一種小麥莖基腐病菌的分離方法
【專利摘要】一種小麥莖基腐病菌的分離方法，先采集小麥植株，在通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置1-2天后，從基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取1.8-2.2㎝莖段；用清水沖洗，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗；之后放入底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，加入1-2mL無(wú)菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)，直至莖段上長(zhǎng)出菌絲；挑取菌絲，種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，于25℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)；用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。發(fā)明方法分離成功率高，處理后的莖稈可很快長(zhǎng)出菌絲，轉(zhuǎn)入PSA上后也能很快長(zhǎng)出小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率達(dá)95%以上。
【專利說(shuō)明】一種小麥莖基腐病菌的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種病菌的分離方法，具體的說(shuō)是一種小麥莖基腐病菌的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在進(jìn)行病原真菌的形態(tài)、生理、生態(tài)及致病性的分子生物學(xué)等理論性研究工作中， 以及進(jìn)行品種抗病性鑒定和篩選對(duì)病原菌有抑制作用的藥劑等應(yīng)用性研究工作中，常常需 要病原真菌的純培養(yǎng)物。植物患病組織內(nèi)的真菌菌絲體，如果給予適宜的環(huán)境條件，一般都 能恢復(fù)生長(zhǎng)和繁殖。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病 組織或其它基物中將病原菌單獨(dú)分離出來(lái)，稱作植物病原真菌的分離。植物病原真菌的分 離在植物病理學(xué)科研工作中也具有十分重要的位置：對(duì)分離到的病原真菌進(jìn)行保存可以滿 足植物病理學(xué)及微生物學(xué)日常的教學(xué)需要，使學(xué)生對(duì)植物病原真菌有更直觀的認(rèn)識(shí)。
[0003] 近年來(lái)，隨著氣候變暖及秸桿還田等耕作栽培措施的推廣，小麥莖基腐病在我國(guó) 各大麥區(qū)發(fā)生普遍并造成一定的損失，為害日益嚴(yán)重，逐漸引起農(nóng)業(yè)科技工作者的重視。 小麥莖基腐病從小麥分蘗到成熟期均可發(fā)生，可使莖基部葉鞘和莖桿變褐，莖節(jié)壞死，嚴(yán) 重時(shí)可使植株死亡、枯白，出現(xiàn)白穗，影響小麥產(chǎn)量。小麥莖基腐病由多種病原真菌侵染 引起，主要的致病性真菌類群包括鐮孢菌（Fusarium spp.)、小麥根腐離懦孢（Bipolaris sorokinianum)及其它一些真菌，其中前兩者的分離比率很高，但不同小麥生態(tài)區(qū)域的致病 菌種類存在一定差異。鑒于小麥莖基腐病在我國(guó)小麥生產(chǎn)區(qū)呈流行蔓延的趨勢(shì)，有必要加 緊對(duì)其防治策略的研究。由于引起小麥莖基腐病的病原菌均屬于兼性寄生真菌，可從發(fā)病 小麥植株的莖基部分離獲得純培養(yǎng)，為以后的病原菌種類確認(rèn)、抗病性品種鑒定及藥劑篩 選等工作提供便利。小麥莖基腐病菌的分離是進(jìn)行后續(xù)研究的基礎(chǔ)。
[0004] 植物病原真菌的分離包括組織分離法和稀釋分離法。由于組織分離法存在著費(fèi) 時(shí)、費(fèi)力、成本高、操作要求高等特點(diǎn)，故不適宜對(duì)大量的小麥莖基腐病病株進(jìn)行病原菌分 離。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，提供一種小麥莖基腐病菌的分離方 法，省時(shí)、安全，可大用于大量的小麥莖基腐病病株進(jìn)行病原菌分離；分離成功率高，處理后 的莖桿可很快長(zhǎng)出菌絲，轉(zhuǎn)入PSA上后也能很快長(zhǎng)出小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率 達(dá)95%以上。
[0006] -種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置1-2天；然后從放置后 的小麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水 沖洗干凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l-2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)1-2天，以便于植株表面的水分揮發(fā)； 直至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25 °C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0007] 所述PSA培養(yǎng)基，每lOOmlPSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0,余量為水。有益效果是： 1、本發(fā)明小麥莖基腐病菌的分離方法，將從田間采回的小麥植株室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下 放置1-2天，待上面的水分揮發(fā)后再進(jìn)行后續(xù)處理，能讓莖桿上盡快長(zhǎng)出菌絲；；為了排 除細(xì)菌污染，莖段保濕前應(yīng)先用75%的酒精消毒，時(shí)間太短達(dá)不到消毒效果，太長(zhǎng)則對(duì)要分 離的小麥莖基腐病菌造成傷害，以15 s為宜；另外，每200 mL PSA中應(yīng)預(yù)先加入25%的乳 酸1 mL，酒精結(jié)合乳酸的效果，既達(dá)到抑制細(xì)菌滋生的作用，又有利于小麥莖基腐病菌的分 離。本發(fā)明方法分離成功率高，處理后的莖桿可很快長(zhǎng)出菌絲，轉(zhuǎn)入PSA上后也能很快長(zhǎng)出 小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率達(dá)95%以上。
[0008] 2、本發(fā)明小麥莖基腐病菌的分離方法僅需對(duì)發(fā)病莖桿進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，無(wú)需從一個(gè) 病斑的病健交界處切取4-5塊3X3mm的組織小塊，也無(wú)需升汞溶液或次氯酸鈉消毒、無(wú)菌 水清洗及濾紙吸干等步驟，操作簡(jiǎn)單；采用組織分離法進(jìn)行小麥莖基腐病菌分離時(shí)，一般 每個(gè)病株的操作過(guò)程需要10-15 min，而此法則可在1 min內(nèi)完成1個(gè)病株的酒精消毒、培 養(yǎng)皿保濕的步驟，1 min完成挑菌絲培養(yǎng)的步驟，操作迅速。
[0009] 3、現(xiàn)有技術(shù)的組織分離法同一莖桿上切下的幾個(gè)組織小塊用酒精及NaCIO消毒 時(shí)各需一副培養(yǎng)皿，三次無(wú)菌水清洗時(shí)又需要三幅培養(yǎng)皿，每次消毒及清洗培養(yǎng)皿均需更 換一次，1個(gè)病株需要5副培養(yǎng)皿才可以分離完畢；而此法保濕及分離時(shí)4-5個(gè)病株用1 個(gè)培養(yǎng)皿即可，操作中無(wú)需升汞或NaCIO等化學(xué)試劑，所需耗材及試劑很少，節(jié)約了試驗(yàn)成 本，且安全、對(duì)人體無(wú)害。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置1-2天；然后從放置后 的小麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水 沖洗干凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l_2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)1-2天，以便于植株表面的水分揮發(fā)； 直至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長(zhǎng)一致的菌落，鏡檢分生孢子形態(tài)，包括顏色、細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0011] 所述PSA培養(yǎng)基，每lOOmlPSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 余量為水。實(shí)施例1 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置1天；然后從放置后的 小麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取1. 8 cm莖段；將所剪取的莖段用清水沖洗干 凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗2次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l_2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)1天，以便于植株表面的水分揮發(fā)；直 至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長(zhǎng)一致的菌落，鏡檢分生孢子形態(tài)，包括顏色、細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0012] 所述PSA培養(yǎng)基，每lOOmlPSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 余量為水。實(shí)施例2 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置2天；然后從放置后的 小麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水沖洗干 凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l_2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)2天，以便于植株表面的水分揮發(fā)；直 至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長(zhǎng)一致的菌落，鏡檢分生孢子形態(tài)，包括顏色、細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0013] 所述PSA培養(yǎng)基，每lOOmlPSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 余量為水。實(shí)施例3 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在室內(nèi)通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置2天；然后從放置后的 小麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取2. 0 cm莖段；將所剪取的莖段用清水沖洗干 凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗2次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l_2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)1. 5天，以便于植株表面的水分揮發(fā)； 直至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長(zhǎng)一致的菌落，鏡檢分生孢子形態(tài)，包括顏色、細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0014] 所述PSA培養(yǎng)基，每lOOmlPSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 余量為水。試驗(yàn)例 從河南省鄭州市、洛陽(yáng)市、許昌市三地采集小麥莖基腐病標(biāo)本120余株，從中選取癥狀 典型的(莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色）的植株100株，分為兩組，一組采用 常規(guī)的組織分離法進(jìn)行分離小麥莖基腐病菌；第二組采用本發(fā)明方法進(jìn)行分離小麥莖基腐 病菌； 一組的采用組織分離法分離時(shí)，對(duì)莖桿進(jìn)行清水處理后，每個(gè)莖段在病健交界處切取 3 X 3mm的組織塊，依次用75%酒精消毒15s、2-3%的NaCIO消毒3min，然后在無(wú)菌水中沖洗 三遍，無(wú)菌濾紙吸干水后放于含乳酸的PSA上培養(yǎng)，3-4天后觀察，挑取生長(zhǎng)一致的菌落鏡 檢后保存。由于此法要經(jīng)過(guò)莖桿分段再切塊、多次消毒、清水沖洗及濾紙吸干等步驟，一個(gè) 病株處理完畢約需10-15 min，病株多時(shí)相當(dāng)費(fèi)力；且兩次消毒及三次清洗時(shí)需要的培養(yǎng)皿 較多(約200副)，培養(yǎng)時(shí)每個(gè)病株又需要1個(gè)培養(yǎng)皿。
[0015] 采用本發(fā)明方法進(jìn)行分離時(shí)，莖桿經(jīng)清水處理后，直接剪取第一、二莖節(jié)變褐的莖 段，約2-3cm，75%酒精消毒15s后在無(wú)菌水中沖洗一遍，然后將莖段放于皿底有無(wú)菌濾紙的 培養(yǎng)皿里保濕培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿放5個(gè)莖段，50個(gè)病株需10個(gè)培養(yǎng)皿即可；2天后，莖段上 已長(zhǎng)出菌絲；用接種針挑取莖段上的菌絲，轉(zhuǎn)至含乳酸的PSA上培養(yǎng)，每個(gè)PSA平板可轉(zhuǎn)5 個(gè)莖段上的菌絲，培養(yǎng)2d后挑選生長(zhǎng)一致的菌落鏡檢后進(jìn)行菌株保存。采用莖段保濕培養(yǎng) 法，經(jīng)過(guò)一周的時(shí)間50株小麥莖基腐病病株全部分離完畢，共得到小麥莖基腐病菌48株。
【權(quán)利要求】
1. 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其特征在于：其操作步驟為： 步驟一、采集有白穗癥狀且莖桿基部第一、二莖節(jié)處的葉鞘或莖桿變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將采集到的小麥植株在通風(fēng)陰涼條件下攤開(kāi)放置1-2天；然后從放置后的小 麥植株基部第一、二莖節(jié)處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水沖洗 干凈，然后用75%酒精消毒15s，再用無(wú)菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿里，向培養(yǎng)皿中加入l_2mL無(wú) 菌水，然后置于生化培養(yǎng)箱中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)1-2天，直至莖段上長(zhǎng)出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個(gè)莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養(yǎng)基上，然后 置于25°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養(yǎng)基中加入lmL質(zhì)量百分比為25%的乳酸； 步驟五、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉(zhuǎn)至PSA斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱 中，25°C、黑暗條件下培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
2. 如權(quán)利要求所述的小麥莖基腐病菌的分離方法，其特征在于：所述PSA培養(yǎng)基，每 100ml PSA培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為6. 0,余量為水。
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK104087515SQ201410300309
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】侯穎, 徐建強(qiáng), 夏彥飛, 范倩倩, 范利峰 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)