)物，還可能這些分別以任 何組合編碼和以任何組合表達(dá)。術(shù)語腺病毒和腺病毒系統(tǒng)在本發(fā)明中應(yīng)當(dāng)具有基本上相同的含義。腺病毒應(yīng)當(dāng)特 別是指包含衣殼和核酸的完整病毒顆粒。術(shù)語腺病毒系統(tǒng)特別集中于事實(shí)即與野生型相比 應(yīng)當(dāng)改變核酸。優(yōu)選這些變化包含腺病毒基因組結(jié)構(gòu)的變化，如由缺失和/或增加和/或 突變啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)序列和/或編碼序列如可讀框產(chǎn)生。另外，術(shù)語腺病毒系統(tǒng)優(yōu)選與例如用 于基因治療的載體結(jié)合使用。前面提供的說明，分別包括腺病毒和腺病毒系統(tǒng)的任何應(yīng)用以及設(shè)計(jì)，也適用于 編碼的核酸，反之亦然。按照本發(fā)明可能的是，按照本發(fā)明使用的腺病毒和編碼其的核酸分別可以是任何 各自的腺病毒核酸，該腺病毒核酸照這樣或與另外的核酸序列結(jié)合導(dǎo)致復(fù)制事件。如本文 所釋，可能通過輔助病毒提供復(fù)制所需的序列和/或基因產(chǎn)物。在提及編碼核酸序列方面 和在該核酸序列已知方面，在本發(fā)明范圍內(nèi)的是不僅使用相同的序列，而且使用其衍生的 序列。術(shù)語衍生序列在本文中應(yīng)當(dāng)特別是指仍產(chǎn)生基因產(chǎn)物(核酸或多肽)的序列，其顯 示對應(yīng)于非衍生序列的一種功能。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的簡單常規(guī)試驗(yàn)確定。 該衍生的核酸序列的實(shí)例是編碼相同基因產(chǎn)物，特別是相同氨基酸序列的那些核酸序列， 然而，由于遺傳密碼的簡并性具有偏離的堿基序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，關(guān)于分別按照本發(fā)明的腺病毒和按照本發(fā)明的腺病毒復(fù)制系 統(tǒng)和按照本發(fā)明它們的應(yīng)用，腺病毒核酸缺乏癌基因蛋白質(zhì)、特別是ElA蛋白的表達(dá)，這意 味著它或者不編碼12S ElA蛋白或13S ElA蛋白，或者它即不編碼12S ElA蛋白又不編碼 13S ElA蛋白，或被修飾，如本文所定義，腺病毒復(fù)制系統(tǒng)另外包含輔助病毒的核酸，其中輔助病毒的核酸包含編碼癌基因蛋白質(zhì)的、特別是ElA蛋白的核酸序列，其具有下列特性和 分別賦予腺病毒下列特性，即它優(yōu)選不在YB-I核-陰性細(xì)胞中復(fù)制而在獨(dú)立于細(xì)胞周期 的YB-I核-陽性細(xì)胞中復(fù)制，在YB-I核-陽性細(xì)胞中反式激活至少一個(gè)病毒基因，特別是 ElB55kDa，E4orf6，E4orf3和/或E3ADP，和/或不將細(xì)胞YB-I轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。在本發(fā)明范圍 內(nèi)的是，本文所述轉(zhuǎn)基因由輔助病毒單獨(dú)或一起編碼和/或由其表達(dá)。在按照本發(fā)明的這種腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒核酸和/或輔助 病毒的核酸另外作為能夠復(fù)制的載體存在。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，編碼按照本發(fā)明使用的腺病毒的編碼核酸存在載體中， 優(yōu)選表達(dá)載 體中，該表達(dá)載體按照本發(fā)明使用。在另一方面，本發(fā)明還涉及包含至少兩個(gè)載體的載體組，其中載體組包含如本文 所述的完全的腺病毒復(fù)制系統(tǒng)，按照本發(fā)明使用載體組。意欲腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的每種元件 排列在單個(gè)載體、優(yōu)選表達(dá)載體上。另外，本發(fā)明另一方面涉及為了本文所述相同目的的細(xì)胞對腺病毒的應(yīng)用，其中 細(xì)胞包含一個(gè)或數(shù)個(gè)核酸和/或各自的腺病毒復(fù)制系統(tǒng)和/或各自的載體和/或按照本發(fā) 明的載體組，所述核酸編碼本文所述的按照本發(fā)明使用的腺病毒。前述腺病毒構(gòu)建體和特別是它們的核酸和編碼其的核酸，可以分份導(dǎo)入細(xì)胞，特 別是腫瘤細(xì)胞中，于是由于各種單獨(dú)元件的存在，它們可以這樣一起作用，好像單個(gè)元件分 別來源于單個(gè)核酸和單個(gè)或數(shù)個(gè)腺病毒。按照本發(fā)明使用的編碼腺病毒、腺病毒系統(tǒng)或其部分的核酸可以作為載體存在。 優(yōu)選地，它們可以作為病毒載體存在。在包含腺病毒核酸的核酸的情形中，病毒顆粒優(yōu)選為 載體。然而，也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，所述核酸以質(zhì)粒載體存在。在任何情形中載體包含分 別提供插入核酸增殖(即復(fù)制)和插入核酸任選表達(dá)和控制它們的元件。適當(dāng)?shù)妮d體，特別 是表達(dá)載體和對應(yīng)的元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如在Grunhaus，Α.，Horwitz, Μ. S.， 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C. , edit., Seminars inVirology, London Saunders Scientific Publications 中描述。本發(fā)明涉及載體組的方面說明前述實(shí)施方案，核酸的各種元件不一定僅包含在一 個(gè)載體上。因此，載體組包含至少兩個(gè)載體。另外，關(guān)于載體所述的也分別適用于載體和載 體組。按照本發(fā)明使用的腺病毒其特征分別在于本文公開的各種核酸和基因產(chǎn)物， 并可以另外包含所有那些本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的元件，如對于野生型腺病毒同樣如此 (Shenk, T. :Adenoviridae :The virus and their replication. Fields Virology,第三 版，edit. Fields, B. N. , Knipe, D. Μ. , Howley, P.M.等，Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996，第 67 章)。腺病毒的復(fù)制是非常復(fù)雜的過程，通常利用人轉(zhuǎn)錄因子E2F。首先在病毒復(fù)制期 間，表達(dá)“早期基因’ 1，Ε2，Ε3和E4?！巴砥诨颉苯M負(fù)責(zé)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的合成。對于早期以 及晚期基因的激活，由編碼不同的ElA和ElB蛋白的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元ElA和ElB組成的El區(qū) 域是關(guān)鍵的，因?yàn)棣?，Ε3和Ε4的轉(zhuǎn)錄由它們誘導(dǎo)(Nevins，J. R.，Cell 26，213-220，1981)。 另外，ElA蛋白可以誘導(dǎo)剩余細(xì)胞中的DNA合成，和因此開始進(jìn)入S期(c. f. Boulanger ^P Blair, 1991) 0另外，它們與Rb類的腫瘤抑制劑相互作用(Whyte, P.等，Nature 334，124-127,1988)。在這種情況下，釋放細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F因子可以隨后結(jié)合細(xì)胞以及 病毒基因的相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域(特別是腺病毒E2早期啟動(dòng)子)和其中引發(fā)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制 (Nevins, J. R.，Science258，424—429，1992)。復(fù)制的引發(fā)和完成分別特別需要E2區(qū)域的基因產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈兙幋a三個(gè)關(guān)鍵蛋 白。E2蛋白的轉(zhuǎn)錄受兩個(gè)啟動(dòng)子控制，“E2-早期E2F-依賴型”啟動(dòng)子，其在本文中也稱 為E2-早期啟動(dòng)子或早期E2啟動(dòng)子，和“E2-晚期”啟動(dòng)子(Swaminathan和Thimmapaya， The Molecular Repertoire ofAdenoviruses III Current Topics in Microbiology and Immunology，卷 199，177-194，Springer Verlag 1995)。另外，E4 區(qū)域的產(chǎn)物與 ElA 和ElB-55kDa蛋白一起分別對E2F的活性和p53的穩(wěn)定性起重要作用。例如，通過由 E4區(qū)域編碼的E4orf6/7與由E2F和DPl組成的雜二聚體直接相互作用更加激活啟動(dòng)子 (Swaminathan 和 Thimmapaya, JBC 258，736-746，1996)。另外，由 ElB_55kDa 和 E4orf6 組 成的復(fù)合體使 P53 失活(Steegenga，W. Τ.等，Oncogene 16，349-357，1998)，以便成功完 成裂解性感染周期。另外，ElB-55kDa蛋白顯示另一重要功能，即它通過與E4orf6蛋白 相互作用促 進(jìn)病毒RNA從核中輸出，其中細(xì)胞所有的RNA保持在核內(nèi)(Bridge和Ketner， Virology 174，345-353，1990)。另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，由ElB_55kDa/E4orf6組成的蛋白質(zhì)復(fù) 合體定位于所謂的“病毒內(nèi)含體”。推測這些結(jié)構(gòu)是復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)(Ornelles和Shenk， J. Virology 65，424-429，1991)。對于復(fù)制和特別是對于腺病毒釋放重要的另一區(qū)域是E3區(qū)域。E3區(qū)域更具體地 包含多種較小蛋白的遺傳信息，該較小蛋白不是腺病毒體外感染周期所必需的，即在細(xì)胞 培養(yǎng)中不是必需的。然而，它們對于體內(nèi)急性和/或潛伏侵染期間病毒的存活起重要作用， 因?yàn)樗鼈冇绕渚哂忻庖哒{(diào)節(jié)和細(xì)胞調(diào)亡功能(Marshall S. Horwitz, Virololgie, 279,1-8, 2001 ；Russell，上文)。可以表明具有約11. 6kDa的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。由于其功能，該蛋 白質(zhì)稱為 ADP-英文術(shù)語腺病毒死亡蛋白-(Tollefson，J. Virology, 70，2296-2306，1996)。 該蛋白質(zhì)主要在感染周期的晚期形成。另外，蛋白質(zhì)的過量表達(dá)導(dǎo)致感染細(xì)胞的更好裂解 (Doronin 等，J. Virology, 74，6147-6155，2000)。另外，本發(fā)明人已知ElA缺失病毒，即具體地不含有12S ElA蛋白質(zhì)和也不表 達(dá)13S ElA蛋白質(zhì)的病毒可以在較高M(jìn)OI下非常高效的復(fù)制(Nevins J. R. , Cell 26， 213-220，1981)，其然而不能在任何臨床應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)。該現(xiàn)象在文獻(xiàn)中稱為“類ElA活性”。 還已知從ElA編碼的5個(gè)蛋白中，兩個(gè)蛋白，S卩12S和13S蛋白，分別控制和誘導(dǎo)其它腺 病毒基因的表達(dá)(Nevins, J. R.，Cell 26，213-220，1981 ；Boulanger，P. und Blair, Ε.； Biochem. J. 275，281-299，1991)。與其相關(guān)，顯示反式激活功能主要由13S蛋白的CR3區(qū)域 提供(Wong HK und ZiffEB.，J Virol.，68，4910-20，1994)。在 13S 蛋白的 CRl 和 / 或 CR2 區(qū)域和/或CR3區(qū)域具有特定缺失的腺病毒大部分是復(fù)制缺陷型，然而，在一些細(xì)胞系中 特別是E2區(qū)域中病毒基因和啟動(dòng)子仍分別被反式激活(Wong HK, Ziff EB.，J Virol. 68， 4910-20，1994；Mymryk, J.S. and Bayley, S. Τ.，Virus Research 33,89—97，1994)。在使用野生型腺病毒感染細(xì)胞、典型地腫瘤細(xì)胞以后，由E1A，E1B-55K和E4orf6 介導(dǎo)將YB-I導(dǎo)入核內(nèi)，與E1B-55K共定位于病毒內(nèi)含體的核內(nèi)，這允許病毒在體外和 體內(nèi)在細(xì)胞核內(nèi)有效復(fù)制。與其相關(guān)，先前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E4orf6結(jié)合E1B-55K (Weigel, S.禾口 Dobbelstein，M. J. Virology，74，764-772，2000 ;Keith N. Leppard, Seminars inVirology, 8, 301-307，1998)，和因此分別介導(dǎo)E1B-55K轉(zhuǎn)運(yùn)和分配到核內(nèi)，其分別提供最 佳病毒生產(chǎn)和腺病毒復(fù)制。由于E1A，E1B-55K和YB-I的相互作用，通過分別由E1B-55K/ E4orf6和YB-I組成的復(fù)合體，YB-I和E1B-55K在核內(nèi)在所謂的病毒內(nèi)含體中的共定位，按 照本發(fā)明的病毒的有效復(fù)制是可能的，和因此本文所述病毒用于YB-I核-陽性細(xì)胞的復(fù)制 和用于制備治療疾病的藥物，其中涉及YB-I核-陽性細(xì)胞。該細(xì)胞背景這種可能的復(fù)制導(dǎo) 致細(xì)胞的裂解，病毒的釋放和相鄰細(xì)胞的感染和裂解，因此在分別感染腫瘤細(xì)胞和腫瘤的 情形中，腫瘤的最終裂解，即溶癌作用發(fā)生。YB-I屬于高度保守因子的類別，其與反向CAAT序列，所謂的Y-盒結(jié)合。它們可 以以調(diào)節(jié)的方式在轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平上有活性(Wolffe，A. P. Trends in Cell Biology 8， 318-323，1998)。增長數(shù)量的Y-盒依賴性調(diào)節(jié)途徑在生長和細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)基因的激活和 抑制中發(fā)現(xiàn)(Swamynathan, S. K.等，F(xiàn)ASEB J. 12，515-522，1998)。因此，YB-1 直接與 p53 相互作用(Okamoto，T. et al.，Oncogene 19，6194-6202，2000)，在 Fas 基因表達(dá)(Lasham, A.等，Gene252，1-13，2000)，MDR 和 MRP 基因表達(dá)(Stein，U.等，JBC 276,28562-69, 2001 ；Bargou, R. C.等，Nature Medicine 3，447-450，1997)和拓?fù)洚悩?gòu)酶和金屬蛋白酶 的激活(Mertens. P. R.等，JBC 272, 22905-22912,1997 ；Shibao, K.等，Int. J. Cancer 83， 732-737,1999)中起重要作用。另外，YB-I涉及mRNA穩(wěn)定性(Chen, C-Y.等，Genes & Development 14，1236-1248，2000)和修復(fù)過程(Ohga, T.等， Cancer Res. 56，4224-4228， 1996)的調(diào)節(jié)。YB-I在腫瘤細(xì)胞中的核定位導(dǎo)致獨(dú)立于ElA的病毒復(fù)制，其中具體地12S ElA蛋 白或13S ElA蛋白分別都不以表達(dá)形式存在和使用(Holm,P. S.等JBC 277，10427-10434， 2002)，和在蛋白質(zhì)YB-I過量表達(dá)的情形中多藥耐藥性(多重抗性)。另外，已知腺病毒 蛋白質(zhì)如例如E4orf6和E1B-55K對病毒復(fù)制具有正效果(Goodrum, F. D.和Ornelles， D. A, J. Virology 73，7474-7488，1999)，其中功能ElA蛋白負(fù)責(zé)開啟其它病毒基因產(chǎn)物(如 E4orf6, E3ADP 和 E1B-55K) (Nevins J. R.，Cell 26，213-220，1981)。這然而用現(xiàn)有技術(shù)的 ElA-minus腺病毒不發(fā)生，在該腺病毒中不存在13S ElA蛋白。YB-I在核內(nèi)含有YB-I的多 藥耐藥性細(xì)胞中的核定位分別提供該ElA-minus病毒的復(fù)制和顆粒信息。然而在該情形 中，與野生型Ad5相比，病毒復(fù)制和顆粒形成的效率減少數(shù)倍。YB-I的組合已經(jīng)意外地發(fā) 現(xiàn)是通過YB-I介導(dǎo)極有效的病毒復(fù)制和顆粒形成的系統(tǒng)和因此提供溶癌作用，該YB-I或 者已經(jīng)存在于腫瘤細(xì)胞的核內(nèi)，或者通過外部因素(例如施用細(xì)胞生長抑制劑或照射或過 熱)引入腫瘤細(xì)胞，即促進(jìn)存在于核內(nèi)，特別是獨(dú)立于細(xì)胞周期，或者作為轉(zhuǎn)基因通過載體 用系統(tǒng)、優(yōu)選腺病毒系統(tǒng)導(dǎo)入，該腺病毒系統(tǒng)開啟腺病毒基因但不允許病毒復(fù)制。適當(dāng)?shù)募?xì) 胞生長抑制劑尤其是屬于下列各組的那些蒽環(huán)霉素，如道諾霉素和阿霉素；烷化劑，如環(huán) 磷酰胺；生物堿類，如依托泊苷；vin-生物堿類，如長春新堿和長春堿；抗代謝藥如5-氟尿 嘧啶和methrotrexate ；鉬衍生物，如例如順鉬；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，如camphothecine ；和 紫杉烷類，如例如紫杉醇(taxole)。本文公開的腺病毒，特別是重組腺病毒，僅能夠在YB-I 核_陽性細(xì)胞中復(fù)制，與野生型腺病毒、特別是野生型Ad5相應(yīng)的反式激活能力相比，在它 們反式激活病毒基因ElB-55K，E4orf6，E4orf3和E3ADP的能力方面有限。本發(fā)明人現(xiàn)在意 外地發(fā)現(xiàn)這些有限的反式激活能力可以通過相應(yīng)的基因特別是通過E1B-55K和E4orf6的 表達(dá)結(jié)合YB-I的核定位來補(bǔ)償。如本文實(shí)施例所示，在該條件下病毒復(fù)制和顆粒形成分別增加至比得上野生型腺病毒復(fù)制和顆粒形成行為的水平。意欲與其相關(guān)或用于制備的藥物通常系統(tǒng)施用，盡管局部施用或傳遞該藥物也在 本發(fā)明范圍內(nèi)，在該藥物中按照本發(fā)明使用本文所述的腺病毒。完成該施用意欲特別是用 腺病毒感染那些細(xì)胞和特別是在這些細(xì)胞中復(fù)制發(fā)生，其優(yōu)選以因果的方式在病癥，典型 地疾病的形成中涉及，為了診斷和/或預(yù)防和/或治療該疾病使用按照本發(fā)明的藥物。這種藥物優(yōu)選用于治療腫瘤疾病。在腫瘤疾病中，特別優(yōu)選其中由于構(gòu)成腫瘤疾 病的機(jī)制、特別是構(gòu)成基礎(chǔ)的病理學(xué)機(jī)制導(dǎo)致YB-I已經(jīng)定位于核內(nèi)的那些，或者其中由于 外源措施導(dǎo)致YB-I存在于核內(nèi)的那些，其中該措施適合將YB-I轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，在那誘導(dǎo)YB-I 或在那表達(dá)YB-I。本文所用的術(shù)語腫瘤或腫瘤疾病應(yīng)當(dāng)包含惡性以及良性腫瘤和各種疾 病。可以預(yù)期藥物包含至少一種另外的藥物活性化合物。這種另外的藥物活性化合物的種 類和數(shù)量將取決于藥物使用的適應(yīng)癥。在藥物用于治療和/或預(yù)防腫瘤疾病的情形中，典 型地使用細(xì)胞生長抑制劑，如例如順鉬和紫杉醇，道諾紅菌素， 正定霉素，阿霉素和/或米 托蒽醌或本文所述的其它細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞生長抑制劑組。按照本發(fā)明的藥物可以以各種制劑存在，優(yōu)選液體形式。另外，藥物將包含穩(wěn)定 齊U，緩沖劑，防腐劑和藥物制劑領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這種試劑。本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)本文所述病毒按照本發(fā)明的應(yīng)用可以以非常高的成功 率應(yīng)用于腫瘤，其在核內(nèi)獨(dú)立于細(xì)胞周期含有YB-1。通常，YB-I位于細(xì)胞質(zhì)中，特別是還 在核周胞質(zhì)中。在細(xì)胞周期的S-期期間，在正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中可以發(fā)現(xiàn) YB-1。然而使用這樣修飾的腺病毒，這不足以提供病毒的溶癌作用?，F(xiàn)有技術(shù)中所述的 這種減毒腺病毒的較小功效是最終基于它們的錯(cuò)誤應(yīng)用。換句話說，當(dāng)施用如本文所述 減毒或修飾的病毒時(shí)，特別是也以增加的功效可以使用這些腺病毒系統(tǒng)，其中提供病毒溶 癌作用的分子生物學(xué)先決條件。在如本文所述按照本發(fā)明使用的所述腺病毒，如AdA 24， dl922-947，ElAd/01/07，CB016，dl520和在歐洲專利EP 0 931 830中描述的重組腺病毒的 情形中，在腫瘤疾病的情形中提供先決條件，在腫瘤疾病中其細(xì)胞顯示獨(dú)立于細(xì)胞周期的 YB-I的核定位。這種形式的核定位可以是由腫瘤自身種類導(dǎo)致或可以是由本文公開的按 照本發(fā)明的措施或試劑導(dǎo)致。本發(fā)明因此分別定義一組新腫瘤和腫瘤疾病，和因此患者，其 也可以按照本發(fā)明用病毒、特別是也用現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述的減毒或修飾的腺病毒成功治 療。另一組患者是確保通過施加或?qū)崿F(xiàn)不同條件YB-I遷移到核內(nèi)或引入那或轉(zhuǎn)移其 中的那些患者，其可以按照本發(fā)明使用腺病毒治療，這些腺病毒中的一些已知并可以按照 本發(fā)明使用，或者使用在本文中第一次描述的腺病毒治療，特別是使用分別在ElA蛋白中 具有突變和缺失的這些腺病毒，其不干擾Rb/E2f的結(jié)合但不在YB-I核-陰性細(xì)胞中復(fù)制 或者分別具有或顯示強(qiáng)烈減少的如本文定義的復(fù)制，和/或缺失的癌蛋白質(zhì)，特別是E1A， 如例如病毒Ad Δ 24，dl922-947, ElAd/01/07, CB106和在歐洲專利EPO 931 830中描述的 腺病毒。與這組患者相關(guān)的這些腺病毒的應(yīng)用是基于發(fā)現(xiàn)即，病毒復(fù)制的誘導(dǎo)是基于YB-I 的核定位，YB-I隨后與E2-晚期啟動(dòng)子結(jié)合。由于本文公開的發(fā)現(xiàn)，腺病毒如AdA24， dl922-947，ElAd/01/07，CB106和/或歐洲專利EP 0 931 830描述的腺病毒也可以在YB-I 核_陽性的細(xì)胞中和/或在其中如本發(fā)明所定義YB-I被解除管制的細(xì)胞中復(fù)制。因此，按 照本發(fā)明這些腺病毒可以分別用于治療疾病和各類患者，其包含具有這些特性的細(xì)胞，特別是當(dāng)這些細(xì)胞涉及待治療的各種疾病的形成時(shí)。這是Ad Δ 24，dl922-947，ElAd/01/07, CB016和在專利EP O 931 830中描述的腺病毒按照本發(fā)明治療這些腫瘤的成功基礎(chǔ)，這些 腫瘤獨(dú)立于細(xì)胞周期在核內(nèi)含有YB-I或者其中YB-I在本公開內(nèi)容的意義上被解除管制。 可以按照本發(fā)明使用本文描述的可按本發(fā)明使用的腺病毒和使用那些病毒，特別是在本文 中第一次描述的腺病毒治療的另一組患者是YB-I核-陽性和/或因?yàn)橄铝兴鲋委煂?dǎo)致 YB-I核-陽性的那些和/或已經(jīng)與給藥各種病毒相伴進(jìn)行該治療的那些患者，其中該治療 優(yōu)選為藥物治療。在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，YB-I核-陽性患者是獨(dú)立于細(xì)胞周期在多個(gè)形成 腫瘤的細(xì)胞內(nèi)在核內(nèi)含有YB-I的患者。在這些中治療是完全給藥如本文所述的細(xì)胞生長 抑制劑和/或如腫瘤治療所用。另外，輻射，優(yōu)選如腫瘤治療中所用的輻射，屬于這類治療。 輻射特別是指使用高能輻射的輻射，優(yōu)選放射性輻射，優(yōu)選如腫瘤治療中所用。過熱和應(yīng)用 過熱，優(yōu)選在腫瘤治療中使用的過熱，是另外的治療。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，局部施加 過熱。最后，激素治療，特別是如腫瘤治療中使用的激素治療，是另外的治療。與該激素治 療相關(guān)使用抗雌激素和/或抗雄激素?？勾萍に厝缢舴遥貏e是在乳腺癌的治療中，和 抗雄激素如例如氟他胺或醋酸環(huán)丙孕酮，用于前列腺癌的治療中。

在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，一些形成腫瘤的細(xì)胞包含YB-I或包含本公開內(nèi)容意義上 解除管制的YB-1，該YB-I分別是內(nèi)在的或在誘導(dǎo)和活性導(dǎo)入核內(nèi)以后包含的。優(yōu)選地，約 5%或以上任何百分比，S卩6%，7%，8%等的腫瘤形成細(xì)胞是這種YB-I核-陽性細(xì)胞或其中 YB-I以解除管制方式存在的細(xì)胞。分別通過外界施加的脅迫和通過局部外加脅迫可以誘導(dǎo) YB-I的核定位。這種誘導(dǎo)可以例如通過輻射、特別是UV輻射，施用如尤其已經(jīng)在本文中公 開的細(xì)胞生長抑制劑，和過熱來發(fā)生。關(guān)于過熱，關(guān)鍵的是現(xiàn)在可以以非常特定的方式，更 具體以局部非常特定的方式實(shí)現(xiàn)，因此也可以提供YB-I在細(xì)胞核內(nèi)特定的核定位，因此， 提供腺病毒復(fù)制和因此細(xì)胞和腫瘤裂解的先決條件，其優(yōu)選局部限制(Stein U, Jurchott K, ffaltherff, Bergmann S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001，276 (30) :28562_9 ； Hu Z, Jin S,Scotto Kff. J Biol Chem. 2000Jan 28 ；275 (4) 2979-85 ；Ohga T, Uchiumi T, Makino Y,Koike K，Wada M,Kuwano M,Kohno K. J Biol Chem. 1998,273(11) :5997_6000)。按照本發(fā)明的藥物因此也可以施用于患者和患者組，或可以期望他們，其中通過 適當(dāng)預(yù)治療或伴隨處理實(shí)現(xiàn)YB-I的轉(zhuǎn)運(yùn)，優(yōu)選在各種腫瘤細(xì)胞中?；谠摷夹g(shù)教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員在其技術(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，特別是對 E1A，其例如可以包含缺失或點(diǎn)突變以便因此產(chǎn)生腺病毒的各種實(shí)施方案，其可以結(jié)合按照 本發(fā)明的應(yīng)用來使用。如以上已經(jīng)解釋，按照本發(fā)明使用的腺病毒能夠分別在核中含有YB-I的這些細(xì) 胞和細(xì)胞系統(tǒng)中復(fù)制。為了回答按照本發(fā)明使用的腺病毒是否能夠復(fù)制和因此能夠裂解腫 瘤的問題，關(guān)于Rb，即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤抑制產(chǎn)物存在或不存在的細(xì)胞狀態(tài)是不相關(guān)的。 另外，關(guān)于所述腺病毒按照本發(fā)明的應(yīng)用，不需要考慮感染細(xì)胞、待感染細(xì)胞或待治療細(xì)胞 的P53的狀態(tài)，因?yàn)橥ㄟ^使用本文公開的腺病毒系統(tǒng)，關(guān)于YB-I核-陽性細(xì)胞，即獨(dú)立于細(xì) 胞周期在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞，該p53狀態(tài)以及Rb狀態(tài)對本文公開的技術(shù)教導(dǎo)的完成無 影響。分別地癌基因和癌基因蛋白質(zhì)，特別是E1A，可以在所有天然腺病毒啟動(dòng)子的控 制下和/或通過腫瘤或組織特異性啟動(dòng)子控制。適當(dāng)?shù)姆窍俨《締?dòng)子可以選自包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動(dòng)子，基于腺病毒的啟動(dòng)子Va I和非病毒YB-I 啟動(dòng)子(Makino Y.等，NucleicAcids Res. 1996，15，1873-1878)?？梢赃B同本文公開的 本發(fā)明各個(gè)和任何方面使用的另外的啟動(dòng)子包含端粒酶啟動(dòng)子，甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子， caecinoembryonic 抗原啟動(dòng)子(CEA) (Cao, G. , Kuriyama, S. , Gao, J. , Mitoro, A. , Cui, L. , Nakatani, Τ. , Zhang, X. , Kikukawa, Μ. , Pan, Χ. , Fukui, H. , Qi, Ζ. Int. J. Cancer, 78, 242-247，1998)，L-絲束蛋白啟動(dòng)子(Chung，I. , Schwartz, ΡΕ.，Crystal，RC.，Pizzorno，G， Leavitt, J.，Deisseroth, AB. Cancer GeneTherapy, 6,99-106,1999)，精氨酸血管升壓素啟 動(dòng)子(Coulson, JM, Staley，J.，ffoll, PJ. British J. Cancer, 80,1935-1944，1999)，E2f 啟 動(dòng)子(Tsukada 等 Cancer Res. , 62, 3428-3477), uroplakine II 啟動(dòng)子(Zhang 等，Cancer Res.，62，3743-3750，2002)和 PSA 啟動(dòng)子(Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D. , Stewart, D. , Lin, J. , Phipps, S. , Chiang, YL. Human GeneTherapy,10,1721-1733, 1999)。另外，如德國專利申請DE 10150984. 7所述的腺病毒的YB-I依賴性E2-晚期啟動(dòng) 子是可以用于本發(fā)明的啟動(dòng)子。已知端粒酶啟動(dòng)子在人類細(xì)胞中極其重要。因此，端粒酶活性通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄 酶基 因(hTERT)的轉(zhuǎn)錄控制調(diào)節(jié)，其是酶的催化亞基。端粒酶的表達(dá)在85%的人類腫瘤 細(xì)胞中有活性。與其相反，它在大多數(shù)正常細(xì)胞中無活性。免于其的是生殖細(xì)胞和胚胎 組織(Braunstein, I.等，CancerResearch, 61, 5529-5536, 2001 ；Majumdar, A. S.等，Gene Therapy 8，568-578，2001)。對hTERT啟動(dòng)子更詳細(xì)的研究已顯示遠(yuǎn)離起始密碼子的啟動(dòng) 子283bp和82bp的片段分別足以在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)(Braunstein I.等；Majumdar AS et al.，上文)。因此，該啟動(dòng)子和特定片段分別適合提供基因和特別是轉(zhuǎn)基因、優(yōu)選 本文公開的轉(zhuǎn)基因之一僅在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)。啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)允許修飾的癌基因、 優(yōu)選ElA癌基因蛋白質(zhì)僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。此外，在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因在該腺病 毒載體中的表達(dá)在這些啟動(dòng)子中任何一個(gè)的控制下，所述轉(zhuǎn)基因特別是選自包含E4orf6， ElB55kD，ADP和YB-I的組。還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，反式激活癌基因蛋白質(zhì)，特別是ElA 蛋白的可讀框在一個(gè)或數(shù)個(gè)腺病毒系統(tǒng)的基因產(chǎn)物的框架內(nèi)。然而，反式激活ElA蛋白的 可讀框也可以是相對于其獨(dú)立。期望關(guān)于用于裂解的細(xì)胞的特性，在一個(gè)實(shí)施方案中這些有抗性，優(yōu)選具有多藥 耐藥性或多重抗性，在所述裂解中按照本發(fā)明使用本文所述的腺病毒。本文所述的抗性，優(yōu) 選是指對本文所述的細(xì)胞生長抑制劑的抗性。該多藥耐藥性抗性優(yōu)選與膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 P-糖蛋白的表達(dá)，優(yōu)選過量表達(dá)有關(guān)，該P(yáng)-糖蛋白可以用作確定各種細(xì)胞的標(biāo)記和因此還 可以用于具有該多藥耐藥性的腫瘤和各類患者。本文所用的術(shù)語抗性包含P-糖蛋白介導(dǎo) 的抗性，其也稱為常規(guī)抗性，以及非典型抗性，其包含通過MRP介導(dǎo)的抗性或其它非-P-糖 蛋白介導(dǎo)的抗性。另一個(gè)與YB-I表達(dá)相關(guān)的標(biāo)記是拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa。因此，在篩選確定 患者是否可以使用按照本發(fā)明的腺病毒治療而期望成功中，可以使用拓?fù)洚悩?gòu)酶II α的 表達(dá)代替或加上YB-I在核內(nèi)的確定。另一可以基本上以類似于P-糖蛋白的方式使用的 標(biāo)記是MRP。至少就結(jié)直腸癌細(xì)胞或患結(jié)直腸癌的患者而言，另一個(gè)標(biāo)記是PCNA(engl. proliferating cell nuclear antigen) (Hasan S.等，Nature，15，387—391，2001)，如例如 Shibao K.等所述(Shibao K等，Int. Cancer，83，732-737，1999)。最后，MDR(multiple drug resistance)的表達(dá)是在上述意義上的標(biāo)記(Oda Y 等，Clin. Cancer Res.，4，2273-2277，1998)，至少對于乳腺癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞而言?？梢园凑毡景l(fā)明使用的另一個(gè)可能的標(biāo) i己 ^ p73 (Kamiya, Μ. ， Nakazatp, Y. ， J Neurooncology 59,143-149(2002) ；Stiewe 等， J. Biol. Chem.，278，14230-14236，2003)。因此本發(fā)明的一個(gè)特殊優(yōu)勢是如本文所述按照本發(fā)明使用腺病毒也可以治療患 者，這些患者否則被認(rèn)為是在臨床意義上不再可治療和當(dāng)另外的按照現(xiàn)有技術(shù)方法的腫瘤 疾病治療不再可能期望獲得成功時(shí)，特別是當(dāng)細(xì)胞生長抑制劑的使用不再合理可能和不再 可以在影響或減少腫瘤的意義上成功進(jìn)行時(shí)。術(shù)語腫瘤在本文通常是指各種和任何腫瘤或 癌癥疾病，其固有地在核內(nèi)包含YB-I或由于實(shí)現(xiàn)本文所述的外加措施導(dǎo)致優(yōu)選獨(dú)立于細(xì) 胞周期在核內(nèi)包含YB-1。另外，本文所述的病毒通常可以用于治療腫瘤。優(yōu)選地，這些腫瘤選自包含乳腺 癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，黑素瘤，小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌的組。另外的 腫瘤是如本文所述有抗性的那些，優(yōu)選具有多重抗性的那些，還特別優(yōu)選上述組的那些腫
瘤。 另一方面本發(fā)明涉及篩選患者的方法，該患者可以使用一種修飾的腺病毒，即按 照本發(fā)明使用的腺病毒如例如AdA24，dl922-947，ElAd/0I/07, CB016或歐洲專利EP O 931 830中描述的病毒治療，其中該方法包含下列步驟-檢查腫瘤組織的樣品和-確定YB-I是否獨(dú)立于細(xì)胞周期定位于核內(nèi)。可以檢測上述標(biāo)記的存在以代替或加上YB-1。在腫瘤組織或其部分特別是獨(dú)立于細(xì)胞周期在核內(nèi)包含YB-I的情形中，可以按 照本發(fā)明的實(shí)施使用本文公開的腺病毒。在按照本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用試劑完成腫瘤組織的檢查，該試 劑選自包含針對YB-I的抗體，針對YB-I的適體，和針對YB-I的spiegelmer以及針對YB-I 的抗促成素的組?；旧?，對于相應(yīng)的標(biāo)記可以產(chǎn)生相同的方法和相應(yīng)地使用?？贵w，特別 是單克隆抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。特異性檢測YB-I或標(biāo)記的另一種方法是 與靶結(jié)構(gòu)以高親和力結(jié)合的肽，在本發(fā)明情形中靶結(jié)構(gòu)為YB-I或所述標(biāo)記。在現(xiàn)有技術(shù) 中已知方法如噬菌體_展示以便產(chǎn)生這些肽。典型地，將肽庫當(dāng)作起始點(diǎn)，其中單個(gè)肽具有 8-20個(gè)氨基酸的長度，庫的大小約為102-1018，優(yōu)選IO8-IO15種不同的肽。一種特殊形式的 靶分子結(jié)合多肽是所謂的抗促成素，其例如在德國專利申請DE 197 42 706中描述。特異性結(jié)合YB-I或本文公開的相應(yīng)的標(biāo)記和因此檢測獨(dú)立于細(xì)胞周期的YB-I在 細(xì)胞核內(nèi)的定位的另一種方法是所謂的適體，即D-核酸，其作為RNA或DNA，作為單鏈或雙 鏈存在并特異性地與靶分子結(jié)合。適體的產(chǎn)生例如在歐洲專利EP O 533 838中描述。一 種具體形式的適體是所謂的aptazyme，其例如在Piganeau，N.等(2000)，Angew. Chem. Int. Ed. ,39,no. 29，第4369-4373頁中描述。這些是適體的具體實(shí)施方案，因?yàn)樗鼈兂诉m體部 分包含核酶部分，并且在結(jié)合或釋放結(jié)合適體部分的靶分子以后獲得催化活性和切割核酸 底物，其伴隨著信號的產(chǎn)生。另一種形式的適體是所謂的spiegelmer，即由L-核酸制成的靶分子結(jié)合核酸。制 備該spiegelmer的方法例如在WO 98/08856中描述。通過穿刺或通過外科手術(shù)可以獲得腫瘤組織的樣品。評估YB-I是否獨(dú)立于細(xì)胞周期而定位于核內(nèi)經(jīng)常通過使用顯微鏡技術(shù)和/或免疫組織學(xué)分析，優(yōu)選使用抗體或其它 任何前述方法來完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知另外的檢測YB-I在核內(nèi)和特別是檢測YB-I獨(dú) 立于細(xì)胞周期定位在那的方法。例如，當(dāng)篩選它們時(shí)在染色的組織切片中可以容易地檢測 YB-I的定位。YB-I在核內(nèi)的存在頻率已經(jīng)顯示定位獨(dú)立于細(xì)胞周期。獨(dú)立于細(xì)胞周期檢 測核內(nèi)的YB-I的另一選擇在于對YB-I染色和檢測YB-I是否定位于核內(nèi)和確定細(xì)胞的階 段。這以及YB-I的檢測也可以通過使用前述針對YB-I的方法實(shí)現(xiàn)。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的方法完成方法的檢測。通過與YB-I和不與待分析的樣品中其它任何結(jié)構(gòu)特異性結(jié) 合的所述試劑，具體地細(xì)胞，它們的定位和因?yàn)樗鼈兲禺愋越Y(jié)合YB-I和YB-I的定位也可以 通過適當(dāng)?shù)臉?biāo)記方法檢測和確定。所述方法的標(biāo)記方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。下面，通過參考附圖和實(shí)施例將進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，從中將獲得新特征，實(shí)施 方案和優(yōu)勢。圖1顯示腺病毒載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，該載體在本文中稱為AdEl/E3_負(fù)型(minus)，為 野生型 腺病毒和腺病毒dl520的E1/E3-缺失的腺病毒。圖2顯示ElA蛋白關(guān)于結(jié)合p300，pl07和pl05的結(jié)合區(qū)域。圖3顯示在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5 (稱為E1/E3-負(fù)型Ad5)和dl520感染后 在核內(nèi)不含有YB-I的U20S細(xì)胞。圖4顯示在用E1/E3-缺失的腺病毒Ad5 (稱為E1/E3-負(fù)型Ad5)和腺病毒dl520 感染后在核內(nèi)含有YB-I的257RDB細(xì)胞。圖5顯示在用腺病毒dllll9/1131感染后的257RDB細(xì)胞和U20S細(xì)胞。圖6顯示EMSA分析的結(jié)果，其證實(shí)YB-I分別存在于多藥耐藥性細(xì)胞和細(xì)胞系 257RDB, 181RDB, MCF_7Ad中，而YB-I不存在于U20S和HeLa細(xì)胞的核內(nèi)。圖7顯示野生型腺病毒，腺病毒dl520和腺病毒dill 19/1131的ElA蛋白的結(jié)構(gòu) 設(shè)計(jì)。圖8是顯示在另外表達(dá)的病毒蛋白質(zhì)的存在下腺病毒復(fù)制效率的直方圖，為絕對 數(shù)值。圖9是顯示在另外表達(dá)的病毒蛋白質(zhì)的存在下腺病毒復(fù)制效率增加的直方圖。圖10顯示在結(jié)晶紫染色和分別用10和30pfu/細(xì)胞的dl520感染后U20S細(xì)胞生 長良好，對照(K)分別未施用道諾紅菌素(daimorubicine)和施用40ng道諾紅菌素/ml。圖11顯示在結(jié)晶紫染色和分別用10和30pfu/細(xì)胞的dl520感染后HeLa細(xì)胞生 長良好，對照(K)分別未施用道諾紅菌素和施用40ng道諾紅菌素/ml。圖12是具有不同來源(RDB257和HeLa)的腫瘤的腫瘤體積的圖表，其分別為在用 PBS和dl520處理以后的時(shí)間的函數(shù)。圖13顯示殺死的小鼠的照片，在分別用PBS和5x 108pfu dl520處理后該小鼠發(fā) 展基于RDB257細(xì)胞的腫瘤。圖14是在感染dl520以后RDB257細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的(皮下生長腫瘤)細(xì)胞提 取物的DNA雜交印跡分析的結(jié)果。圖15是分別顯示YB-I核-陽性腫瘤細(xì)胞(257RDB和181RDB)和YB-I核-陰性 腫瘤細(xì)胞(HeLa，U20S)中dl520和野生型腺病毒的復(fù)制效率和顆粒形成的直方圖。圖16顯示野生型腺病毒和腺病毒載體AdXvir03的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
圖17顯示腺病毒載體AdXvir03/01的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。圖18A/B顯示在結(jié)晶紫染色和用Ad312(20pfu/細(xì)胞)，Xvir03(5pfu/細(xì)胞)感染 以后181RDB細(xì)胞(圖18A)和272RDB細(xì)胞(圖18B)生長良好和對照(未感染)，其中在感 染后5天進(jìn)行結(jié)晶紫染色。實(shí)施例1 按照本發(fā)明使用的腺病毒可以包含的ElA修飾的類型圖1顯示腺病毒載體AdEl/E3-minus，即E1/E3-缺失的腺病毒，野生型腺病毒和腺 病毒dl520的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。腺病毒AdEl/E3-minus不含有編碼功能ElA或功能ElB或E3的區(qū)域，用在本實(shí)驗(yàn) 中作為毒性對照。

野生型ElA基因編碼總共5個(gè)蛋白質(zhì)，其是通過ElA RNA的可變剪接產(chǎn)生的。其 中，產(chǎn)生2個(gè)不同的蛋白質(zhì)，即289個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)和243個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。dl520不 編碼289個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗贓lA基因的CR3序列中存在缺失，導(dǎo)致缺乏13S的基 因產(chǎn)物。按照本發(fā)明可以使用的腺病毒dl520被本領(lǐng)域那些技術(shù)人員稱為12S-E1A病毒。 現(xiàn)有技術(shù)中已知的腺病毒dl347 (Wong und Ziff，J. Virol.，68，4910-4920，1994)也是按照 本發(fā)明可以使用的12S-E1A病毒。在由13S-E1A mRNA編碼的289個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中，存在在各種腺病毒亞類之間 保守的3個(gè)區(qū)域。這些稱為CR1，CR2和CR3。盡管CRl和CR2存在兩種ElA蛋白質(zhì)(ElA 12S和ElA 13S)中，即在289個(gè)氨基酸和243個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中，CR3區(qū)域僅存在于兩個(gè) 前述蛋白中較大的一個(gè)中。病毒基因特別是E1B，E2，E3和E4的激活需要CR3區(qū)域。僅含有較小的，即243個(gè) 氨基酸的蛋白質(zhì)的病毒僅極弱地反式激活病毒基因和在核內(nèi)不含有YB-I的那些細(xì)胞中不 促進(jìn)腺病毒復(fù)制。因?yàn)閅B-I僅存在于腫瘤細(xì)胞的核內(nèi)和僅可以在那檢測到，該載體適合誘 導(dǎo)腫瘤特異性的復(fù)制。由于dl520中CR3的缺失，該腺病毒不能將細(xì)胞YB-I轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的核內(nèi)，其在本 文中也稱為轉(zhuǎn)運(yùn)，因此不能夠在YB-I核-陰性的細(xì)胞中復(fù)制的位置，因此是可以按照本發(fā) 明使用的病毒，其中該病毒包含按照本發(fā)明所需的反式激活。實(shí)施例2 腺病毒的作用方式依賴于細(xì)胞的Rb狀態(tài)圖2顯示ElA蛋白關(guān)于結(jié)合p300，pl07和pl05的結(jié)合區(qū)域。P300以及pl07，是 細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb)，一種腫瘤抑制蛋白質(zhì)，其結(jié)合是通過CRl和 CR2介導(dǎo)的。研究已經(jīng)表明pRb和pl07/p300結(jié)合在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄中有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F。 野生型ElA蛋白干擾E2F與Rb的結(jié)合。如此釋放的E2F結(jié)合E2早期啟動(dòng)子和其中誘導(dǎo) 腺病毒復(fù)制。從現(xiàn)有技術(shù)中已知ElA癌蛋白質(zhì)中的某些缺失可能導(dǎo)致重組腺病毒載體如下面 提及的那些，其能夠主要在Rb-陰性細(xì)胞中復(fù)制和可以按照本發(fā)明使用。例如，腺病毒載體 dl922-947包含CR2區(qū)域中(氨基酸位點(diǎn)122-129)的缺失，載體CB016在CRl區(qū)域(氨基 酸位點(diǎn)27-80)和CR2區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)122-129)中具有缺失。載體ElAdl01/07在CR2 區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)111-123)中含有缺失。另外，因?yàn)樵贜-末端(氨基酸位點(diǎn)4-25)處另 外的缺失，另外，不與蛋白質(zhì)P300結(jié)合。腺病毒載體Ad Δ 24在CR2區(qū)域中(氨基酸位點(diǎn) 120-127)含有缺失。在專利EP 0 931 830中描述的腺病毒載體在CRl區(qū)域和CR2區(qū)域含有缺失。E2F/RB的結(jié)合機(jī)制和ElA介導(dǎo)的E2F的釋放機(jī)制根本不同于構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的機(jī) 制。不同于現(xiàn)有技術(shù)中假設(shè)的，它不是E2F從Rb蛋白中的釋放，Rb蛋白即使不說對于病毒 復(fù)制是關(guān)鍵性的也是必要的，然而它是人轉(zhuǎn)錄因子YB-I的核定位。該轉(zhuǎn)錄因子在正常細(xì)胞 中在大多數(shù)細(xì)胞周期中僅存在于細(xì)胞質(zhì)中。在用腺病毒感染以后，在某些情形下它被誘導(dǎo) 入核內(nèi)或者在不同的細(xì)胞系統(tǒng)中已經(jīng)存在核內(nèi)，如不同的腫瘤疾病，其包括例如但不限于 乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，骨肉瘤癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，黑素瘤，小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌。實(shí)施例3 :U20S細(xì)胞的感染 每孔平鋪100，000個(gè)U20S細(xì)胞。次日用如圖3所示的不同腺病毒感染細(xì)胞。在 500 μ 1無血清的DMEM培養(yǎng)基中在37°C下1小時(shí)來進(jìn)行感染。隨后，去除感染培養(yǎng)基并用 2ml完全培養(yǎng)基(10% FCS/DMEM)替換。在3天后使用結(jié)晶紫染色進(jìn)行分析。如從圖3中可以獲得，在核內(nèi)不含有YB-I的U20S細(xì)胞在用兩種不同腺病毒感染 以后未顯示裂解，如結(jié)晶紫染色所示，所述腺病毒即稱為El/E3-minUS的E1/E3-缺失的腺 病毒，和腺病毒dl520，其可以按照本發(fā)明使用。與其相關(guān)，首先去除培養(yǎng)基。隨后，用結(jié)晶 紫(50(^^110!1，3%甲醛，5%乙酸，1%結(jié)晶紫)覆蓋細(xì)胞和在室溫下溫育5-lOmin。隨后，用 水充分漂洗具有6個(gè)孔的平板，室溫干燥。這證實(shí)構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，即需要YB-I的存在以便誘導(dǎo)按照本發(fā)明使用的 病毒來裂解感染的細(xì)胞。實(shí)施例4 :257RDB細(xì)胞的感染每孔平鋪100，000個(gè)2571^ 細(xì)胞。次日用如圖4所示的不同腺病毒感染細(xì)胞。在 500 μ 1無血清的DMEM培養(yǎng)基中在37°C下1小時(shí)來進(jìn)行感染。隨后，去除感染培養(yǎng)基并用 2ml完全培養(yǎng)基(10% FCS/DMEM)替換。在3天后使用結(jié)晶紫染色進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖4中描述。經(jīng)感染核內(nèi)含有YB-I的257RDB細(xì)胞以后，稱為El/ E3-minus Ad5的、E1/E3-缺失的腺病毒在低MOI (pfu/細(xì)胞)下未顯示任何裂解。與此對 比，如實(shí)施例3所示的dl520，在YB-I核-陰性細(xì)胞中不復(fù)制和同時(shí)編碼按照本發(fā)明用于反 式激活癌基因蛋白質(zhì)的E1A，在40pfu/細(xì)胞的MOI (感染復(fù)數(shù))下導(dǎo)致實(shí)際上完全的裂解， 和在IOpfu/細(xì)胞的MOI下仍導(dǎo)致主要裂解。可以從中得出結(jié)論，dl520和類似的病毒如本 文中通過dill 19/1131或AdXvir 03所述，需要與El-缺失或E1/E3-缺失的腺病毒相比減 小約1個(gè)數(shù)量級(十倍)的Μ0Ι，這證明了它們的臨床應(yīng)用。如圖7所示，dl520的蛋白質(zhì)ElA其特征在于其CR3區(qū)域缺失，導(dǎo)致按照本發(fā)明應(yīng) 用所需的反式激活和YB-I核-陽性細(xì)胞中的復(fù)制。實(shí)施例5 用 dill 19/1131 感染 257RDB 和 U20S 細(xì)胞如圖5所示，在用腺病毒dl 1119/1131感染YB-I核-陰性U20S細(xì)胞以后在20pfu/ 細(xì)胞的MOI下沒有裂解，腺病毒dill 19/1131顯示缺失ElA蛋白的氨基酸4-138和編碼其 的核酸，和在氨基酸218后另外包含終止密碼子，其中表達(dá)的截短ElA蛋白包含完整ElA蛋 白的CR3區(qū)域。作為陰性對照使用未感染的細(xì)胞層。與其相反，在細(xì)胞系統(tǒng)如核內(nèi)含有YB-I，即YB-I核-陽性的257RDB中，在腺病毒 dill 19/1131的影響下，在20pfu/細(xì)胞的MOI下實(shí)際上細(xì)胞層完全裂解。因此該實(shí)施例是 另一證據(jù)，其證明如圖7所示的修飾的ElA癌基因蛋白質(zhì)僅包含例如CR3區(qū)域和缺少CRl區(qū)域和CR2區(qū)域，在YB-I核-陽性細(xì)胞中提供所需的反式激活，這按照本發(fā)明是腺病毒復(fù) 制所需，導(dǎo)致病毒復(fù)制。腺病毒dllll9/1131因此是按照本發(fā)明可以使用的另一種腺病毒。 屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，也可以使用關(guān)于CR3區(qū)域類似于dllll9/1131設(shè)計(jì)但與其相反具 有CRl區(qū)域和/或CR2區(qū)域的病毒。實(shí)施例6 檢測多藥耐藥性細(xì)胞中的核YB-I本實(shí)施例是基于以下考慮，即核YB-I應(yīng)當(dāng)作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合mdrl啟動(dòng)子(engl. multiple drug resistance promoter)內(nèi)的Y-盒(CAAT序列)。為了檢測這個(gè)，進(jìn)行所謂 的EMSA分析(電泳遷移率變動(dòng)分析)。與其相關(guān)，分離核蛋白質(zhì)，隨后將1-10 μ g蛋白質(zhì)與 短DNA片段(寡)一起在37°C下溫育。為了測定核YB-1，使用下列寡核苷酸與U203相對 的 mdrl 啟動(dòng)子(位點(diǎn)-86 至-67) :TGAGGCTGATTGGCTGGGCA (X-盒加下劃線)。在這之前將該DNA片段在5’末端用32P放射性標(biāo)記。隨后，在天然聚丙烯酰胺凝膠 中進(jìn)行分離。在蛋白質(zhì)YB-I結(jié)合寡核苷酸序列的情形中，可以檢測它，因?yàn)槿魏挝唇Y(jié)合的 寡核苷酸在凝膠中遷移比結(jié)合的寡核苷酸快(Holm，P. S.等，JBC 277，10427-10434，2002 ； Bargou, R. C. φ, NatureMedicine 3，447—450，1997)。 如圖6所示，用EMSA分析可以顯示，與細(xì)胞系U20S和HeLa細(xì)胞形成對比，YB-I存 在多藥耐藥性細(xì)胞257RDB，18IRDB和MCF_7Ad細(xì)胞的核中。實(shí)施例4和5的結(jié)果證實(shí)，與U205形成對比，腺病毒dl520和dl 1119/1131在YB-I 核_陽性細(xì)胞如例如257RDB中復(fù)制，并誘導(dǎo)其裂解。這證實(shí)關(guān)于按照本發(fā)明的腺病毒的應(yīng) 用的發(fā)現(xiàn)。另外，結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，與野生型腺病毒相比，在YB-I核-陽性細(xì)胞中通過修飾或 缺失的ElA基因產(chǎn)物來弱反式激活病毒基因，在核內(nèi)YB-I存在下導(dǎo)致成功的復(fù)制和這些細(xì) 胞的裂解，這些細(xì)胞包括例如多藥耐藥性細(xì)胞，本文所述的腺病毒可以因此用于裂解這些 腫瘤。實(shí)施例7 提高El-minus腺病毒的復(fù)制效率本實(shí)施例顯示早期病毒基因E1B-55K和E4orf6可以通過用質(zhì)粒pE4orf6轉(zhuǎn)染和 E1/E3-缺失的腺病毒Ad-55K感染來替代。Ad_55K是E1/E3缺失病毒，其中將E1B-55K克隆 到El中并在CMV的控制下。根據(jù)以下事實(shí)該替代是需要的，即AdYB-I (表達(dá)YB-I的腺病 毒)不表達(dá)這些早期基因，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到核內(nèi)含有YB-I的復(fù)制系統(tǒng)中這些早期基因 的替代能夠分別提高復(fù)制效率和顆粒形成效率，其程度比得上類型Ad5的野生型腺病毒。進(jìn)行以下各項(xiàng)使用脂轉(zhuǎn)染胺用質(zhì)粒pE4orf6轉(zhuǎn)染各個(gè)105U20S細(xì)胞。質(zhì)粒pE4orf6攜帶在CMV 控制下的編碼早期病毒基因E4orf6的DNA序列。用質(zhì)粒pE4orf6轉(zhuǎn)染24h后，用表達(dá)YB-I的E1/E3-缺失腺病毒AdYB-I (50pfu/ 細(xì)胞)和E1/E3-缺失的E1B-55K腺病毒Ad_55K (50pfu/細(xì)胞)感染細(xì)胞。Ad_55K是El/ E3-缺失的病毒，其攜帶在CMV控制下的作為轉(zhuǎn)基因的病毒基因E1B-55K。隨后，在感染5天后(=感染后)從培養(yǎng)基(2ml)中去除細(xì)胞。通過交替冷凍和解 凍3次(融/凍)完成從分離的細(xì)胞中釋放病毒顆粒。隨后，對293個(gè)細(xì)胞進(jìn)行噬菌斑測 定，以測定產(chǎn)生的感染性顆粒(蝕斑形成單位/ml (pfu/ml))。結(jié)果在圖8和9中表示。圖 8顯示噬菌斑測定的結(jié)果，以絕對數(shù)值表示。通過用質(zhì)粒pE4orf6轉(zhuǎn)染和用兩種病毒AdYB-I 和Ad-55K共感染來顯示與僅用AdYB-I感染相比的最顯著的差別。圖9顯示圖8的結(jié)果，其中復(fù)制效率的提高表示為對AdYB-I測定的復(fù)制倍數(shù)。用質(zhì)粒pE4orf6和隨后用AdYB-I 和ElB-55K(Ad-55K)感染的細(xì)胞產(chǎn)生高達(dá)25倍多的pfu/ml?；谶@些結(jié)果可以得出結(jié)論，E1B-55K和E4orf6的替代提高用E1/E3-缺失的腺 病毒AdYB-I感染后形成的病毒數(shù)量(pfu/ml)達(dá)25倍。與兩種基因產(chǎn)物各自的效果相比， E1B-55K和E4orf6對蝕斑形成單位(pfu)產(chǎn)量的相加作用顯著更高。使用表達(dá)EGFP的一個(gè)質(zhì)粒的對照實(shí)驗(yàn)清楚地顯示，在所選實(shí)驗(yàn)方法中僅10%的 細(xì)胞成功地被質(zhì)粒pE4orf6轉(zhuǎn)染。表達(dá)E1B-55K和E4orf6的細(xì)胞中形成的顆粒數(shù)量比得上 一種類型5的人腺病毒(野生型)。這證實(shí)了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，即E4orf6和E1B-55K 的表達(dá)結(jié)合YB-I的核定位，能夠提供腺病毒復(fù)制和顆粒形成，特別是ElA-缺失的腺病毒， 其比得上一種野生型Ad5。

實(shí)施例8 在YB-I核-陽性細(xì)胞中經(jīng)施用細(xì)胞生長抑制劑后提高的腺病毒復(fù)制， 該腺病毒在YB-I核陰性細(xì)胞中不復(fù)制現(xiàn)有技術(shù)中已知加入不同細(xì)胞生長抑制劑誘導(dǎo)人轉(zhuǎn)錄因子YB-I的核定位。如本 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，定位在核內(nèi)的YB-I通過激活腺病毒E2-晚期啟動(dòng)子來控制腺病毒復(fù)制。 兩種作用的結(jié)合可以用于提供特異性的腫瘤裂解。在腫瘤消解測定的實(shí)施中，依照下列步驟將200，000個(gè)細(xì)胞(分別為HeLa和 U20S)平板接種到6孔板的每孔中。次日，加入40ng/ml (終濃度)的道諾紅菌素。在3小 時(shí)溫育后，分別用10和30pfu dl520/細(xì)胞感染細(xì)胞。隨后，將細(xì)胞在無細(xì)胞生長抑制劑的 培養(yǎng)基中溫育。在3-5天后使用結(jié)晶紫將細(xì)胞染色。如從圖10和11中可以獲得，加入道諾紅菌素通過YB-I的核定位誘導(dǎo)dl520的復(fù) 制。因此，與僅道諾紅菌素相比，dl520與細(xì)胞生長抑制劑道諾紅菌素結(jié)合產(chǎn)生更大的腫瘤 裂解效果。實(shí)施例9 :dl520的體內(nèi)腫瘤裂解在無菌細(xì)胞培養(yǎng)條件下擴(kuò)展用于本體內(nèi)研究的HeLa (YB-1核-陰性)和 257RDB(YB-1核陽性)細(xì)胞。在將細(xì)胞注射到小鼠(⑶INuNu品系)中之前以便產(chǎn)生皮下 腫瘤，通過胰蛋白酶化收集細(xì)胞，放入DMEM培養(yǎng)基(10% FCS)中，計(jì)數(shù)并用PBS洗滌一次。 隨后，將細(xì)胞離心，吸出PBS，以期望細(xì)胞數(shù)將細(xì)胞在新鮮PBS中分份。在本研究中皮下注射 的細(xì)胞數(shù)是兩個(gè)細(xì)胞系每個(gè)5x IO6個(gè)細(xì)胞。進(jìn)行皮下注射至動(dòng)物的一側(cè)，其中將HeLa細(xì) 胞注射到右側(cè)和將257RDB細(xì)胞注射到左側(cè)以更好的區(qū)分。1周2次控制腫瘤的生長，其中 使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長度和寬度?；诖?，基于下列數(shù)學(xué)公式計(jì)算腫瘤體積3/4 Ji *a/2* (b/2) 2a =長度，b =寬度一旦腫瘤已經(jīng)達(dá)到200-520mm3的體積，分別在腫瘤內(nèi)施用病毒和作為陰性對照的 PBS。注射的體積相等和為每次50 μ 1。連續(xù)3天重復(fù)注射。施用病毒的總劑量為5x 108pfu。 隨后，繼續(xù)1周2次記錄腫瘤生長，計(jì)算體積。在研究結(jié)束時(shí)殺死小鼠，去除腫瘤以進(jìn)一步 分析。結(jié)果在圖12和13中表示。圖12顯示表示作為時(shí)間函數(shù)的腫瘤體積和不同治療方案的圖表。在通過RDB257 形成腫瘤的情形中，在注射PBS以后腫瘤顯著生長約438mm3-1466mm3。在按照本發(fā)明使用 的載體dl520的影響下，腫瘤生長可以顯著減小。從344mm3的平均腫瘤大小開始，腫瘤大小僅增加21%至總共543mm3。在本實(shí)施例中，將由HeLa細(xì)胞組成的腫瘤用作對照，其在施用PBS以后的行為類 似于在施用PBS以后的基于RDB257的腫瘤。然而，基于HeLa細(xì)胞和用dl520處理的腫瘤 仍顯示腫瘤生長顯著增加，從311mm3開始增加至1954mm3。圖13顯示殺死的使用RDB257長有腫瘤的裸鼠照片。可以清楚的看見，在按照本發(fā) 明施用腺病毒dl520以后，出現(xiàn)腫瘤顯著減少。在本情形中甚至還有腫瘤體積的減小(施 用病毒dl520后第1天515mm3 ；在施用病毒dl520后第30天350mm3)。 實(shí)施例10 腫瘤DNA的DNA印跡雜交從腫瘤樣品中提取DNA，該腫瘤樣品取自實(shí)施例9中發(fā)展的腫瘤中間。為了分離使 用Qiagen 的Dneasy Tissue Kit。按照制造商的使用說明完成DNA分離。按照其，通過堿 裂解從細(xì)胞中釋放DNA。隨后，用柱純化分離的DNA。隨后，通過光度測定法在260nm測定 分離的DNA的濃度。使用2 μ g DNA樣品進(jìn)行分析，該DNA樣品用10個(gè)單位的限制酶KpnI 消化。隨后，在0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行樣品的電泳分離。隨后，將DNA印跡在尼龍膜上 (按照Schleicher & Schuell系統(tǒng)進(jìn)行)。將印跡在膜上的DNA對特異的1501bp DNA探 針雜交。1501bp DNA探針特異性地結(jié)合編碼E2A的Ad5序列內(nèi)的3369bp Kpn I片段。通 過 PCR (引物5 ‘-GTCGGA GAT CAGATC CGC GT, 5 ‘-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT)制備 探針并使用32P放射性標(biāo)記。隨后，洗滌膜并曝光膠片。腫瘤DNA的DNA印跡結(jié)果在圖14中表示。分析證實(shí)僅dl520在抗性細(xì)胞RDB257 中體外復(fù)制，如泳道3，4和5所示。泳道1表示陽性對照Ad-5d，泳道6，7和8表示來自感 染dl520的HeLa細(xì)胞的DNA。因?yàn)镠eLa細(xì)胞不是YB-I核陽性，病毒dl520不復(fù)制，因此按 照這個(gè)不可以檢測E2A序列。使用dl520的另外的結(jié)果在圖15中表示?；谑删邷y定，在用dl520和野生型 腺病毒感染以后研究顆粒形成(pfu/ml)。用dl520和野生型腺病毒感染各種YB-I核-陽 性(257RDB和181RDB)腫瘤細(xì)胞和YB-I核-陰性腫瘤細(xì)胞。實(shí)施下列步驟將100，000-200, 000個(gè)細(xì)胞各自平板接種在所謂的具有6個(gè)孔的平板(即6孔平 板)上含有10% FCS的L 15培養(yǎng)基(抗性細(xì)胞)和DMEM(非抗性細(xì)胞)中。在24小時(shí)后 進(jìn)行用dl520和野生型腺病毒感染(IOpfu/細(xì)胞)。感染后(感染之后)3天，通過交替冷 凍和解凍3次從細(xì)胞懸浮液(3ml)中釋放病毒顆粒。隨后，對293個(gè)細(xì)胞進(jìn)行噬菌斑測定 以測定形成的感染性顆粒(蝕斑形成單位/ml (pfu/ml))。結(jié)果在圖15中顯示。噬菌斑測 定的結(jié)果顯示，類似于野生型腺病毒，dl520在YB-I核-陽性細(xì)胞(257RDB和181RDB)中 復(fù)制。因此，當(dāng)按照本發(fā)明使用本文所述的腺病毒時(shí)，可以觀察到類似于一種野生型腺病毒 的復(fù)制效率。實(shí)施例11 腺病毒載體Xvir03的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖16顯示腺病毒載體Xvir03的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。腺病毒Xvir03是一種所謂的El/ E3-缺失腺病毒。這意味著不制備在腺病毒復(fù)制中起作用的E1A，ElB和E3蛋白。El區(qū)域 的缺失從342擴(kuò)展至3528 ；氨基酸位點(diǎn)27865-30995的E3區(qū)域缺失。如本文所示，術(shù)語 “E1-缺失的病毒”是指El不再有功能活性的病毒。這可以通過失活另外大部分完整的核 酸和氨基酸序列而實(shí)現(xiàn)，然而這也可以意指具有不同大小的編碼El區(qū)域蛋白質(zhì)的缺失。因?yàn)槿狈lA和ElB蛋白和編碼其的核酸，E4區(qū)域，如E4orf6僅微弱表達(dá)(與野生型腺病毒 相比約1-5% )或根本不表達(dá)。病毒基因ElB55k和E4orf6通過引入Xvir03的異源CMV 啟動(dòng)子(Clontech :Plasmid pShuttle)在El區(qū)域中表達(dá)。代替CMV啟動(dòng)子，可以使用與 ElA表達(dá)相關(guān)的本文公開的各種和任何啟動(dòng)子。兩個(gè)基因的可讀框通過所謂的IRES序列 (engl. internalribosomal entry site) (Pelletier, J.禾口 Sonenberg, N. Nature,1988, 334,320-325)彼此連接。該元件(Novagen :pCITE)提供來自1個(gè)mRNA的2個(gè)蛋白質(zhì)的表 達(dá)。 如下制備載體通過將來自M. Dobelstein (University of Marburg)的 ρCGNE IB 的 ElB55k 可讀 框用XbaI和BfrI克隆到Clontech的pShuttle載體中來產(chǎn)生質(zhì)粒ElB55k_pShuttle。隨 后，用ApaI將pShuttle中的ElB55k線性化，末端補(bǔ)平并用NheI切割。在第二個(gè)載體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)中，彼此連續(xù)，使用Novagen公司的 pCITE-4a(+)作為模板通過TA克隆將IRES元件作為PCR產(chǎn)物克隆到EcoRV切割位點(diǎn)，借助 BamHI pCMV-E4orf6 (Μ. DobeIstein, University of Marburg) ^ E4orf6 = IRES-E4orf6-pcDNA3. 1 (+)。用 NotI 線性化 pcDNA3. 1 (+)中的 IRES_E4orf6，末端補(bǔ)平，隨 后用NheI切掉片段IRES-E4orf6。用斷開的載體ElB55k_pShuttle (平端，NheI)連接片段 IRES-E4orf6。隨后用 I-Ceu I 和 PI-SceI 從 ElB55k-IRES_E4orf6-pShuttle 和 CMV 啟動(dòng) 子以及牛生長激素(BGH)-PolyA中將盒克隆到ΔΕ1，ΔE3Aden0-X-質(zhì)粒(Clontech)中，其 稱為AdcmvE lB/IRES/E4orf6。隨后，按照制造商的使用說明(Clontech)制備腺病毒。將 用PacI線性化的含有表達(dá)元件CMV-ElB55k-IRES-E4orf6-BGH polyA的adeno質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后11天與培養(yǎng)基一起去除脫離的細(xì)胞以便通過反復(fù)凍融循環(huán)釋放腺 病毒。上述載體原則上適合本文所述按照本發(fā)明使用的其它病毒。特別是上述載體適合 在細(xì)胞中復(fù)制和引發(fā)裂解，所述細(xì)胞分別為YB-I核-陽性細(xì)胞以及其中YB-I被解除管制 (即與正常細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞相比過量表達(dá))的細(xì)胞。該載體的使用特別適用于那些疾病 和患者組和患者集體，其與在本文中描述按照本發(fā)明使用的其它腺病毒和本發(fā)明公開的其 它腺病毒結(jié)合一起公開。實(shí)施例12 腺病毒載體Xvir03/01的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如從圖17中可以獲得，Xvir03/01是Xvir03進(jìn)一步的發(fā)展。治療基因如例如本文 所述的基因和轉(zhuǎn)基因可以克隆到E3區(qū)域。另外，將缺失引入E4區(qū)域以便避免與來自Xvir03 表達(dá)盒的E4orf6同源重組。這允許較大的轉(zhuǎn)基因可以克隆到該構(gòu)建體中。缺失的E3區(qū)域 包含用于引入盒的SacI，NdeI和NheI限制位點(diǎn)，其中例如可以克隆治療的轉(zhuǎn)基因。將治療基因克隆到E3區(qū)域中以及在E4區(qū)域中進(jìn)行缺失的質(zhì)粒的制備Clontech的pAdenoX-Plasmid在野生型腺病毒中缺乏的3，ITR區(qū)之后具有針對 SfuI 的限制位點(diǎn)。使用 SpeI (位點(diǎn) 23644)和 SfuI /ApAdenoX(Clontech)中獲得 E3-E4 區(qū) 域，并轉(zhuǎn)移至pcDNA3. 1(+) (Invitrogen) = pcDNA3. 1-E3 Δ 27865-30995-E4。通過PstI 去除 E40RF6 的大部分，即 33241-33875 = pcDNA3. 1-E3 Δ 27865-30995，E4 Δ 33241-33875。為了 進(jìn)一步發(fā)展 Xvir03，用 SfuI 和 SpeI 從 pcDNA3. 1-E3 Δ 27865-30995，Ε4 Δ 33241-33875 中將 缺失的 Ε3/Ε4 區(qū)域克隆到質(zhì)粒 pAdenoX 中=pAdenoXE3 Δ 27865-30995，E4 Δ 33241-33875。
如關(guān)于Xvir03所述，隨后用I-Ceu I禾口 ΡΙ—SceI從 ElB55k-IRES-E4orf6-pShuttle中將表達(dá)盒連同CMV啟動(dòng)子和牛生長激素(BGH)-PolyA 克隆到 pAdenoX E3Δ 27865-30995，E4Δ 33241-33875 中，其稱為 AdcmvElB/IRES/ E4orf6-AE4。隨后，按照制造商的使用說明(Clontech)制備腺病毒。上述載體原則上適合本文所述按照本發(fā)明使用的其它病毒。特別是上述載體適合 在細(xì)胞中復(fù)制和導(dǎo)致裂解，所述細(xì)胞為YB-I核-陽性細(xì)胞以及其中YB-I被解除管制(即 與正常細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞相比過量表達(dá))的細(xì)胞。該載體可以用于那些疾病和患者組和患 者集體，其關(guān)于按照本發(fā)明使用的其它腺病毒和按照本發(fā)明的腺病毒在本文中公開。實(shí)施例13 :257RDB和181RDB細(xì)胞中Xvir 03的腫瘤消解作用在具有6個(gè)孔的平板(6孔平板)的每孔中平板接種100，000個(gè)細(xì)胞(257RDB和 181R DB)。次日，如圖18所示，用Ad312(20pfu/細(xì)胞)和Xvir03(5pfu/細(xì)胞)感染細(xì)胞。 在500 μ 1無血清DMEM培養(yǎng)基中在37°C下1小時(shí)進(jìn)行感染。隨后，去除感染培養(yǎng)基并用2ml 完全培養(yǎng)基(10% FCS/DMEM)替代。通過5天后結(jié)晶紫染色完成分析。結(jié)果在圖18A和18B 中表示。如可以從圖18A和18B中獲得，在感染Ad312和Xvir03以后僅在Xvir03的情形 中在核內(nèi)含有YB-I的多藥耐藥性細(xì)胞顯示裂解，如細(xì)胞的結(jié)晶紫染色所示。與其相關(guān)，首 先去除培養(yǎng)基。隨后，用結(jié)晶紫(50% ΕΤ0Η，3%甲醛，5%乙酸，結(jié)晶紫)覆蓋細(xì)胞，在室 溫下溫育5-10分鐘。隨后，用水充分漂洗6孔平板并在室溫下干燥。本發(fā)明人已知ElA-缺失的病毒(例如Ad312)，然而其在本發(fā)明的意義上不是反式 激活腺病毒，可能在高M(jìn)OI下非常有效地復(fù)制(Nevins J. R.，Cell 26，213-220，1981)，但 是不能在臨床應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)。該現(xiàn)象在文獻(xiàn)中稱為“類ElA活性”。本文所用的腺病毒Ad312 是ElA-缺失的病毒。在所用效價(jià)(20pfu/細(xì)胞)下，該效價(jià)仍高于臨床理想效價(jià)，早期腺 病毒基因如ElB55k和E4orf6不表達(dá)或僅極少量地表達(dá)(Nevins J. R. ,Cell 26,213-220, 1981)。如本文已經(jīng)描述，這些基因和蛋白質(zhì)在病毒復(fù)制中起重要作用。與其對比，這些基 因和蛋白質(zhì)分別由腺病毒Xvir03表達(dá)(圖16)。如從圖18A和18B中可以獲得，在伴隨所 需的較低的感染效價(jià)下(表達(dá)為Pfu/細(xì)胞)基因ElB55k和E4orf6的表達(dá)將導(dǎo)致有效的 病毒復(fù)制和細(xì)胞裂解。這證實(shí)了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，即E4orf6和E1B-55K(缺少ElA) 的表達(dá)結(jié)合YB-I的核定位能夠誘導(dǎo)非常有效的腺病毒復(fù)制。其所需僅l_5pfu/細(xì)胞的效 價(jià)現(xiàn)在允許臨床應(yīng)用。這證實(shí)了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)，即為了使按照本發(fā)明使用的病毒裂解感染的細(xì) 胞，YB-I在核內(nèi)的存在，特別是獨(dú)立于細(xì)胞周期的存在，是必需的。前述說明書公開的本發(fā)明的特征，權(quán)利要求以及附圖可以單獨(dú)以及任意組合，對 于本發(fā)明其各種實(shí)施方案的實(shí)現(xiàn)是重要的。
權(quán)利要求
腺病毒在制備藥物中的應(yīng)用，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少YB-1的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-1的細(xì)胞中復(fù)制，并且所述腺病毒被設(shè)計(jì)以便由細(xì)胞的YB-1通過激活E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制。
2.腺病毒在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制的應(yīng)用，其特征在于所述腺病毒在核內(nèi)缺少 YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，并且所述腺病毒被設(shè)計(jì) 以便由細(xì)胞的YB-I通過激活E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制。
3.按照權(quán)利要求1-2中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于由YB-I主要通過激活E2-晚期啟 動(dòng)子來控制復(fù)制。
4.病毒癌基因蛋白質(zhì)在制備腺病毒中的應(yīng)用，其中所述病毒癌基因蛋白質(zhì)是ElA和與 野生型癌基因蛋白質(zhì)相比，所述病毒癌基因蛋白質(zhì)ElA包含一個(gè)或數(shù)個(gè)突變，其中所述腺 病毒在核內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中 所述病毒編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，其中所述病毒基因選自包含 ElB55kDa, E4orf6, E4orf3，和 E3ADP 的組。
5.按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白質(zhì)能夠結(jié)合Rb。
6.按照權(quán)利要求4或5的應(yīng)用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白質(zhì)包含一個(gè)或數(shù)個(gè)突 變或缺失。
7.按照權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述缺失是ElA癌基因蛋白質(zhì)的CRl 區(qū)域和/或CR2區(qū)域中的缺失。
8.按照權(quán)利要求4或7的應(yīng)用，其特征在于所述病毒癌基因蛋白質(zhì)不能夠結(jié)合Rb。
9.病毒復(fù)制系統(tǒng)在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述復(fù)制系統(tǒng)包含編碼 腺病毒的核酸，并且包含輔助病毒的核酸，其中該輔助病毒的核酸包含編碼YB-I的核酸序 列，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞 中復(fù)制，其中所述病毒編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，其中所述病毒基 因選自包含 ElB55kDa，E4orf6, E4orf3，和 E3ADP 的組。
10.按照權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于所述復(fù)制系統(tǒng)是腺病毒復(fù)制系統(tǒng)。
11.按照權(quán)利要求9-10中任何一項(xiàng)的病毒復(fù)制系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于所述病毒核酸 和/或輔助病毒的核酸作為可復(fù)制的載體存在。
12.編碼腺病毒的核酸在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少 YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中所述病毒編碼癌基 因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，其中所述病毒基因選自包含ElB55kDa，E4orf6, E4orf3，和 E3ADP 的組。
13.按照權(quán)利要求12的應(yīng)用，其特征在于所述形成腫瘤或其部分的細(xì)胞具有針對藥物 活性劑的抗性。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其特征在于所述抗性是多藥耐藥性。
15.權(quán)利要求13或14的應(yīng)用，其特征在于所述藥物活性劑是抗腫瘤劑。
16.按照權(quán)利要求15的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤劑是細(xì)胞生長抑制劑。
17.編碼腺病毒的核酸在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制的應(yīng)用，其特征在于所述病毒在 核內(nèi)不含YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，病毒編碼癌基因或癌基因產(chǎn)物，其反式激活至少 一個(gè)病毒基因，其中該基因選自包含ElB55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的組，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中 所述病毒編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，其中所述病毒基因選自包含 ElB55kDa, E4orf6, E4orf3，和 E3ADP 的組。
18.編碼腺病毒的核酸在制備藥物中的應(yīng)用，其中設(shè)計(jì)所述病毒以便由YB-I通過激活 E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的， 但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中所述病毒編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè) 病毒基因，其中所述病毒基因選自包含ElB55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的組。
19.編碼腺病毒的核酸在細(xì)胞中復(fù)制的應(yīng)用，其中設(shè)計(jì)所述病毒以便由YB-I通過激活 E2-晚期啟動(dòng)子來控制復(fù)制，其中所述腺病毒在核內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的， 但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中所述病毒編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè) 病毒基因，其中所述病毒基因選自包含ElB55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的組。
20.按照權(quán)利要求18或19的應(yīng)用，其特征在于由YB-I主要通過激活E2-晚期啟動(dòng)子 來控制復(fù)制。
21.按照權(quán)利要求17-20中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所述病毒是腺病毒和/或所述 病毒基因是腺病毒基因。
22.載體在制備藥物或在核內(nèi)含有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制的應(yīng)用，所述載體包含如權(quán)利要 求9-21中任何一項(xiàng)所定義的核酸。
23.與YB-I相互作用的化合物在制備用于表征細(xì)胞、腫瘤組織或患者的細(xì)胞的診斷 劑中的應(yīng)用，該表征是為了確定這些是否應(yīng)當(dāng)與腺病毒接觸和/或用其治療，其中所述化 合物選自包含抗體，抗促成素，適體，aptazyme和spiegelmer的組，其中所述腺病毒在核 內(nèi)缺少YB-I的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，但在核內(nèi)具有YB-I的細(xì)胞中復(fù)制，其中所述病毒 編碼癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，其中所述病毒基因選自包含ElB55kDa， E4orf6, E4orf3，和 E3ADP 的組。
24.按照權(quán)利要求4-8中任何一項(xiàng)的病毒癌基因蛋白質(zhì)或編碼其的核酸在制備病毒中 的應(yīng)用，其可以結(jié)合如權(quán)利要求1-23中任何一項(xiàng)所說明的應(yīng)用來使用。
25.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的病毒的應(yīng)用，其中所述病毒包含編碼轉(zhuǎn)基因的核酸。
26.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的病毒的應(yīng)用，其中所述病毒包含轉(zhuǎn)基因的翻譯和/ 或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
27.按照權(quán)利要求9-11的腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的應(yīng)用，其中所述腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的核酸和 /或所述輔助病毒的核酸包含轉(zhuǎn)基因或編碼轉(zhuǎn)基因的核酸。
28.按照權(quán)利要求12-21中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述核酸包含轉(zhuǎn)基因或編碼轉(zhuǎn)基因 的核酸。
29.按照權(quán)利要求25-28中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述轉(zhuǎn)基因選自包含前藥基因，細(xì)胞 因子，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的基因，腫瘤抑制基因，金屬蛋白酶抑制劑的基因和血管生成抑制劑的 基因的組。
30.按照權(quán)利要求25-28中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述轉(zhuǎn)基因選自包含關(guān)于siRNA、適 體、反義分子和核酶的核酸的組，其中siRNA、適體、反義分子和/或核酶是靶向靶分子。
31.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中所述靶分子選自包含抗性相關(guān)因子，抗細(xì)胞調(diào)亡因子，癌基因，血管生成因子，DNA合成酶，DNA修復(fù)酶，生長因子，生長因子受體，轉(zhuǎn)錄因子，金屬蛋 白酶，優(yōu)選基質(zhì)金屬蛋白激酶，和尿激酶類型的纖溶酶原激活物的組。
32.按照權(quán)利要求1-3和25-31中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物另外包含藥物活性化 合物。
33.按照權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中所述藥物活性化合物選自包含細(xì)胞因子，金屬蛋白 酶抑制劑，血管生成抑制劑，細(xì)胞生長抑制劑和細(xì)胞周期抑制劑的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒、優(yōu)選腺病毒在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用。所述病毒在核內(nèi)不含有YB-1的細(xì)胞中是復(fù)制缺陷型的，并且編碼癌基因或癌基因產(chǎn)物，特別是癌基因蛋白質(zhì)，其反式激活至少一個(gè)病毒基因，優(yōu)選腺病毒基因，所述基因選自包含E1B55kDa，E4orf6，E4orf3，和E3ADP的組。
文檔編號C12N15/34GK101843641SQ201010161559
公開日2010年9月29日 申請日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月27日
發(fā)明者佩爾·松內(nèi)·霍爾姆 申請人:佩爾·松內(nèi)·霍爾姆