一種hpv高危型分型熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和兩種或以上的PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2％和乙醇0.05～1％；其中有一種PCR反應(yīng)液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探針序列，另有一種PCR反應(yīng)液中包含內(nèi)標(biāo)的引物探針序列。應(yīng)用本發(fā)明提供的該試劑盒，可以對(duì)疣體表面脫落細(xì)胞、婦女宮頸上皮細(xì)胞、生殖道分泌物等未知樣本中的高危型人乳頭瘤病毒的DNA核酸片段進(jìn)行快速熒光PCR進(jìn)行分型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可用于高危型人乳頭瘤病毒感染的輔助診斷，及宮頸癌的早期篩查、宮頸病變的隨訪、用于指導(dǎo)疫苗的開發(fā)。
【專利說明】—種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒(HPV)高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HP V)是一類分子量較小的無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，專性侵染和寄生人體生殖器官及其它組織器官的上皮細(xì)胞。在臨床上，根據(jù)HPV不同亞型致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小不同可將HPV分為高危型和低危型兩大類。低危型HPV主要引起肛門皮膚及男性外生殖器、女性大小陰唇、尿道口、陰道下段的外生性疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宮頸癌及高度子宮頸上皮內(nèi)瘤變，其病毒亞型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型。
[0003]HPV在人群中極易傳播擴(kuò)散，可通過直接或間接接觸交叉?zhèn)魅?，其感染部位隱蔽，發(fā)病隱匿，不易早期發(fā)現(xiàn)，可致多種增生性病變，在女性生殖系統(tǒng)所引起的最常見的惡性腫瘤為宮頸癌。全世界每年約有50萬婦女宮頸癌新發(fā)病例，其中亞洲約占38萬；每年約有27萬女性死于子宮頸癌。在不同地區(qū)、不同經(jīng)濟(jì)狀況的國家宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有著顯著的差別，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年約有15萬宮頸癌新發(fā)病例，每年約有3萬人死于子宮頸癌，其死亡率居?jì)D科腫瘤的第二位。近年來，宮頸癌病人數(shù)目在逐漸上升，并呈年輕化的趨勢(shì)。
[0004]對(duì)宮頸癌的病因?qū)W研究可知，高危HPV持續(xù)感染是子宮頸癌的主要致病因素，99.7%宮頸癌患者存在HP V感染。臨床研究顯示，從HPV的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變并最終發(fā)展為宮頸癌大約需要8-10年。因此篩查是目前預(yù)防和早期診斷宮頸癌的主要手段。在檢出的所有型別中主要有冊(cè)￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。早期宮頸病變的治療效果遠(yuǎn)比宮頸癌的治療效果要好得多，因此，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出HPV高危型的感染，且能夠準(zhǔn)確分型，對(duì)于早期治療和降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率等具有重要的意義。
[0005]目前，國內(nèi)外對(duì)于宮頸癌的早期篩查方法主要有細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)方法，有宮頸巴氏(Pap)涂片、陰道鏡活檢、液基薄層細(xì)胞學(xué)或薄片制備細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)等多種。宮頸巴氏涂片是群體篩查的常規(guī)手段，但受取材、涂片制作質(zhì)量、閱片技術(shù)影響，準(zhǔn)確性低，假陽性率高，重復(fù)性差，敏感性也有限，漏診率可達(dá)30%。TCT法大大改進(jìn)了細(xì)胞學(xué)檢查的準(zhǔn)確性，逐漸取代傳統(tǒng)的巴氏法?？捎^察宮頸上皮血管微小變化的陰道鏡檢查雖敏感、準(zhǔn)確，但會(huì)引起不適、操作不便、費(fèi)用高，不易為廣大患者接受。宮頸組織活檢有創(chuàng)傷，不利于人群普查。由于宮頸HPV感染多為隱性亞臨床感染，且HPV不能在培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定生長，大部分HPV感染無臨床癥狀或?yàn)閬喤R床感染但可致嚴(yán)重后果，因此，該感染不能作為一個(gè)普通的臨床疾病或通過常規(guī)篩查計(jì)劃或性傳播疾病調(diào)查得以發(fā)現(xiàn)，只能通過HPV DNA檢測(cè)得知。
[0006]目前HPV DNA的檢測(cè)主要通過應(yīng)用分子生物學(xué)方法，包括核酸雜交方法、基因芯片技術(shù)以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)等。其中核酸雜交方法又包括DNA印跡雜交、原位雜交技術(shù)、雜交捕獲方法和分子導(dǎo)流雜交。基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)時(shí)間不長，其發(fā)展勢(shì)頭迅猛，應(yīng)用十分廣泛，但其存在的缺陷限制了其在臨床的應(yīng)用。首先是成本的問題，由于芯片制作的工藝復(fù)雜，信號(hào)檢測(cè)也需專門的儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室難以承擔(dān)其高昂的費(fèi)用，其次在芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù)上還有多個(gè)環(huán)節(jié)尚待提聞，如在探針合成方面，如何進(jìn)一步提聞合成效率及芯片的集成程度是研究的焦點(diǎn)。目前認(rèn)為PCR技術(shù)是檢測(cè)HPV DNA及分型的最好方法。熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問題，減少了污染。大量研究表明用PCR技術(shù)檢測(cè)HPV DNA的陽性率遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)技術(shù)，是當(dāng)今用于HPV感染診斷最常用的有力工具，且能更好的應(yīng)用于HPV致病、致癌機(jī)理的研究之中。
[0007]結(jié)合國內(nèi)情況，在臨床高危型人乳頭瘤病毒感染的分型診斷中，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性，目前只有極少量熒光PCR診斷試劑盒在臨床高危HPV感染診斷中使用，但是缺乏完善的質(zhì)控體系，操作比較繁瑣，靈敏度不高，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確快速診斷的需要。
[0008]運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0009]目前國內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)人乳頭瘤病毒的核酸進(jìn)行提取:先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。對(duì)于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有 的可以看到沉淀，有的無法看到，看得到沉淀的是因?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，這樣，導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無法看到沉淀，使操作者無法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到病毒核酸。
[0010]臨床上檢測(cè)高危HPV-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0011]國內(nèi)已有一些基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)高危HPV-DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，這些試劑盒所提供的高危型HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。且這些試劑盒的檢測(cè)靈敏度不高，約在lOOOOcopies/ml左右；還因沒有設(shè)置陽性內(nèi)對(duì)照(即內(nèi)標(biāo))，無法監(jiān)控假陰性，和一般沒有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施。且現(xiàn)有HPV基因分型方法復(fù)雜，操作過程繁瑣，需要開蓋操作，容易污染，現(xiàn)有的熒光PCR分型試劑，所能區(qū)分的型別少。另外，受限于其引物探針序列，本領(lǐng)域還需開發(fā)出一種檢測(cè)高危型HPV-DNA特異性好且綜合性能優(yōu)良的分型PCR檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有高危型人乳頭瘤病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒的缺陷，提供一種操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬的高危型人乳頭瘤病毒熒光定量PCR分型檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用該試劑盒，可以對(duì)疣體表面脫落細(xì)胞、婦女宮頸上皮細(xì)胞、生殖道分泌物等未知樣本中的高危型人乳頭瘤病毒16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型、68型這15種型別的DNA核酸片段進(jìn)行快速熒光PCR進(jìn)行分型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可用于高危型人乳頭瘤病毒感染的輔助診斷，及宮頸癌的早期篩查、宮頸病變的隨訪、用于指導(dǎo)疫苗的開發(fā)。
[0013]因此，本發(fā)明提供一種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和兩種或以上的PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~
0.5mmol/L，氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;其中有一種PCR反應(yīng)液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探針序列，另有一種PCR反應(yīng)液中包含內(nèi)標(biāo)的引物探針序列；
[0014]其中，用于16型、18型和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為，
[0015]16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0016]16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0017]16 型探針:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ；
[0018]18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0019]18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC,
[0020]18 型探針:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ；
[0021]內(nèi)標(biāo)上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0022]內(nèi)標(biāo)下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG，
[0023]內(nèi)標(biāo)探針:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0024]在一種具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒中共含任選的2~16種PCR反應(yīng)液，且在所述2~16種PCR反應(yīng)液中還共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型這13種高危HPV型的引物探針序列中的一種或多種，且每種PCR反應(yīng)液中含有上述共16種型別中任選的一種或兩種型別的引物探針序列；
[0025]其中，用于這13種高危HPV型擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為，
[0026]31 型上游引物:AGCCAACAACACCACCACATC，
[0027] 31 型下游引物:GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG，[0028]31 型探針:TCGCCCGCCGCACACCTTCA ；
[0029]33 型上游引物:ACCGCCCAGCCCCTTAC，
[0030]33 型下游引物:GTCCGCTGCTTGTTTGTGC，
[0031]33 型探針:CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ；
[0032]35 型上游引物:TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT，
[0033]35 型下游引物:TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT，
[0034]35 型探針:CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ；
[0035]39 型上游引物:CCAGACGGGATGAACCACA，
[0036]39 型下游引物:CACACCACGGACACACAAATC，
[0037]39 型探針:AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ；
[0038]45 型上游引物:TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
[0039]45 型下游引物:AAAACCAGCCGTTACAACCC，
[0040]45 型探針:TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ；
[0041]51 型上游引物:TCGGATGATGAGGATGAAAATG，
[0042]51 型下游引物:CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT，
[0043]51 型探針:TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ；
[0044]52 型上游引物:CTCCAAGACCTCCGCAGTGT，
[0045]52 型下游引物:TGTTGTCCCCGCAAAAGG，
[0046]52 型探針:CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ；
[0047]53 型上游引物:GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT，
[0048]53 型下游引物:TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
[0049]53 型探針:TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ；
[0050]56 型上游引物:TGTGCGITTTAGTAGGCTAGGC，
[0051]56 型下游引物:CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC，
[0052]56 型探針:CATAATAATAATGCACACGAGCACCTAITTG ；
[0053]58 型上游引物:CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG，
[0054]58 型下游引物:CCAACGCCTGACACAAATCAT，
[0055]58 型探針:TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ；
[0056]59 型上游引物:TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG，
[0057]59 型下游引物:TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG，
[0058]59 型探針:ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ；
[0059]66 型上游引物:GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT，
[0060]66 型下游引物:CGTTTTACATAGGTATCCGTTG，
[0061]66 型探針:CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG ；
[0062]68 型上游引物:AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG，
[0063]68 型下游引物:GCACGGTGGGCTTTGGT，
[0064]68 型探針:CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
[0065]在本發(fā)明中，我們把15種高危HPV型別(HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型)和所使用的內(nèi)標(biāo)一起簡(jiǎn)稱為16種型別。
[0066]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述試劑盒中共含8種PCR反應(yīng)液，且所述8種PCR反應(yīng)液中分別含有如下型別的引物探針序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和內(nèi)標(biāo)。
[0067]在一種具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒包括核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、酶混合液、HPV高危型定量參考品、HPV高危型陽性對(duì)照和HPV高危型陰性對(duì)照。
[0068]本發(fā)明還提供一種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括兩種或以上的PCR反應(yīng)液，其中有一種PCR反應(yīng)液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探針序列，另有一種PCR反應(yīng)液中包含內(nèi)標(biāo)的引物探針序列；
[0069]其中，用于16型、18型和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為，
[0070]16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG，
[0071]16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC，
[0072]16 型探針:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ；
[0073]18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG，
[0074]18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC，
[0075]18 型探針:AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ；
[0076]內(nèi)標(biāo)上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT，
[0077]內(nèi)標(biāo)下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG,
[0078]內(nèi)標(biāo)探針:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
[0079]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中共含任選的2~16種PCR反應(yīng)液，且在所述2~16種PCR反應(yīng)液中還共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型這13種高危HPV型的引物探針序列中的一種或多種，且每種PCR反應(yīng)液中含有上述共16種型別中任選的一種或兩種型別的引物探針序列；其中，用于這13種高危HPV型擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列如上所示。
[0080]優(yōu)選的，所述試劑盒中共含8種PCR反應(yīng)液，且所述8種PCR反應(yīng)液中分別含有如下型別的引物探針序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和內(nèi)標(biāo)。
[0081]本發(fā)明還提供一種核酸釋放劑在HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%。
【具體實(shí)施方式】
[0082]實(shí)施例1
[0083]本實(shí)施例提供一種能檢測(cè)15種高危型人乳頭狀瘤病毒并能準(zhǔn)確分型的檢測(cè)試劑盒，它至少由以下組分組成:
[0084]①核酸釋放劑:莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mmol/L(質(zhì)量/體積)，氯化鉀(此1)50~200臟01/1(質(zhì)量/體積)，十二烷基磺酸鈉(SDS)0.01%~2% (質(zhì)量/體積)，乙醇0.05 %~I % (體積/體積)；
[0085]②PC R反應(yīng)液:包含HPV16型和18型引物探針序列的第一種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV16型及18型；包含HPV39型和31型引物探針序列的第二種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV39型及31型；包含HPV33型和58型引物探針序列的第三種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV33型及58型；包含HPV45型和59型引物探針序列的第四種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV45型及59型；包含HPV51型和66型引物探針序列的第五種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV51型及66型；包含HPV52型和53型引物探針序列的第六種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV52型及53型；包含HPV56型和68型引物探針序列的第七種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV56型及68型；包含HPV35型和β -globin引物探針序列的第八種PCR反應(yīng)液，用于檢測(cè)HPV35型及內(nèi)標(biāo)。其中每種PCR反應(yīng)液均包括IOXPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，0.05mmol/L~0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，且八種PCR反應(yīng)液中相應(yīng)每種靶核苷酸引物探針序列的濃度均為0.1 μ mol/L~0.3 μ mol/L，八種PCR反應(yīng)液中總共的引物序列記為:HPV16-F與HPV16-R、HPV18-F與HPV18-R、HPV31-F 與 HPV31-R、HPV33-F 與 HPV33-R、HPV35-F 與 HPV35-R、HPV39-F 與 HPV39-R、HPV45-F 與 HPV45-R、HPV51-F 與 HPV51-R、HPV52_F 與 HPV52-R、HPV53_F 與 HPV53-R、HPV56_F與 HPV56-R、HPV58-F 與 HPV58-R、HPV59-F 與 HPV59-R、HPV66-F 與 HPV66-R、HPV68-F 與HPV68-R ;八種PCR反應(yīng)液中總共的探針序列記為:HPV16_P、HPV18-P、HPV31-P、HPV33-P、HPV35-P、HPV39-P、HPV45-P、HPV51-P、HPV52-P、HPV53-P、HPV56-P、HPV58-P、HPV59-P、HPV66-P、HPV68-P ;第八種PCR反應(yīng)液中還包括0.05 μ mol/L~0.2 μ mol/L的用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物IC-F與IC-R和0.05 μ mol/L~0.2 μ mol/L的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針I(yè)C-P。所述10XPCR反應(yīng)緩沖液 包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、20臟01/1氯化鎂溶液、500臟01/1氯化鉀溶液、0.2% (體積/體積)曲拉通溶液和10% (體積/體積)甲酰胺溶液；所述脫氧核糖核苷三磷酸為dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP ;所述引物探針的喊基序列見表1。
[0086]表1
[0087]
【權(quán)利要求】
1.一種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和兩種或以上的PCR反應(yīng)液,所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~I %;其中有一種PCR反應(yīng)液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探針序列，另有一種PCR反應(yīng)液中包含內(nèi)標(biāo)的引物探針序列； 其中，用于16型、18型和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為， . 16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG， .16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， . 16 型探針:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； . 18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， . 18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC, . 18 型探針:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ； 內(nèi)標(biāo)上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 內(nèi)標(biāo)下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG， 內(nèi)標(biāo)探針:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中共含任選的2~16種PCR反應(yīng)液，且在所述2~16種PCR反應(yīng)液中還共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、.51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型這13種高危HPV型的引物探針序列中的一種或多種，且每種PCR反應(yīng)液中含有上述共16種型別中任選的一種或兩種型別的引物探針序列； 其中，用于這13種高危HPV型擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為， . 31 型上游引物:AGCCAACAACACCACCACATC， . 31 型下游引物:GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG， .31 型探針:TCGCCCGCCGCACACCTTCA ； . 33 型上游引物:ACCGCCCAGCCCCTTAC, . 33 型下游引物:GTCCGCTGCTTGTTTGTGC， . 33 型探針:CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ； . 35 型上游引物:TAITTAGCAGCACAGAACTATCCACT， . 35 型下游引物:TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT， . 35 型探針:CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ； . 39 型上游引物:CCAGACGGGATGAACCACA， . 39 型下游引物:CACACCACGGACACACAAATC， . 39 型探針:AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ； . 45 型上游引物:TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC， . 45 型下游引物:AAAACCAGCCGTTACAACCC， . 45 型探針:TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ； . 51 型上游引物:TCGGATGATGAGGATGAAAATG， .51 型下游引物:CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT， . 51 型探針:TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ；.52 型上游引物:CTCCAAGACCTCCGCAGTGT， . 52 型下游引物:TGTTGTCCCCGCAAAAGG， . 52型探針:CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ； . 53型上游引物:GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT， .53 型下游引物:TAATGCACACGAGCACCTATTTG，
.53 型探針:TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ； . 56 型上游引物:TGTGCGITTTAGTAGGCTAGGC， . 56 型下游引物:CAATAATGGCTGCAITTCAAITTC， . 56 型探針:CATAATAATAATGCACACGAGCACCTAITTG ； .58 型上游引物:CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG， .58 型下游引物:CCAACGCCTGACACAAATCAT， .58型探針:TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ； . 59型上游引物 :TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG， .59 型下游引物:TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG， . 59 型探針:ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ； . 66 型上游引物:GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT， .66 型下游引物:CGTTTTACATAGGTATCCGTTG， .66 型探針:CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG ； . 68 型上游引物:AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG， . 68 型下游引物:GCACGGTGGGCTTTGGT， . 68 型探針:CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中共含8種PCR反應(yīng)液，且所述8種PCR反應(yīng)液中分別含有如下型別的引物探針序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和內(nèi)標(biāo)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、酶混合液、HPV高危型定量參考品、HPV高危型陽性對(duì)照和HPV高危型陰性對(duì)照。
5.一種HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括兩種或以上的PCR反應(yīng)液，其中有一種PCR反應(yīng)液中包含高危HPV16型和/或18型的引物探針序列，另有一種PCR反應(yīng)液中包含內(nèi)標(biāo)的引物探針序列； 其中，用于16型、18型和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列分別為， . 16 型上游引物:CACAGGAGCCACCCAGAAAG， . 16 型下游引物:GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， . 16 型探針:CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； . 18 型上游引物:TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， . 18 型下游引物:CTGGCTTCACACTTACAACACATAC, . 18 型探針:AATCATCAACAITTACCAGCCCGACG ； 內(nèi)標(biāo)上游引物:GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 內(nèi)標(biāo)下游引物:CCCATAACAGCATCAGGAGTG，內(nèi)標(biāo)探針:CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中共含任選的2~16種PCR反應(yīng)液，且在所述2~16種PCR反應(yīng)液中還共包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型這13種高危HPV型的引物探針序列中的一種或多種，且每種PCR反應(yīng)液中含有上述共16種型別中任選的一種或兩種型別的引物探針序列；其中，用于這13種高危HPV型擴(kuò)增和檢測(cè)的引物探針序列為如權(quán)利要求2所示的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒 ，其特征在于，所述試劑盒中共含8種PCR反應(yīng)液，且所述8種PCR反應(yīng)液中分別含有如下型別的引物探針序列:16型和18型，39型和31型，33型和58型，45型和59型，51型和66型，52型和53型，56型和68型，35型和內(nèi)標(biāo)。
8.—種核酸釋放劑在HPV高危型分型熒光PCR檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01 ~0.Smmol /I,,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104017906SQ201410298440
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】戴立忠, 劉佳, 李勃, 鄧中平 申請(qǐng)人:湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司