一種篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明建立了一種直接篩選和鑒定出miRNAs調(diào)控的基因組DNA的方法。該方法是將生物素標(biāo)記到研究的目的miRNAs上，利用生物素和鏈霉親和素之間的親和力將生理狀況下與生物素標(biāo)記的miRNAs靶向結(jié)合在一起的基因組DNA分離和純化出來，然后將分離純化的DNA進(jìn)行克隆和測(cè)序獲得DNA序列信息，通過生物信息學(xué)分析DNA序列所在的基因位置和基因名稱，獲得調(diào)控基因組DNA的miRNAs的所有靶標(biāo)基因。通過本發(fā)明建立的方法可以應(yīng)用到所有靶向基因組DNA的miRNAs的功能研究。
【專利說明】[0001] 一種篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法，為miRNAs的功能研究 中尋找其調(diào)控的可能靶基因提供了一種簡單、實(shí)用的方法。 【背景技術(shù)】
[0003] miRNAs是一類由大約19-23個(gè)堿基組成的單鏈RNA分子，是一種不能編碼蛋白質(zhì) 但是具有重要調(diào)控作用的小RNA。成熟的miRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)可以結(jié)合到靶基因的相 關(guān)序列上面，現(xiàn)在已知報(bào)道的結(jié)合位點(diǎn)可以位于基因 mRNA的3'和5'非翻譯區(qū)，也可能位于 基因的啟動(dòng)子區(qū)域?，F(xiàn)在已知miRNAs在包括細(xì)胞分化、凋亡、增殖、發(fā)育、造血和腫瘤等多 種生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控功能。由于miRNA發(fā)揮調(diào)控生命活動(dòng)的作用是通過與調(diào)控靶 基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，所以對(duì)于miRNAs革E基因的尋找和確定對(duì)于miRNAs的功能研究具有重 要的意義。但是由于miRNAs和靶基因之間的互補(bǔ)結(jié)合可以通過堿基的不完全匹配，因此一 個(gè)miRNA可能會(huì)調(diào)控很多種的祀基因，所以導(dǎo)致miRNAs的尋找十分困難?，F(xiàn)在對(duì)于miRNAs 靶基因的尋找主要是通過生物軟件的預(yù)測(cè)，但是生物軟件預(yù)測(cè)具有不真實(shí)性、假陽性率較 高、工作量太大等缺陷，所以使用實(shí)驗(yàn)方法直接分離和篩選出miRNAs調(diào)控的靶基因具有了 十分重要的價(jià)值。基因的啟動(dòng)子等基因組區(qū)域由于存在很多的甲基化等修飾，使得基因組 區(qū)域DNA的折疊和裸露程度都很復(fù)雜，對(duì)于miRNAs與這些區(qū)域的結(jié)合更加難以預(yù)測(cè)，因此 建立一種在正常生理狀態(tài)下直接篩選和鑒定出miRNAs調(diào)控的基因組DNA對(duì)于miRNAs的功 能研究具有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可以直接且準(zhǔn)確篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方 法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： (1) 將miRNAs與靶基因組DNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA鏈進(jìn)行生物素標(biāo)記，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用甲 醛將miRNAs和與之結(jié)合的DNA、蛋白交聯(lián)在一起； (2) 通過生物素（biotin)和鏈霉親和素（streptavidin)之間的強(qiáng)親和力作用，將生物 素標(biāo)記的miRNAs以及結(jié)合在一起的DNA進(jìn)行親和沉淀分離和純化； (3) 通過克隆和測(cè)序鑒定分離純化出來的DNA序列，利用生物信息學(xué)分析DNA序列所在 基因的名稱，鑒定出miRNAs調(diào)控的靶基因。
[0006] 本發(fā)明可以篩選和鑒定出miRNAs調(diào)控的任意一個(gè)基因組DNA序列和相應(yīng)的基因 名。同時(shí)，通過本發(fā)明建立的方法可以應(yīng)用到所有靶向基因組DNA的miRNAs的功能研究。
[0007] 已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明該方法能夠有效的將miRNA-373調(diào)控的上皮鈣粘蛋 白（epithelia cadherin， E-cadherin)和冷休克結(jié)構(gòu)域蛋白 C2 (Cold shock domain-containing protein C2，CSDC2)的啟動(dòng)子區(qū)域DNA進(jìn)行了分離和純化，同時(shí)將分離 純化到的DNA通過克隆和測(cè)序獲得DNA序列，利用生物信息學(xué)分析獲得了 DNA序列所在的 基因名稱，并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 miRNA-373能夠促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平升高， 證實(shí)了 miRNA-373能夠調(diào)控這些基因的表達(dá)。因此本發(fā)明成功構(gòu)建了一種篩選和鑒定出 miRNA調(diào)控的基因組DNA的實(shí)驗(yàn)方法。該方法的建立將對(duì)miRNA的功能研究具有重要的意 義，同時(shí)因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)miRNAs在癌癥和腫瘤等疾病的發(fā)生中具有重要的調(diào)控作用，所以該 方法的建立也有助于尋找與腫瘤等疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的腫瘤基因，為腫瘤等疾病的治療 和藥物開發(fā)提供靶位點(diǎn)，對(duì)于腫瘤等疾病的治療相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和前 旦 -5^ 〇 【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1 :生物素標(biāo)記的miRNA-373通過啟動(dòng)子調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。
[0009] 圖 2 :Streptavidin_Biotin 親和沉淀流程圖。
[0010] 圖3 :miR-373靶基因 E-cadherin和CSDC2的啟動(dòng)子能夠被沉淀。
[0011] 圖4 :DNA克隆測(cè)序流程圖。
[0012] 圖5 :miR-373調(diào)控未知靶基因的表達(dá)。 【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 miRNA進(jìn)行生物標(biāo)記和轉(zhuǎn)染 將miRNA-373的反義鏈3'末端進(jìn)行生物素標(biāo)記，使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，24小時(shí)后使用Trizol對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用實(shí)時(shí) 定量PCR方法檢測(cè)miRNA-373對(duì)靶基因 E-cadherin的表達(dá)調(diào)控作用，使用擴(kuò)增引物為： E-cadherinRTF :5' -CCTGGGACTCCACCTACAGA-3'， E-cadherinRTR:5' - GGATGACACAGCGTGAGAGA-3'。
[0014] actinRTF: 5, - CGTGGACATCCGCAAAGAC-3,， actinRTR:5' - TCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'。
[0015] 生物素標(biāo)記的miRNA-373序列： miRNA-373anti-3biotin :5' -GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU-3' -biotin。
[0016] 實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 正常乳腺癌細(xì)胞MCF-7來自美國ATCC公司。在37°C、5% C02、90%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中 用DMEM完全培養(yǎng)液(加10%新生牛血清、2 mM L-谷氨酸、青霉素和鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì) 胞密度至50%-60%。用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將生物素標(biāo)記的miRNA-373 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染之前換成無血清無抗生素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，換成有血 清和抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0017] 實(shí)施例 3 Streptavidin-Biotin pull-down 實(shí)驗(yàn) 如上述用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將生物素標(biāo)記的miRNA-373轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞 中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后每皿細(xì)胞10mL培養(yǎng)液中加入270 μ L 37%福爾馬林溶液(終濃度為1%)室 溫處理l〇min，使蛋白質(zhì)和RNA充分交聯(lián)。然后加入lmL 10x Glycine (甘氨酸）室溫5min 終止反應(yīng)。吸掉培養(yǎng)皿中的液體，用10mL預(yù)冷的lxPBS洗滌細(xì)胞兩次，用lmL lxPBS (2% Cocktail，RNase Inhibitor 100U/mL)刮下細(xì)胞，800g，3min收獲細(xì)胞于 1.5mL RNase-Free 離心管中。每管細(xì)胞加入500 μ L lysis buffer打勻，冰上靜置30min。進(jìn)行超聲處理打斷 基因組DNA，超聲工作條件：200W，超聲5秒，間隙5秒，超聲15次。靜置于冰上5分鐘后， 于4°C離心機(jī)14000g離心30s。將上清轉(zhuǎn)移至一新的1. 5 mL RNase-Free離心管中，加入 30yL平衡好的streptavidin珠子，室溫孵育lh。室溫孵育lh后，4°C離心機(jī)500g 5min 離心獲得珠子，用wash buffer洗漆珠子3次，最后4°C離心機(jī)500g 5min離心獲得珠子。 用加入蛋白酶K (Proteinase K)和RNAase的懸液重懸珠子，42°C水浴鍋處理1小時(shí)，然后 在65 °C下處理20分鐘完全逆轉(zhuǎn)交聯(lián)作用。完全逆轉(zhuǎn)交聯(lián)作用的產(chǎn)物利用染色體免疫共沉 淀相關(guān)試劑盒回收DNA，具體操作：向每管樣品中各加入lml的Bind reagent A，混勻，每次 轉(zhuǎn)移600 μ L的上述溶液至離心柱內(nèi)，12000g，離心30秒，重復(fù)上一步將所有的溶液都轉(zhuǎn)移 到離心柱內(nèi)離心，然后加入500 μ L的wash reagent B至柱中，12000g離心30秒，去收集管 內(nèi)液體，最后加入Elution buffer至濾膜中央，室溫靜置3分鐘，13000g離心1分鐘，收集 管內(nèi)即沉淀下來的DNA，-20°C冰箱保存。
[0018] 實(shí)施例4 DNA克隆及鑒定 Streptavidin-Biotin親和沉淀實(shí)驗(yàn)中洗脫沉淀的DNA經(jīng)快速末端平滑化試劑盒 (New England BioLabs)進(jìn)行平末端化處理，樣品于室溫放置30°C分鐘后再70°C 10分鐘 處理是平末端化酶失活。然后用DNA末端加 A試劑盒(上海生工)是DNA末端加上一個(gè)堿基 A，樣品于72°C反應(yīng)10分鐘后，等體積加入溶于2. 5M NaCl的20% PEG-8000,于冰上放置1 小時(shí)以沉淀DNA，4°C，12000g離心10分鐘后用75%乙醇清洗沉淀DNA，于室溫干燥DNA后加 水溶解。溶解的DNA鏈連接到大連寶生物T-easy載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑 取單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)VectorNTI分析獲取目的DNA序列后，使用UCSC和 NCBI進(jìn)行序列分析，獲得DNA序列所在基因的位置和基因名稱。
[0019] 表1測(cè)序分析獲得的miR-373調(diào)控的靶基因
【權(quán)利要求】
1. 一種篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法，其特征在于包括： (1) 將miRNAs與靶基因組DNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA鏈進(jìn)行生物素標(biāo)記，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用甲 醛將miRNAs和與之結(jié)合的DNA、蛋白交聯(lián)在一起； (2) 將生物素標(biāo)記的miRNAs以及結(jié)合在一起的DNA進(jìn)行Streptavidin-Biotin親和沉 淀分離和純化； (3) 通過克隆和測(cè)序鑒定分離純化出來的DNA序列，鑒定出miRNAs調(diào)控的靶基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法，其特征在于所述 miRNAs 為 miRNA-373。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法，其特征在于將 miRNA-373的反義鏈3'末端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的篩選和鑒定miRNAs所調(diào)控的基因的方法，其特征在于轉(zhuǎn) 染MCF-7細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104087669SQ201410326335
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】向雙林, 魏科, 顏峰, 胡翔, 張健 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)