耐受重金屬的好氧反硝化菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】的耐受重金屬的好氧反硝化菌株及其應(yīng)用，該菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)SNR‐3，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC?NO.7126，本發(fā)明能夠耐受Cd2+、Cu2+等重金屬，并能在上述重金屬存在的條件下進(jìn)行好氧反硝化作用，有效去除水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，并吸附相應(yīng)的重金屬。該菌株培養(yǎng)條件粗放，操作方便簡(jiǎn)單，處理成本低，對(duì)重金屬污染的含氮廢水的高效凈化具有重要意義。
【專利說(shuō)明】耐受重金屬的好氧反硝化菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】的生物治理方法，具體是一種耐受重金屬 的好氧反硝化菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 地下水作為水資源的重要組成部分，在人類社會(huì)的發(fā)展過(guò)程中起著舉足輕重的作 用。近20年來(lái)，由于城市生活垃圾和工業(yè)"三廢"等的不合理處置，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥、化肥的 大量使用，全國(guó)地下水污染狀況日趨加重。根據(jù)2010年中國(guó)地質(zhì)局的取樣測(cè)試數(shù)據(jù)顯示， 我國(guó)東部主要平原地下水質(zhì)量總體堪憂，地下水三氮污染普遍，呈面狀污染特征，其超標(biāo)率 達(dá)到7. 7?15. 4%，淮河以北10多個(gè)省份約有3000萬(wàn)人飲用高硝酸鹽水，海河流域受污染 的地下水資源量占地下水總資源量的62%，農(nóng)村約有3. 6億人喝不上符合標(biāo)準(zhǔn)的飲用水。 重金屬檢出普遍呈點(diǎn)污染特征，多分布在城市周邊及工礦企業(yè)周圍的污灌區(qū)。這種多污染 物共同存在的復(fù)合污染嚴(yán)重威脅到了飲水安全和人民身體健康。因此修復(fù)和治理三氮、重 金屬?gòu)?fù)合污染的地下水已迫在眉睫。
[0003] 現(xiàn)在大多數(shù)關(guān)于地下水污染的原位修復(fù)技術(shù)都是針對(duì)某一類污染物的。對(duì)于氮素 污染的治理，生物脫氮是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的治理技術(shù)。好氧反硝化細(xì)菌是一類能在有氧 條件下發(fā)揮反銷化作用的微生物，因而也能與硝化作用同步進(jìn)行，并避免Ν0 3·-Ν對(duì)硝化反 應(yīng)的抑制，加速硝化反應(yīng)進(jìn)程。目前處理重金屬?gòu)U水的方法中生物吸附法是最有前途的方 法之一。所謂生物吸附法就是利用某些生物體本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)及成分特性來(lái)吸附溶于水中 的金屬離子，再通過(guò)固液兩相分離來(lái)去除水溶液中金屬離子的方法。近年來(lái)有關(guān)生物吸附 的報(bào)道中提及的都是非活性細(xì)胞的吸附作用，但死細(xì)胞的生物吸附難以實(shí)用化，而且對(duì)于 某些種類的金屬來(lái)說(shuō)，死細(xì)胞難以有效吸附，而活體菌卻可以實(shí)現(xiàn)特異性吸附，所以，人們 開始重新關(guān)注活體微生物在重金屬生物吸附中的利用。金屬離子進(jìn)入活細(xì)胞，一般要經(jīng)過(guò) 胞外結(jié)合與運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)兩個(gè)階段。前者是一個(gè)快速過(guò)程，不需要消耗能量，稱為被動(dòng)吸附； 后者進(jìn)行得較為緩慢，依賴于能量及代謝系統(tǒng)的調(diào)控，稱為主動(dòng)吸收。雖然研究者們分別在 生物脫氮和生物吸附領(lǐng)域都取得了較大的研究進(jìn)展，但還缺乏有關(guān)同步修復(fù)地下水氮污染 和重金屬污染的生物修復(fù)技術(shù)研究。
[0004] 經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN103937701A公開（公告）日 2014. 07. 23,公開了一種短小芽孢桿菌shou002及其應(yīng)用，其中的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)shou002于2013年11月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2013536,該短小芽孢桿菌shou002對(duì)水產(chǎn)病原菌具有良好的抑制作用，并且無(wú)致病 性，安全可靠，能夠有效的降解養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物、氨氮和亞硝酸氮等污染物，優(yōu)化養(yǎng)殖 環(huán)境，促進(jìn)水環(huán)境生態(tài)良性循環(huán)，可以用作飼料添加劑和水體生態(tài)環(huán)境改良劑應(yīng)用到水產(chǎn) 養(yǎng)殖中。但該技術(shù)并未涉及水體硝態(tài)氮的降解，且菌株本身不具有吸附重金屬的能力，無(wú)法 應(yīng)用于重金屬污染的含氮廢水。
[0005] 李涵在《好氧反硝化細(xì)菌的脫氮機(jī)理及其絮凝特性的研究》（南京理工大學(xué)，環(huán)境 工程，2013,碩士論文）中公開了兩株好氧反硝化細(xì)菌，分別命名為ADB4A和ADB7。設(shè)置硝 態(tài)氮進(jìn)水濃度為268. 8mg噸-1，在160r/min，30°C的環(huán)境條件下培養(yǎng)2天后，菌株ADB4A和 ADB7對(duì)硝態(tài)氮的降解率分別達(dá)到了 83%和63%。經(jīng)過(guò)16SrDNA序列測(cè)定，認(rèn)為菌株ADB4A 和ADB7分別為短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。為了更好地了解并利用好氧反硝化細(xì)菌，該 文獻(xiàn)從碳源、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速、pH等因素著手，用單因素法探討了好氧反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的 最佳環(huán)境條件以及環(huán)境對(duì)菌株的好氧反硝化作用的影響，均得到了最佳參數(shù)。但該技術(shù)在 對(duì)水體硝態(tài)氮進(jìn)行反硝化處理時(shí)，會(huì)導(dǎo)致水體中亞硝態(tài)氮和氨氮的積累，造成二次污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種耐受重金屬的好氧反硝化菌株及 其應(yīng)用，該菌株能夠耐受Cd 2+、Cu2+等重金屬，并能在上述重金屬存在的條件下進(jìn)行好氧反 硝化作用，有效去除水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，并吸附相應(yīng)的重金屬。該菌株培養(yǎng)條件粗 放，操作方便簡(jiǎn)單，處理成本低，對(duì)重金屬污染的含氮廢水的高效凈化具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)SNR - 3,目前該菌株保藏于中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，郵編：100101。保藏編號(hào)為CGMCC N0. 7126,保藏日期是2013年1月11日。
[0009] 所述的短小芽孢桿菌SNR - 3具有下述性質(zhì)：
[0010] 1、菌落形態(tài)學(xué)特征：在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為0.4?0.8X1. 5? 2. 7 μ m大小的桿菌，37°C培養(yǎng)2?3天形成芽孢，芽孢為長(zhǎng)圓形或圓柱狀。在上述培養(yǎng)基中 30°C培養(yǎng)8h菌體可以大量生長(zhǎng)。菌落呈白色，邊緣有褶皺，不透明，不閃光。
[0011] 2、生理與生化特性：培養(yǎng)溫度：20?37°C，最適溫度為30°C;在ρΗ5· 8?7. 5范圍 內(nèi)生長(zhǎng)；革蘭氏染色檢測(cè)呈陽(yáng)性；甲基紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)呈陽(yáng)性；硝酸鹽還原檢測(cè)呈陽(yáng)性；Π 引哚生 產(chǎn)檢測(cè)呈陽(yáng)性；H2S生產(chǎn)檢測(cè)呈陰性；脲酶生產(chǎn)檢測(cè)呈陰性。
[0012] 所述的短小芽孢桿菌SNR - 3經(jīng)16S rDNA序列測(cè)得，其16S rDNA大部分序列 1414bp，如SEQ ID No. 1所示，將該序列與GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其 與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)同源性達(dá)到99.9%。
[0013] 本發(fā)明涉及一種短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)SNR-3的應(yīng)用，將其用于脫除 污染水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，具體為：將短小芽孢桿菌SNR -3擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種于含有 Cd2+和/或Cu2+的含氮廢水中，菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)好氧反硝化作用脫除水體中的硝態(tài) 氮和亞硝態(tài)氮，同時(shí)利用生物吸附作用去除水體中的Cd 2+、Cu2+重金屬，并且被吸附的重金 屬全部位于胞內(nèi)，從而達(dá)到去除重金屬的目的。
[0014] 所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是指：將SNR -3菌株接種于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水的無(wú)菌發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在C/N比大于或等于5,初始pH為5. 8?7. 5、培養(yǎng)溫度為25?37°C的環(huán)境下 培養(yǎng)6?24小時(shí)。
[0015] 所述的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分：碳源2?40g/L，氮源0. 1?20g/L，無(wú)機(jī)鹽 0. 01?20g/L，其余為水，pH6. 0?7. 5,其中：所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木 糖、果糖、檸檬酸、甘油和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、 淀粉、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH 4)2S04、ΚΝ03和NH4N03中的任意一種或幾種的組 合；無(wú)機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
[0016] 所述的接種是指：按照0. 5?10%的比例投入到含氮廢水中。
[0017] 所述的含氮廢水中硝態(tài)氮的初始濃度為10?2000mg/L、亞硝態(tài)氮初始濃度為1? 350mg/L。
[0018] 所述的含氮廢水中Cd2+的初始濃度為0. 01?10mg/L，Cu2+的初始濃度為0. 01? 30mg/L。 技術(shù)效果
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果包括：
[0020] 1)本發(fā)明篩選獲得的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)能利用多種碳源和氮源 進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)條件十分粗放，操作方便簡(jiǎn)單。
[0021] 2)本發(fā)明提供的菌株能夠在好氧條件下進(jìn)行完全的反硝化作用，即將硝態(tài)氮直接 還原為氮?dú)?，?shí)現(xiàn)徹底脫氮且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染。
[0022] 3)本發(fā)明提供的菌株具有Cd2+、Cu2+重金屬耐受性，能夠通過(guò)菌體自身的生物吸附 作用去除重金屬離子，并且與好氧反硝化過(guò)程可以同步進(jìn)行，適用于處理含氮廢水或重金 屬污染的含氮廢水，具有優(yōu)異的環(huán)境效益和社會(huì)效益。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的菌落形態(tài)照片。
[0024] 圖2為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的菌落顯微鏡照片（1000X)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
[0026] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) SNR - 3的分離和純化
[0027] 富集培養(yǎng)基1 :酒石酸鉀鈉20g/L、檸檬酸三鈉10g/L、乙酸鈉10g/L、KN032g/ L、Κ2ΗΡ040· 5g/L、MgS04 · 7Η200· 2g/L、微量元素溶液 0· 2 %，ρΗ7· 5。微量元素溶液： EDTA-2Na57. lmg/L、ZnS04 · 7Η203· 9mg/L、CaCl2 · 2H207mg/L、MnCl2 · 4Η205· lmg/L、 FeS04 · 7H205. Omg/L、CuS04 · 5H20L 6mg/L、CoCl2l. 6mg/L。
[0028] 富集培養(yǎng)基2:在富集培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上加入lOOmg/L CuS04 · 5H20, 50mg/ L(CH3C00)2Cd · 2H20。
[0029] BTB 培養(yǎng)基：KN031. 0g/L，C6H5Na302 · 2H20L 0g/L，KH2P04L 0/Lg，F(xiàn)eS04 · 7Η200· 05g/ L，CaCl20. 2g/L, MgS04 · 7H20L 0g, 1 % 的 BTBlmL，瓊脂 20. 0g/L，pH6. 8。
[0030] 反硝化培養(yǎng)基：酒石酸鉀鈉 20g/L、KN032. 5g/L、K2HP040. 5g/L、MgS04 · 7H20(X 2g/L， 瓊脂 20.0g/L，pH7.5。
[0031] 從崇明島沿海灘涂地采集活性淤泥樣品，分別取不同采樣點(diǎn)的活性淤泥l(xiāng)Og加入 富集培養(yǎng)基1中，30°c、150r/min培養(yǎng)3d，以10%接種量接入新的富集培養(yǎng)基1中，繼續(xù)按 照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)馴化4次，以富集好氧反硝化細(xì)菌。
[0032] 將上述富集菌液重新接入富集培養(yǎng)基2中，以相同的方法進(jìn)行富集馴化培養(yǎng)，重 復(fù)4次后，吸取lmL富集培養(yǎng)液至9mL無(wú)菌生理鹽水中，得到ΚΓ 1稀釋度菌懸液，依次按10 倍稀釋法稀釋至1〇_8。分別吸取各稀釋度懸液〇. lmL至BTB固體培養(yǎng)基均勻涂布，30°C倒 置培養(yǎng)2?3d，挑取有藍(lán)色暈圈的單菌落，在反硝化固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)6代，直至 獲得菌落形態(tài)穩(wěn)定的純培養(yǎng)。 實(shí)施例2
[0033] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) SNR - 3對(duì)含氮污水的脫氮效果
[0034] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaC10. 5g/L，利用NaOH溶液 調(diào) ρΗ6· 5。
[0035] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨5g/L，Κ2ΗΡ0 4 · 3Η202· 5g/L， MgS04 · 7Η200· lg/L，利用 NaOH 溶液調(diào) ρΗ7· 0。
[0036] 將短小芽孢桿菌 B. pumilus SNR - 3(CGMCC NO. 7126)在種子培養(yǎng)基、30°C、200r/ min的搖床條件下培養(yǎng)10h，將種子液按2% (v/v)的種子量接種于預(yù)裝有3. 5L滅菌后的發(fā) 酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30°C，300r/min，通氣量1. 5L/min，發(fā)酵過(guò)程 無(wú)需調(diào)節(jié)pH。發(fā)酵12h，菌體濃度達(dá)到300 X 108cfu/mL。
[0037] 將上述菌液按4% (v/v)的接種量分別接入含有硝態(tài)氮初始濃度300mg/L、亞硝態(tài) 氮初始濃度l〇〇mg/L的污水中，其中：C/N比為15。在25°C、300r/min、通氣量1. 2L/min條 件下培養(yǎng)5d，取培養(yǎng)液在SOOOrpm條件下離心10min，取上清檢測(cè)硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量。
[0038] 表1菌株對(duì)含氮污水的脫氮效果

【權(quán)利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌SNR-3,其特征在于，該短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)保藏 于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 7126,保藏日期是2013年1月 11日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌SNR -3,其特征是，所述的短小芽孢桿菌SNR -3 經(jīng)16S rDNA序列測(cè)得序列如SEQ ID No. 1所示。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的短小芽孢桿菌SNR - 3的應(yīng)用，其特征在于，將其用 于脫除污染水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，具體為：將短小芽孢桿菌SNR -3擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種 于含有Cd2+和/或Cu2+的含氮廢水中，菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)好氧反硝化作用脫除水體中 的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，同時(shí)利用生物吸附作用去除水體中的Cd 2+、Cu2+重金屬，并且被吸附 的重金屬全部位于胞內(nèi)，從而達(dá)到去除重金屬的目的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是指：將SNR-3菌株接種于 含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，在C/N比大于或等于5,初始pH為5. 8? 7. 5、培養(yǎng)溫度為25?37°C的環(huán)境下培養(yǎng)6?24小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分：碳源 2?40g/L，氮源0· 1?20g/L，無(wú)機(jī)鹽0· 01?20g/L，其余為水，ρΗ6· 0?7. 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、 木糖、果糖、檸檬酸、甘油和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母 膏、淀粉、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH 4)2S04、KN0dPNH4N03中的任意一種或幾種的 組合；無(wú)機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的接種是指：按照0. 5?10 %的比例投 入到含氮廢水中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的含氮廢水中硝態(tài)氮的初始濃度為 10?2000mg/L、亞硝態(tài)氮初始濃度為1?350mg/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是，所述的含氮廢水中Cd2+的初始濃度為 0· 01 ?10mg/L，Cu2+ 的初始濃度為 0· 01 ?30mg/L。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK104152377SQ201410373873
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 張丹, 支月娥, 章健, 羅艷青, 初少華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)