鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能食品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能食品中的應(yīng)用，其中鹽制巴戟天多糖優(yōu)選通過(guò)以下方法制備獲得：以巴戟天為原料，經(jīng)含鹽制、沸水提取、去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的巴戟天多糖具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用，本發(fā)明中的鹽制巴戟天多糖可以通過(guò)抑制腫瘤新生血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)等多途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，表明其具有良好的輔助抑制前列腺癌腫瘤作用。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多糖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前 列腺癌功效的功能食品中的應(yīng)用。 鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的嚴(yán)重疾病，化學(xué)治療是應(yīng)用于惡性腫瘤全身治療 的主要方法之一，但大部分抗腫瘤化學(xué)藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也嚴(yán)重?fù)p傷了正常細(xì) 胞，因此尋找高效低毒的抗腫瘤藥物具有重要意義。而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，多糖就具有顯著 地抗腫瘤活性并且對(duì)人體的毒副作用相對(duì)較小，對(duì)多糖的生物活性研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成 為國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)一些多糖及其復(fù)合物對(duì)多種疾病，如免疫紊亂、癌 癥、糖尿病、高血壓、肝炎、血栓、肺炎、病毒等都具有顯著療效，并且參與細(xì)胞各種生命現(xiàn)象 的調(diào)節(jié)。大量藥理和臨床試驗(yàn)表明多糖類化合物是優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)劑，能增加巨噬細(xì)胞和 白細(xì)胞的吞噬功能、誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞壞死因子（TNF)和白細(xì)胞素，從而提高人體的免疫功能， 并且對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒副作用。
[0003] 巴戟天出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名雞腸風(fēng)、雞眼藤、三角藤。為茜草科巴戟天屬的植 物。生長(zhǎng)于山谷林下，分布于中國(guó)南方等地，主要功能為補(bǔ)腎助陽(yáng)；強(qiáng)筋壯骨；祛風(fēng)除濕。目 前尚未有人以巴戟天為原料獲得多糖，并用于輔助抑制前列腺癌的開(kāi)發(fā)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功 能食品中的應(yīng)用。
[0005] 其中所述的輔助抑制前列腺癌功效是指通過(guò)抑制前列腺癌腫瘤新生血管生成、免 疫抑制及抑制前列腺癌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)功效，調(diào)節(jié)前列腺癌腫瘤微環(huán)境，從而起到輔助抑 制前列腺癌功效。
[0006] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明中的巴戟天多糖優(yōu)選通過(guò)以下方法制備獲 得：所述的鹽制巴戟天多糖通過(guò)以下方法制備獲得：以巴戟天為原料，經(jīng)含鹽制、沸水提 取、去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的巴戟天多糖具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的作 用。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明所述的巴戟天多糖具體通過(guò)以下方法 制備獲得：所述的巴戟天多糖具體通過(guò)以下方法制備獲得：以巴戟天為原料，鹽制后，用沸 水多次提取，合并提取液，將提取液濃縮得濃縮液，在濃縮液中加入三氯乙酸水溶液進(jìn)行去 蛋白處理，去蛋白后將反應(yīng)液進(jìn)行中和、扎袋透析處理，將透析袋內(nèi)反應(yīng)液進(jìn)行濃縮、離心 處理，取上清液加入乙醇進(jìn)行醇沉、干燥處理，即得巴戟天多糖。
[0008] 本發(fā)明在巴戟天多糖的制備過(guò)程中，各工序的具體參數(shù)優(yōu)選如下： 鹽制時(shí)，在巴戟天原料中加入質(zhì)量百分含量為20%的鹽水浸泡4(Γ60分鐘后，再調(diào)節(jié)壓 力為0. 1(Γ〇. 12 MPa蒸制1~2 h，對(duì)巴戟天原料進(jìn)行鹽制。
[0009] 鹽制巴戟天可以增加有效成分多糖含量。
[0010] 沸水提取時(shí)，提取次數(shù)為1飛次，每次提取時(shí)沸水的用量為巴戟天總質(zhì)量的5~20 倍，每次提取時(shí)間為1.5~5 h。
[0011] 沸水提取時(shí)，沸水的用量?jī)?yōu)選為巴戟天總質(zhì)量的5~20倍，提取次數(shù)較佳為3次， 其中第一次提取時(shí)，沸水的用量?jī)?yōu)選為原料巴戟天總質(zhì)量的ΚΓ20倍，提取2~5 h;第二次 提取時(shí)，沸水的用量?jī)?yōu)選為原料巴戟天總質(zhì)量的ΚΓ20倍，提取1.5?5h;第三次提取時(shí)， 沸水的用量?jī)?yōu)選為原料巴戟天總質(zhì)量的ΚΓ20倍，提取1.5~ 5 h。
[0012] 將提取液優(yōu)選濃縮至原提取液總體積的約1/10得濃縮液。
[0013] 本發(fā)明所述的三氯乙酸水溶液的質(zhì)量百分含量?jī)?yōu)選為35%，去蛋白處理時(shí)間優(yōu)選 為：Γ6 h，三氯乙酸水溶液的體積優(yōu)選與濃縮液的體積相同。
[0014] 中和處理時(shí)可以采用質(zhì)量百分含量為10%的氫氧化鈉水溶液。
[0015] 扎袋透析處理時(shí)優(yōu)選采用截留分子量3500Da的透析袋進(jìn)行透析處理。
[0016] 乙醇進(jìn)行醇沉處理時(shí)優(yōu)選采用體積百分含量?jī)?yōu)選為70?95%的乙醇水溶液。
[0017] 濃縮可以采用多種現(xiàn)有技術(shù)中的濃縮方式，其中以真空濃縮最佳。真空濃縮時(shí)溫 度優(yōu)選為40°C。
[0018] 本發(fā)明中的巴戟天多糖，可以直接口服，也可以制成藥劑學(xué)上所說(shuō)的多種劑型，如 膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等，食用后具有輔助抑制前列腺癌腫瘤的功效。
[0019] 因此，本發(fā)明所述功能食品的劑型優(yōu)選為膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1) 本發(fā)明中的巴戟天多糖，其純度和活性高，可以通過(guò)抑制腫瘤新生血管生成、免疫 抑制及抑制前列腺癌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)等多途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，其具有良好的輔助抑制前 列腺癌腫瘤作用； (2) 本發(fā)明中的巴戟天多糖的制備方法，工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)，成本 低； (3) 本發(fā)明中的巴戟天多糖，可以用于制備具有輔助抑制前列腺癌腫瘤功效的功能食 品。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例4中巴戟天多糖可抑制BMP2誘導(dǎo)的帶有BRE報(bào)告基因的熒 光素酶的活性； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例5中巴戟天多糖可抑制TGF β誘導(dǎo)的帶有SMAD2/3/4報(bào)告基因活 性； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例6中巴戟天多糖可抑制帶有NF- κ Β報(bào)告基因的熒光素酶的活性； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例7中巴戟天多糖可抑制前列腺癌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0023] 以下實(shí)施例中采用的各原料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品。
[0024] 實(shí)施例1 本實(shí)施例中的巴戟天多糖，通過(guò)以下方法制備獲得：取巴戟天原料，在質(zhì)量百分含量為 20. 0 %的鹽水濃度中浸泡45 min后，在0. 10 MPa壓力下，蒸制1. 5 h，進(jìn)行鹽制，鹽 制后巴戟天多糖，采用沸水提取，第一次提取時(shí)，水的用量為原料總質(zhì)量的20倍，煮沸5 h ; 第二次提取時(shí)，水的用量為原料總質(zhì)量的20倍，煮沸3 h ;第三次提取時(shí)，水的用量為原料 總質(zhì)量的10倍，煮沸2 h過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮至原來(lái)體積的大約1/10。將濃縮液進(jìn) 行三氯乙酸除蛋白處理，加入同體積（下同）的30%三氯乙酸（質(zhì)量百分比），處理時(shí)間為4 h后，用10% NaOH (質(zhì)量百分比）中和，下同，中和后將反應(yīng)液置于透析袋中扎袋透析，透析 時(shí)透析袋的截留分子量通常約為3500Da，下同，然后將透析袋內(nèi)液濃縮，離心，取上清液加 入:Γ4倍體積的85%乙醇水溶液(體積百分含量）進(jìn)行醇沉淀處理，取沉淀物經(jīng)含真空干燥 (約40°C，下同）處理得巴戟天多糖組分。
[0025] 實(shí)施例2 本實(shí)施例中的巴戟天多糖，通過(guò)以下方法制備獲得：取巴戟天原料，采用質(zhì)量百分含量 為20. 0 %的鹽水濃度浸泡60 min后，0. 11 MPa壓力下，蒸制1. 5 h，進(jìn)行鹽制，鹽制 后巴戟天多糖，采用沸水提取，第一次提取時(shí)，水的用量為巴戟天原料總質(zhì)量的15倍，煮沸 5 h ;第二次提取時(shí)，水的用量為巴戟天原料總質(zhì)量的15倍，煮沸3 h;第三次提取時(shí)，水的 用量為巴戟天原料總質(zhì)量的10倍，煮沸3 h過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮。將濃縮液進(jìn)行三氯 乙酸除蛋白處理，加入同體積的25%三氯乙酸（質(zhì)量百分比），處理時(shí)間為3 h后，用10% NaOH (質(zhì)量百分比)中和，中和后將反應(yīng)液置于透析袋中扎袋透析，然后將透析袋內(nèi)液濃縮， 離心，取上清液加入:Γ4倍體積的70%乙醇水溶液(體積百分含量)進(jìn)行醇沉淀處理，取沉淀 物經(jīng)含真空干燥處理得巴戟天多糖組分。
[0026] 實(shí)施例3 本實(shí)施例中的巴戟天多糖，通過(guò)以下方法制備獲得：取巴戟天原料，采用質(zhì)量百分含量 為20. 0 %的鹽水濃度中浸泡50 min后，在0. 12 MPa壓力下，蒸制1. 5 h，進(jìn)行鹽制。 鹽制后巴戟天多糖，第一次提取時(shí)，水的用量為巴戟天原料總質(zhì)量的10倍，煮沸3 h ;第二 次提取時(shí)，水的用量為巴戟天原料總質(zhì)量的20倍，煮沸3 h;第三次提取時(shí)，水的用量為巴 戟天原料總質(zhì)量的10倍，煮沸5 h過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮，將濃縮液進(jìn)行三氯乙酸除蛋 白處理，加入同體積的15%三氯乙酸（質(zhì)量百分比），處理時(shí)間為5 h后，用10% NaOH (質(zhì) 量百分比）中和，中和后將反應(yīng)液置于透析袋中扎袋透析，然后將透析袋內(nèi)液濃縮，離心，取 上清液加入:Γ4倍體積的95%乙醇水溶液(體積百分含量）進(jìn)行醇沉淀處理，取沉淀物經(jīng)含 真空干燥處理得巴戟天多糖組分。
[0027] 實(shí)施例4巴戟天多糖可抑制BMP2誘導(dǎo)的帶有BRE報(bào)告基因的熒光素酶的活性 C2C12細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，C2C12- pGFl-BRE細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究 所丁侃實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保存于液氮中。C2C12- pGFl-BRE細(xì)胞用含10 % Gibco胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng)，以1 X 104細(xì)胞/孔的密度接種 于96孔板內(nèi)，每孔100 yL。貼壁24 h后吸去60 yL培養(yǎng)基，加配置好相應(yīng)濃度的樣品 50 mL(實(shí)施例1中制備的巴戟天多糖），終濃度分別為0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL， 10 ULBMP2調(diào)整至終濃度200 ng/mL。同時(shí)設(shè)空白組和BMP2組對(duì)照。給藥16 h后吸去培 養(yǎng)基，加20 μ L R印orter Lysis IX Buffer，將溶解的細(xì)胞裂解液20 μ L轉(zhuǎn)移至白板，力口 入40 yL luciferase底物，于3分鐘內(nèi)讀板，讀取RLU值。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（.Z ±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本?檢驗(yàn)，多組 間比較采用單因素方差分析。
[0028] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，巴戟天多糖在0. 5 mg/mL低濃度下具有抑制ΒΜΡ2誘導(dǎo)的帶 有BRE報(bào)告基因的熒光素酶的活性，且該活性具有劑量依賴性。已知腫瘤新生血管生成在 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而BMP2信號(hào)通路在腫瘤新生血管生成過(guò)程中起關(guān) 鍵作用。該多糖可顯著抑制BMP2信號(hào)通路，表明該多糖具有潛在的可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功 效。
[0029] 實(shí)施例5巴戟天多糖可抑制TGF0誘導(dǎo)的帶有SMAD2/3/4報(bào)告基因活性 HEK293T細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，HEK293T-pGFl-SMAD2/3/4細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院 上海藥物研究所丁侃實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保存于液氮中。HEK293T-pGFl-SMAD2/3/4細(xì)胞用含10% Gibco胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C飽和濕度、含5% 0)2的恒溫箱中培養(yǎng)，以2X104 細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 yL。貼壁24 h后吸去60 yL培養(yǎng)基，加配置 好相應(yīng)濃度的樣品50 mL (來(lái)自實(shí)施例1中的樣品），終濃度分別為0. 5 mg/mL、0. 1 mg/mL、 0.02 mg/mL，10 yLTGFM調(diào)整至終濃度50 ng/mL。同時(shí)設(shè)空白組和TGFM組對(duì)照。給 藥16hr后吸去培養(yǎng)基，加20 μ LR印orter Lysis IX Buffer，將溶解的細(xì)胞裂解液20 μ L 轉(zhuǎn)移至白板，加入40 yL luciferase底物，于3分鐘內(nèi)讀板，讀取RLU值。采用SPSS統(tǒng)計(jì) 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（.Z ±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 ?檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。
[0030] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，巴戟天多糖在0. 5mg/mL低濃度下具有抑制TGFP誘導(dǎo)的帶 有SMAD2/3/4信號(hào)通路，且具有劑量依賴性。已知腫瘤新生血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò) 程中起著關(guān)鍵作用，而TGFi3誘導(dǎo)的SMAD2/3/4信號(hào)通路在腫瘤新生血管生成過(guò)程中起關(guān) 鍵作用。該多糖可顯著抑制該信號(hào)通路，表明該多糖具有潛在的可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功效。
[0031] 實(shí)施例6巴戟天多糖能抑制帶有NF- K B報(bào)告基因的熒光素酶的活性 THP-1細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，THP-l/pGFl-NF-κΒ細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海藥 物研究所丁侃實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保存于液氮中。THP-l/pGFl-NF-κΒ細(xì)胞用含10%胎牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于37 °C飽和濕度、含5% 0)2的恒溫箱中培養(yǎng)，以5X104細(xì)胞/ 孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔50 yL容積。加入受試樣品50 yL(實(shí)施例1中的樣品)， 終濃度分別為0.5 mg/mL、0· L mg/mL、0.02 mg/mL，同時(shí)設(shè)立空白組和LPS對(duì)照組。加入 LPS溶液10 μ L，終濃度為1 μ g/mL，置于37°C飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。 培養(yǎng)過(guò)夜后，每空加入100 yL Bright-Glo? Luciferase Assay System底物，于酶標(biāo)儀讀 板，讀取RLU值。

【權(quán)利要求】
1. 鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能食品中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：所述的輔助抑制前列腺癌功效是指通過(guò)抑制前列腺癌腫瘤新生 血管生成、免疫抑制及抑制前列腺癌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)功效，調(diào)節(jié)前列腺癌腫瘤微環(huán)境，從而 起到輔助抑制前列腺癌功效。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：所述的鹽制巴戟天多糖通過(guò)以下方法制備獲得：以巴戟天為原 料，經(jīng)含鹽制、沸水提取、去蛋白、透析和乙醇處理工序制備獲得，所述的巴戟天多糖具有調(diào) 節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：所述的巴戟天多糖具體通過(guò)以下方法制備獲得：以巴戟天為原 料，鹽制后，用沸水多次提取，合并提取液，將提取液濃縮得濃縮液，在濃縮液中加入三氯乙 酸水溶液進(jìn)行去蛋白處理，去蛋白后將反應(yīng)液進(jìn)行中和、扎袋透析處理，將透析袋內(nèi)反應(yīng)液 進(jìn)行濃縮、離心處理，取上清液加入乙醇進(jìn)行醇沉、干燥處理，即得巴戟天多糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：鹽制時(shí)，在巴戟天原料中加入質(zhì)量百分含量為20%的鹽水浸泡 4(Γ60分鐘后，再調(diào)節(jié)壓力為0. 1(Γ〇. 12 MPa蒸制廣2 h，對(duì)巴戟天原料進(jìn)行鹽制。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：沸水提取時(shí)，提取次數(shù)為1飛次，每次提取時(shí)沸水的用量為巴戟 天總質(zhì)量的5~20倍，每次提取時(shí)間為1. 5~5 h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：去蛋白時(shí)采用三氯乙酸水溶液，所述三氯乙酸水溶液的質(zhì)量百分 含量為35%，處理時(shí)間為：Γ6 h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：乙醇處理時(shí)采用體積百分含量為7(Γ95%的乙醇水溶液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：透析時(shí)透析袋的截留分子量為3500Da。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽制巴戟天多糖在制備具有輔助抑制前列腺癌功效的功能 食品中的應(yīng)用，其特征是：所述功能食品的劑型為膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液。
【文檔編號(hào)】A23L1/09GK104116026SQ201410273769
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】胡明華, 梁明, 王培培, 馬方勵(lì) 申請(qǐng)人:無(wú)限極（中國(guó)）有限公司