一種2-甲基-l-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心后得到含色氨酸合成酶的濕菌體；將上述濕菌體中加入轉(zhuǎn)化液，所述轉(zhuǎn)換液中包括：含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20～50℃，pH5～12條件下進行酶促反應(yīng)，等電點結(jié)晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。本發(fā)明采用含色氨酸合成酶的特定菌株，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有較高的催化速率和轉(zhuǎn)化率，L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達到98％以上，酶法合成反應(yīng)條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種2-甲基-L-色氨酸的轉(zhuǎn)化方法，尤其涉及的是一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2-甲基-L-色氨酸是一種非蛋白質(zhì)組成的氨基酸，L-2-甲基色氨酸是抗菌素硫鏈絲菌肽合成中重要中間體，中國發(fā)明專利:CN101914605，N-芴甲氧羰基-2-甲基色氨酸的合成方法，公開了含有L-2-甲基色氨酸寡肽化合物可以使親軀體細胞(somatotrope)釋放生長素，哺乳動物服用能誘導生長激素釋放的化合物之后，動物體內(nèi)生長素提高，使動物生長速度加快。2-甲基-L-色氨酸可用于醫(yī)藥領(lǐng)域和食品領(lǐng)域等，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]中國發(fā)明專利:CN101914605，N-芴甲氧羰基_2_甲基色氨酸的合成方法，報導了以2-甲基吲哚與福爾馬林溶液及二甲胺合成2-甲基蘆竹堿，再與乙酰氨基丙二酸二乙酯及硫酸二甲酯在強堿乙醇鈉作用下生成中間體雙酯，雙酯用氫氧化鈉溶液水解并在中性狀態(tài)下脫羧得到中間體單酯，單酯通過α-糜蛋白酶水解拆分，獲得D-N-乙酰-2-甲基色氨酸乙酯和L-N-乙酰-2-甲基色氨酸，然后用鹽酸水解分別得到D-2-甲基色氨酸和L-2-甲基色氨酸?！短K州大學學報(自然科學版)》，2003，1:91-93中公開了以丁烯-2-酮，乙酰氨基丙二酸二乙酯以及苯肼為原料合成了非天然的N-乙酰基-DL-2-甲基-色氨酸的技術(shù)。
[0004]目前，我國2-甲基-色氨酸生產(chǎn)主要來源于化學合成法，該方法反應(yīng)步驟多，操作難度大，生產(chǎn)成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而另一方面我國在氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中，會產(chǎn)生大量不能直接用于食品和醫(yī)藥方面的富含L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液，該混合氨基酸料液直接分離制備L-絲氨酸成本高、效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，提高反應(yīng)的催化速率和轉(zhuǎn)化率。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟:
[0007](I)將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心后得到含色氨酸合成酶的濕菌體；
[0008](2)將上述濕菌體中加入轉(zhuǎn)化液，所述轉(zhuǎn)換液中包括:含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20~50°C，pH 5~12條件下進行酶促反應(yīng)，等電點結(jié)晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。
[0009]所述步驟(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株選自大腸桿菌ATCC15489、銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢桿菌CGMCC NO: 1.1628中的一種。
[0010]所述步驟(1)中，培養(yǎng)基成分包括10~40g/L碳源物質(zhì)、5~35g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L 檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/LCoCl2,0.0OOlg/L MnC4H6O4.4H20，碳源物質(zhì)采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種，氮源物質(zhì)采用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種。
[0011]所述步驟(2)中，所述含L-絲氨酸的料液中L-絲氨酸的濃度為0.5~40.5g/L。
[0012]所述含L-絲氨酸的料液來源于毛發(fā)酸水解液或純L-絲氨酸液；毛發(fā)酸水解液中總氨基酸的重量百分比為5%~45%，其中L-絲氨酸在總氨基酸中的重量百分比為10%~90%。
[0013]所述步驟(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其濃度為0.001g/L~4.0g/L。
[0014]所述步驟⑵中，磷酸吡哆醛的濃度為0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的濃度為26.2 ~104.8g/L。
[0015]所述步驟(2)中，等電點結(jié)晶法的具體方法如下:
[0016]將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液3000~5000r/min離心10~20min,去除菌體細胞；加熱
轉(zhuǎn)化液，采用活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)至PH 5~6，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽濾，烘干得2-甲基-L-色氨酸精品。
[0017]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:本發(fā)明采用含色氨酸合成酶的特定菌株，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高效表達色氨酸合成酶，使酶法合成2-甲基-L-色氨酸有較高的催化速率和轉(zhuǎn)化率，其中L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達到98%以上； [0018]本發(fā)明采用含L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液為反應(yīng)原料，價格低廉，并充分利用了工業(yè)副產(chǎn)物，解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時也為大規(guī)模低成本生產(chǎn)2-甲基-L-色氨酸提供了更為豐富的原料，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益；
[0019]酶法合成2-甲基-L-色氨酸具有反應(yīng)條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0020]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0021]實施例1
[0022]本實施例包括以下步驟:
[0023](I)將1000mL大腸桿菌ATCC15489在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到15g濕菌體，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含21g的L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液、26.2g的2-甲基吲哚、0.2g/L的磷酸吡哆醛和0.005g/L的甲醇，pH8.0，37°C酶促反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為42.7g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98% ；
[0024](2)將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心10min,去除菌體細胞,加熱,活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)pH5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得39.5g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得35.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0025]本實施例的培養(yǎng)基成分包括40g/L碳源物質(zhì)、35g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質(zhì)采用葡萄糖和麥芽糖，氮源物質(zhì)采用牛肉膏和酵母膏。
[0026]實施例2[0027]本實施例包括以下步驟:
[0028](I)將1000mL銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到18g濕菌體，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含Ilg的L-絲氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為22.4g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98 % ；
[0029](2)將轉(zhuǎn)化液3000r/min離心20min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)pH5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得20.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得18.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0030]本實施例的培養(yǎng)基成分包括10g/L碳源物質(zhì)、35g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質(zhì)采用麥芽糖和果糖,氮源物質(zhì)采用酵母膏、蛋白胨和豆餅水解液。
[0031]實施例3
[0032]本實施例包括以下步驟:
[0033](I)將1000mL施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到濕菌體20g，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含21g的L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液、26.2g2-甲基吲哚、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L丙酮，pH8.0, 37°C酶促反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為42.9g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98.5% ;
[0034](2)將轉(zhuǎn)化液5000r/min離心10min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)PH5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得39.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得36.3g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0035]本實施例的培養(yǎng)基成分包括30g/L碳源物質(zhì)、20g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質(zhì)采用鹿糖和果糖,氮源物質(zhì)采用玉米楽;、蛋白胨和豆餅水解液。
[0036]實施例4
[0037]本實施例包括以下步驟:
[0038](I)將1000mL枯草芽孢桿菌CGMCC NO: 1.1628在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到20g濕菌體，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含Ilg的L-絲氨酸、13.1g 2-甲基吲哚、
0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L乙醇，pH8.0，37°C酶促反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為22.6g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為99 % ；
[0039](2)將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)pH5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得21.1g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得19.6g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.9 %。
[0040]本實施例的培養(yǎng)基成分包括30g/L碳源物質(zhì)、5g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質(zhì)采用葡萄糖,氮源物質(zhì)采用豆餅水解液。
[0041]實施例5
[0042]本實施例包括以下步驟:
[0043](I)將1000mL大腸桿菌ATCC15489在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到15g濕菌體，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含42g的L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液、52.4g 2-甲基吲哚、0.4g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L甲醇，pH8.0, 37°C酶促反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為85.4g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98% ；
[0044](2)將轉(zhuǎn)化液3000r/min離心20min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)pH 5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得78.4g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得76.5g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0045]本實施例的培養(yǎng)基成分包括25g/L碳源物質(zhì)、15g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20,碳源物質(zhì)采用麥芽糖、鹿糖和果糖,氮源物質(zhì)采用玉米楽;、蛋白胨和豆餅水解液。
[0046]實施例6
[0047]本實施例包括以下步驟:
[0048](I)將1000mL施氏假單胞菌CGMCC NO: 1.202在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心得到濕菌體20g，加入到500mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含Ilg的L-絲氨酸的毛發(fā)酸水解液、13.1g
2-甲基吲哚、0.lg/L磷酸吡哆醛和0.05g/L乙醚，pH8.0，37°C酶促反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中2-甲基-L-色氨酸為21.4g，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為98.5% ;
[0049](2)將轉(zhuǎn)化液5000r/min離心10min，去除菌體細胞，加熱，活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)PH5.5左右，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得19.9g 2-甲基-L-色氨酸粗品，質(zhì)量濃度為95%的乙醇洗滌，真空抽濾，烘干得17.7g 2-甲基-L-色氨酸精品，純度為99.8 %。
[0050]本實施例的培養(yǎng)基成分包括40g/L碳源物質(zhì)、20g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L檸檬酸、
3.0g/L 硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質(zhì)采用葡萄糖和果糖，氮源物質(zhì)采用牛肉膏和豆餅水解液。
【權(quán)利要求】
1.一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將具有色氨酸合成酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液離心后得到含色氨酸合成酶的濕菌體； (2)將上述濕菌體中加入轉(zhuǎn)化液，所述轉(zhuǎn)換液中包括:含L-絲氨酸的料液，磷酸吡哆醛和2-甲基吲哚，乙醚、甲醇、乙醇、丙酮中的一種；在20~50°C,pH 5~12條件下進行酶促反應(yīng)，等電點結(jié)晶法分離得到2-甲基-L-色氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，具有色氨酸合成酶活性的菌株選自大腸桿菌ATCC15489、銅綠假單胞菌CGMCC NO:1.1129、施氏假單胞菌 CGMCC NO: 1.202、枯草芽孢桿菌 CGMCC NO: 1.1628 中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，培養(yǎng)基成分包括10~40g/L碳源物質(zhì)、5~35g/L氮源物質(zhì)、2.5g/L朽1檬酸、3.0g/L硫酸銨、6.0g/L K2HPO4,2.0g/L MgS04、0.05g/L CaCl2,0.003g/L CoCl2,0.0OOlg/LMnC4H6O4.4H20，碳源物質(zhì)采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種，氮源物質(zhì)采用牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述含L-絲氨酸的料液中L-絲氨酸的濃度為0.5~40.5g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述含L-絲氨酸的料液 來源于毛發(fā)酸水解液或純L-絲氨酸液；毛發(fā)酸水解液中總氨基酸的重量百分比為5%~45%，其中L-絲氨酸在總氨基酸中的重量百分比為10%~90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述的乙醚、甲醇、乙醇或丙酮，其濃度為0.00^/1~4.(^/1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，磷酸吡哆醛的濃度為0.2~0.8g/L，2-甲基吲哚的濃度為26.2~104.8g/L0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種2-甲基-L-色氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，等電點結(jié)晶法的具體方法如下: 將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液3000~5000r/min離心10~20min，去除菌體細胞；加熱轉(zhuǎn)化液，采用活性碳脫色，抽濾，濾液調(diào)至pH 5~6，靜置析出沉淀，真空抽濾，烘干得2-甲基-L-色氨酸粗品，米用乙醇洗漆，真空抽濾，烘干得2-甲基-L-色氨酸精品。
【文檔編號】C12R1/19GK104017838SQ201410274056
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】徐禮生, 高貴珍, 卓馨, 曹穩(wěn)根, 趙亮, 袁維風, 吳超 申請人:宿州學院