一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因HbSAG12Hl及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因HbSAG12Hl，具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其cDNA長1524bp，包含一1038bp的開放讀碼框（0RF)，編碼345個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。根據基因序列設計引物，可對基因的表達水平進行定量，其表達豐度與葉片衰老水平的變化趨勢一致，可用于評估葉片是否衰老及衰老水平。該基因的獲得，為篩選橡膠樹衰老葉片及建立橡膠樹葉片衰老誘導體系創(chuàng)造了條件，具有重要的理論意義和潛在的商業(yè)價值。
【專利說明】-種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAGI2H1及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl及其應用。

【背景技術】
[0002] 植物衰老（senescence)是指植物細胞、組織、器官或整個植株生理功能的逐漸衰 退，是長期進化和自然選擇的結果，是一個高度調控的細胞程序性死亡（Progra_ed cell death，P⑶）過程。目前關于植物衰老的研究主要集中在葉片上，且大多集中于擬南芥、水 稻、煙草等模式植物。在葉片的衰老過程中，細胞結構、生理生化代謝以及基因表達調控等 都發(fā)生很多變化。在形態(tài)上，葉片因葉綠素的降解而呈現為黃色（Ougham H，H0rtensteiner S, Armstead I, et al. The control of chlorophyll catabolism and the status of yellowing as a biomarker of leaf senescence. Plant Biol (Stuttg),Suppl 第 I 期，4-14 頁，2008;H0rte.nsteiner S, KrSlltler B. Chlorophyll breakdown in higher plants. Biochim Biophys Acta,第 1807卷，第 8 期，977-988 頁，2011)，這一典型特征為相 關研究提供了極大的便利；在分子水平，葉綠素的降解常伴隨著一些標記分子如AtSAG12 等半胱氨酸蛋白酶表達水平的顯著上升（Lim PO, Kim HJ, Nam HG. Leaf senescence. Annu Rev Plant Biol,第 58 期，115-136 頁，2007)。
[0003] 天然橡膠（順-1，4-聚異戊二烯）是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，其主要來 源為橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡膠樹又叫巴西橡膠樹或三葉橡膠樹， 是一種隸屬于大戟科（Euphorbiaceae)的高大喬木。橡膠樹原產于亞馬遜河流域，目前作 為一種特種經濟作物在東南亞、中國和非洲等部分國家和地區(qū)廣泛移植。生產上，天然橡膠 通過用膠刀周期性地切割樹皮（內含乳管--一類橡膠生物合成與存貯的特異細胞）收集 膠乳而獲得。死皮（其主要類型為割面干涸，Tapping Panel Dryness,TPD)是指橡膠樹割 膠過程中出現的割線局部或整體不排膠現象。它會造成橡膠樹嚴重減產甚至完全絕收，是 目前生產上影響橡膠樹產量的關鍵因素（鄒智，楊禮富，王真輝，等.橡膠樹"死皮"及 其防控策略探討.生物技術通報，第9期，8-15頁，2012)。據統(tǒng)計，目前全球因死皮而停 割的橡膠樹約占開割樹的12-15% ;我國橡膠樹的死皮發(fā)生率約為25%，部分膠園甚至超 過50%。其中，僅死皮停割率就接近15%，并且每年以1-3%的速度遞增，每年造成的經濟 損失已超過30億人民幣。細胞和分子生物學證據表明，死皮的發(fā)生與植物的細胞程序性死 亡現象非常相似（Li DJ, Deng Z, Chen SC, et al. Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from Havea brasiliensis latex using suppression subtractive hybridization. BMC Plant Biol,第 10卷，第 I 期，140 頁，2010)。雖然如此，由于種種原因，深入開展死皮發(fā)生的分子機制研究面臨著嚴峻的挑 戰(zhàn)，原因如下：（1)橡膠樹為多年生高大喬木，傳統(tǒng)育種周期在30年以上；（2)橡膠樹的遺 傳轉化周期在1年以上，且轉化技術至今仍不是非常成熟（鄒智，楊禮富，王真輝，等.巴 西橡膠樹轉基因研究現狀與展望.中國生物工程雜志，第30卷，第1期，85-92頁，2010);
[3] 死皮與橡膠生產緊密相關，只有割膠后才能鑒定其癥狀，而橡膠樹的非生產期一般在8 年左右（鄒智，楊禮富，王真輝，等.橡膠樹"死皮"及其防控策略探討.生物技術通報， 第9期，8-15頁，2012) ; (4)死皮癥狀的鑒定需要多年的割膠和數月的跟蹤觀測，不利于 大批量地獲得實驗材料；（5)與產排膠相關的乳管組織位于樹干的次生韌皮部，誘導獲取 實驗材料屬于破壞性實驗，這對生產周期在25年以上的橡膠樹來說是莫大的損失；(6)乳 管組織無法分離進行離體培養(yǎng)和誘導；（7)遺傳轉化體系成熟的模式植物如擬南芥、煙草 等無乳管組織，對死皮相關基因的鑒定主要依賴葉片等組織（Peng SQ，Wu KX，Huang GX，et al. HbMybl, a Myb transcription factor from Hevea brasiliensis, suppresses stress induced cell death in transgenic tobacco. Plant Physiol Biochem,第 49 卷，第 12 期，1429-1435頁，2011)，而這無法避免物種不同所帶來的差異。因此，在橡膠樹上建立一 套高效、可重復的葉片衰老誘導體系成為開展橡膠樹死皮相關基因功能鑒定的重要保障。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl及其應用，可用于 評估橡膠樹葉片的衰老水平，保障橡膠樹葉片衰老誘導體系的順利進行。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是這樣實現的：
[0006] 一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl基因，其cDNA具有如SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列。
[0007] 進一步，所述的橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl編碼的氨基酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。
[0008] -種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl的表達水平在葉片衰老水平的 評估方面的應用。
[0009] 進一步，所述的橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl表達豐度與葉
[0010] 片的衰老水平變化趨勢一致。
[0011] 本發(fā)明所述的一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl，核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。其cDNA長1524bp，包含一 1038bp的開放讀碼框（ORF)，編碼345個氨基 酸，與植物半胱氨酸蛋白酶同源，與擬南芥SAG12 (TAIR登錄號為AT5G45890)的相似性為 57. 7 %。ProtParam分析顯示，HbSAG12Hl蛋白包含半胱氨酸酶活性所必須的3個活性位點； 與AtSAG12類似，HbSAG12Hl蛋白N端包含一的液泡定位的信號肽。根據序列設計引物，可 對基因的表達水平進行定量。通過對橡膠樹不同部位以及葉片不同生長時期HbSAG12Hl基 因的表達特性分析表明，所述的HbSAG12Hl基因僅在衰老葉片中表達，且其表達豐度隨著 葉片衰老水平的增加而增加。因此，通過對本發(fā)明所述的一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼 基因 HbSAG12Hl表達豐度進行定量分析，可用于評估葉片衰老水平，為篩選橡膠樹衰老葉 片創(chuàng)造了條件，同時為建立橡膠樹葉片衰老誘導體系的順利進行提供了保障，具有重要的 理論意義和潛在的商業(yè)價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1橡膠樹SAG12同源蛋白的進化分析
[0013] 以 AtSAG12 為根的進化樹用 MEGA4. 0(Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version4. 0. Mol Biol Evol，第24卷，第8期，1596-1599頁，2007)采用鄰近法構建而成，bootstrap值 設為1000,標尺表示每個殘基的替換率，分支長度表示進化距離，分支節(jié)點上的數字表示 bootstrap驗證中該支的可信度百分比。
[0014] 圖2橡膠樹HbSAG12Hl與AtSAG12及其他物種中的同源蛋白的多重比對
[0015] 圖3橡膠樹HbSAG12Hl基因的表達特性分析
[0016] 圖中M :Takara DL2000 ;1 :根；2 :樹皮；3 :木質部；4 :芽；5 :葉柄；6 :葉柄膠；7 : 古銅期葉片；8 :變色期葉片；9 :淡綠期葉片；10 :穩(wěn)定期葉片；11 :衰老早期葉片；12 :衰老 中期葉片；13 :衰老晚期葉片

【具體實施方式】
[0017] 下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施 例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于 本發(fā)明保護的范圍。
[0018] 實施例1
[0019] 橡膠樹AtSAG12同源基因的全基因組鑒定
[0020] 橡膠樹品系熱研7-33-97的全基因組序列采用454和Illumina測序技術相結合 的方法完成。
[0021] 以擬南芥SAG12蛋白（TAIR登錄號為AT5G45890)作為查詢序列，采用tBLASTn 程序（Altschul SF，Madden TL, SchSlTer AA，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res,第 25卷，第17期，3389-3402頁，1997)對上述基因組序列進行同源搜索，潛在的基因用 GeneMark(http://exon. gatech. edu/)預測和同源比對相結合的方法界定轉錄區(qū)。這樣， 總共獲得13條包含同源基因的scaffold。根據序列的相似性，將這些同源基因分別命 名為HbSAG12Hl-HbSAG12H13(圖1)。其中，HbSAG12Hl編碼345個氨基酸，其氨基酸序列 如SEQ ID NO :2所示，其與擬南芥SAG12 (TAIR登錄號為AT5G45890)的相似性最高，約為 57. 7% 〇 ProtParam(http://web. expasy. org/cgi-bin/protparam/protparam)分析顯不， HbSAG12Hl 蛋白的理論分子量（Mw)為 38. 20kD，等電點（pi)為 8. ZOoSMARTQittpV/smart. embl-heidelberg. de/)保守結構域分析表明，HbSAG12Hl蛋白含有1個Inhibitor_I29和 1個Peptidase_ClA結構域（其中包含半胱氨酸酶活性所必須的3個活性位點，即Cys活 性位點、His活性位點和Asn活性位點）（圖2)。此外，與AtSAG12類似（Otegui MS，Noh YS, Martinez DE,et al. Senescence-associated vacuoles with intense proteolytic activity develop in leaves of Arabidopsis and soybean. Plant J,第 41 卷，第 6 期，831-844頁，2005)，HbSAG12Hl的N端包含一液泡定位的信號肽（圖2)。
[0022] 實施例2
[0023] 橡膠樹成熟與衰老中期葉片的轉錄組深度測序
[0024] 橡膠樹品系為熱研7-33-97,葉片總RNA的提取參照文獻（Tang C，Huang D,Yang J, et al. The sucrose transporter HbSUT3plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis(para rubber tree) .Plant Cell Environ,第 33卷，第 10 期，1708-1720 頁，2010)。
[0025] 為篩選橡膠樹衰老葉片特異性表達的HbSAG12H基因，首先，采用 Hiseq2000 (Illumina Inc.，San Diego, CA, USA)對處于成熟期和衰老中期（葉片黃化比例 為成熟期的40-60% )葉片進行了轉錄深度測序，經過文庫構建、測序簇的生成、上機測序， 兩庫均獲得約 5G 的數據。接著，利用 Bowtie2 (Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie2. Nat Methods,第 9 卷，第 4 期，357-359 頁，2012)將測序獲得 的原始read比對到實施例1中獲得的13個HbSAG12H基因上（如無特別說明，Bowtie2均 默認參數），發(fā)現只有HbSAG12Hl在兩庫中有比對上的read，其數量分別為成熟期16條，衰 老中期3536 條，若以 RPKM(Reads Per kb per Million reads)值（Mortazavi A, Williams BA, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods,第5卷，第7期，621-628頁，2008)表示基因的表達豐度，HbSAG12Hl在衰 老中期葉片中的表達水平是成熟期的5051倍以上。
[0026] 實施例3
[0027] 橡膠樹HbSAG12Hl基因全長cDNA的克隆
[0028] 通過米用 Bowtie2 (Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie2. Nat Methods,第9卷，第4期，357-359頁，2012)將實施例2中獲得的轉錄組數 據比對到基因組上，界定HbSAG12Hl的全長cDNA為1524bp。
[0029] 根據上述序列信息，設計引物對 HbSAG12HlF (5'-CTG TGC CAT TTC AAA GAT TCA CTT CAA CG-3'）和 HbSAG12HlR(5'-CAA AAA CCC TGG AAG CTG TCA CTT GAG-3'）。
[0030] 米用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒將實施 例2中獲得的衰老中期葉片的總RNA反轉錄成cDNA，具體操作詳見試劑盒說明書。
[0031] 以衰老中期葉片反轉錄獲得的cDNA為模板，HbSAG12HlF和HbSAG12HlR為引物 進行 PCR 擴增，反應體系如下：L 0 μ L 模板 cDNA，5. 0 μ LlO X PCR buffer，5. 0 μ L25mmol/L MgS04,8. 0μ L2. 5mmol/L dNTP, 0. 5 μ L20 μ mol/L HbSAG12HlF, 0. 5 μ L20 μ M HbSAG12HlR, I. 0 μ Llu/ μ L Taq (TaKaRa)，加雙蒸水至 50 μ L。
[0032] 用Eppendorf5331PCR儀進行PCR反應，反應條件如下：94°C預變性3min，然后 941：3〇8,581：3〇8,721：9〇8,35個循環(huán)，最后721：延伸5111丨11。吸取2.5以1^?0?產物與 2.5yL溴酚藍混勻后用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳后，經溴化乙錠（EB)染色，再紫外成像 檢測。PCR產物挖膠回收后連接到pMD18-T上，用熱擊法導入JM109感受態(tài)細胞后，進行藍 白斑篩選、PCR驗證、質粒酶切電泳后，取處于對數生長期的陽性菌液ImL用400 μ L4°C預冷 的50%甘油保存，委托北京三博遠志生物有限責任公司用M13+/M13-進行雙向測序。這樣， 我們成功獲得HbSAG12H11524bp的全長cDNA。
[0033] 實施例4
[0034] 橡膠樹HbSAG12Hl基因的表達特性分析
[0035] 根據實施例3的測序結果，設計引物對HbSAG12HlFq (5'-TGG ATT GGA GAA AGG CAG G-3，）和 HbSAG12HlRq(5，-CTT CAC AAC CTT CGT TCC CA-3，）。
[0036] 橡膠樹品系熱研7-33-97組培苗根、樹皮、木質部、芽、葉柄、古銅期葉片、變色期 葉片、淡綠期葉片、穩(wěn)定期葉片、衰老早期葉片、衰老中期葉片、衰老晚期葉片總RNA的提 取參照文獻（Tang C, Huang D, Yang J，et al. The sucrose transporter HbSUT3plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis(para rubber tree). Plant Cell Environ,第 33卷，第10期，1708-1720頁，2010)，葉柄膠總RNA的提取參照文獻（Tang C，Qi J，Li H, et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis(para rubber tree). J Biochem Biophys Methods,第 70 卷，第 5 期，749-754 頁，2007)，然后采用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，具體操作詳見試劑盒說明書。
[0037] 分別以上述合成的cDNA為模板，上述HbSAG12HlFq和HbSAG12HlRq為引物進行半 定量 RT-PCR(內參為 18S rRNA，引物為 18SF:5'-GCT CGA AGACGA TCA GAT ACC-3' ；18SR: 5'-TTC AGC CTT GCG ACC ATA C-3'），反應體系如下：1. OyL 模板 cDNA，5. OyLlOXPCR buffer,5· 0 μ L25 mmol/L MgSO4,8· 0 μ L2. 5mmol/L dNTP，0· 5 μ L20μ mol/L HbSAG12HlFq 或 18SF，0· 5 μ L20 μ MHbSAG12HlRq 或 18SR，I. 0 μ Llu/μ L Taq(TaKaRa)，力口 雙蒸水至 50 μ L，每樣至少重復3次。
[0038] 用Eppendorf5331PCR儀進行PCR反應，反應條件如下：94°C預變性3min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 20s，18S rRNA 擴增 18 個循環(huán)，HbSAG12Hl 擴增 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸5min。吸取2. 5 μ L PCR產物與2. 5 μ L溴酚藍混勻后用1. 5%瓊脂糖凝膠進行電 泳后，經溴化乙錠（EB)染色，再紫外成像檢測。
[0039] 半定量RT-PCR分析結果顯示，內參基因18S rRNA在對照上述組織中的表達豐度 相對穩(wěn)定（圖3,下）；而HbSAG12Hl僅在衰老葉片中被檢測，并且隨著葉片衰老水平的增加 而增加（圖3,上）。
[0040] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl，其CDNA具有如SEQIDN0:l所示 的核苷酸序列。
2. 如權利要求1所述的一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl，編碼的氨基 酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如權利要求1至2任一項所述的一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl在 評估葉片衰老水平方面的應用。
4. 如權利要求3所述的一種橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl在評估葉片衰 老水平方面的應用，其特征在于：所述的橡膠樹半胱氨酸蛋白酶編碼基因 HbSAG12Hl的表 達豐度與葉片的衰老水平變化趨勢一致。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212824SQ201410356280
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權日:2014年7月24日
【發(fā)明者】鄒智, 龔俊, 楊禮富 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所