檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開用于檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒。本發(fā)明的檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒內(nèi)包括有：序列表中引物核苷酸序列SEQID№1和SEQID№2，探針核苷酸序列SEQID№3，BCO2基因CC基因型核酸序列SEQID№4和BCO2基因TT基因型核酸序列SEQID№5。本發(fā)明與已有檢測BCO2基因突變位點方法相比，具有分型鑒定方法準(zhǔn)確、快速、簡便、成本低、實用，具有很好的實用價值和市場價值。
【專利說明】檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獸醫(yī)用遺傳疾病檢測試劑盒，特別是一種可用于檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]消費者單純憑借視覺就可對肉類外在的脂肪顏色品質(zhì)做出直觀的評價，因此脂肪顏色是肉質(zhì)的主要感官指標(biāo)，也是人們選擇肉品首要和主要的依據(jù)。美國、加拿大、澳大利亞和日本等國已將牛肉的脂肪顏色作為其胴體分級系統(tǒng)(Carcass grading systems)中的重要組成部分。澳大利亞肉類品質(zhì)規(guī)格管理局(AUS-MEAT)將黃脂的黃色程度分為十個等級，O為“白色”，9為“特別黃”；規(guī)定黃脂的程度由經(jīng)過訓(xùn)練的評價師比對AUS-MEAT標(biāo)準(zhǔn)顏色芯片(Standard colour chips)判定。愛爾蘭等一些歐洲國家卻將黃脂的黃色程度分為五個等級，I為“非常白”，5為“特別黃”。家畜屠宰后有些胴體的脂肪組織呈淡黃色或黃色的現(xiàn)象，稱為黃脂。類似黃脂的現(xiàn)象在牛、馬、豬、綿羊、狐貍、水貂、貓、鼬鼠、雞和兔等動物中都有報道[梅步俊，李亞珍，吉日嘎拉，汪長壽，馬惠茹.反芻動物黃脂研究進展.草食家畜，2013，(04): 1-5.]。加拿大1995-1996年牛肉品質(zhì)調(diào)查中，4%胴體存在黃脂現(xiàn)象。墨西哥的研究報道牛肉的黃脂發(fā)生率為12.9%[ M6ndez RD, Meza CO, BerruecosJM, Garces P, Delgado EJ, Rubio MS.A survey of beef carcass quality and quantityattributes in Mexic0.Anim Sci, 2009, 87(11): 3782-3790.]。劉曉牧等在山東省部分屠宰企業(yè)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)高檔牛肉黃脂檢出率也為4%左右，每公斤高檔牛肉中含有黃色脂肪的肉價格比白色脂肪低40元左右[劉曉牧，吳乃科，宋恩亮，等.牛肉黃脂研究進展.中國牛業(yè)科學(xué)，2006，32(2):31-33.]。在國內(nèi)綿羊中，盧振鴻、吳心華、孫淑萍、韓合國、張建華等在寧夏靈武市狼皮梁子鄉(xiāng)、白土崗子鄉(xiāng)、鹽池縣王樂井鄉(xiāng)、內(nèi)蒙古前旗、遼寧沈陽、山西大同等地出現(xiàn)羊育肥期結(jié)束屠宰時發(fā)現(xiàn)脂肪變成黃色的現(xiàn)象，不能銷售，發(fā)病率達10%[劉寶山，姚龍泉，魏振波，吳波.育肥羊謹(jǐn)防黃脂病.畜牧與獸醫(yī)，2011，(02): 107-108.盧振鴻.育肥羊黃脂癥的病因分析及防治措施.2010中國羊業(yè)進展，2010:369-370.孫淑萍，陶占軍，盧振鴻，黃麗紅.育肥羊黃脂癥的病因分析及防治措施.當(dāng)代畜牧，2010，(03):24-25.吳心華，趙洪喜，陳紹淑，李愛華，謝琴，扈登強，余四九.育肥羊黃脂癥的診治.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，(02):94.韓合國.育肥羊黃脂癥的調(diào)查分析與防治.中國動物檢疫，2013，(10):49-50.張建華.育肥綿羊黃脂病的病例報告及預(yù)防措施.當(dāng)代畜牧，2012，(07):32-33.]。
[0003]綿羊黃脂病的研究始于20世紀(jì)40年代，1934年Castle首次報道了冰島綿羊群體中的黃脂現(xiàn)象[Castle, ff.E.Yellow fat in sheep.Journal of Heredity ,1934,25:246-247.]。通過對綿羊黃脂病的研究首次發(fā)現(xiàn)黃脂中至少包含三種黃色素:黃體素，葉黃素5、6環(huán)氧化物和葉黃呋喃素，綿羊黃脂遺傳病主要是由于類胡蘿卜素在脂肪組織中過量的沉積所造成。[A.H.Kirton, Brenda Crane, D.J.Paterson N.T.Clare.Yellow fat in lambs caused by carotenoid pigmentation.New Zealand Journal ofAgricultural Research, 1975，18(3):267-272.]。很多因素都會影響脂肪顏色，包括飼料、營養(yǎng)、環(huán)境、飼養(yǎng)管理、品種、性別、年齡，很多研究表明綿羊脂肪的黃色程度也是由遺傳因素控制的。通過分析33只公羊的半同胞后裔數(shù)據(jù)，估計出的綿羊黃脂肉的遺傳力為0.18[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff., Breines, D.: The inheritance and incidenceof yellow fat in Norwegian sheep Acta Agriculturae Scandinavica 1985, 35:389-397.Gedde-Dahl Tff.Reduction of the yellow fat incidence by different breeding plansfor sheep.Nord Vet Med.1972, 24(12):620-30.F.Hill.Xanthophyll pigmentation insheep fat.Nature.1962,194:865-6.]。進一步表明:綿羊黃脂遺傳病其特征是胭體脂肪呈黃色，由一對隱性純合子所控制[Baker, R.L., Steine, T., Vabeno, A.ff.Breines, D.The inheritence and incidence of yellow fat in Norweigian sheep.Acta AgriculturaeScandinavica.1985, (35):389-397.馬衛(wèi)東.綿羊的先天性缺陷.國外畜牧學(xué)(草食家畜)，1991，06:31-33.]。最近研究表明，在綿羊脂肪組織中，由β —胡蘿卜素氧化合成為維生素A的關(guān)鍵非對稱裂解酶-BC02酶基因的突變位點(c.196C>T)引起蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，使得BC02酶由原來的575個氨基酸變?yōu)?5個氨基酸，從而引起B(yǎng)C02酶功能的喪失，使得β —胡蘿卜素的在脂肪組織的沉積引進黃脂遺傳病?；键S脂遺傳病的羊只均攜帶BC02 c.196突變純合基因型ΤΤ，部分?jǐn)y帶BC02 c.196野生/突變雜合基因型CT，健康羊只均攜帶 BC02 c.196 野生純合基因型 CC [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in thebeta-carotene oxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation ofcarotenoids in adipose tissue in sheep (Ovisaries).BMC Genet.2010，11:10-15.]。因此我們可應(yīng)用遺傳檢測手段對BC02酶基因的突變(c.196C>T)進行基因分型，剔除攜帶突變純合基因型TT和突變雜合基因型CT，從而降低綿羊黃脂遺傳病的發(fā)病率。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中對BC02酶基因的突變位點(c.196C>T)進行基因分型主要技術(shù)為PCR-RFLP 和 Mass ARRAY [Vage DI, Boman IA.A nonsense mutation in the beta-caroteneoxygenase 2 (BC02) gene is tightly associated with accumulation of carotenoids inadipose tissue in sheep (Ovis aries).BMC Genet.2010，11:10-15.],現(xiàn)有技術(shù)中 BC02 酶基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定方法在PCR擴增后不僅需要進行一輪延伸反應(yīng)或進行限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等技術(shù)難度大、重復(fù)性差的技術(shù)環(huán)節(jié)，而且還需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)等大中型設(shè)備的依賴，因此每一基因SNP檢測成本很高，因此并不適合于在我國畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用，難以廣泛的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種中可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，可用于檢測綿羊是否攜帶黃脂遺傳病基因的試劑盒及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒內(nèi)包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2，探針核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
[0007]為方便使用，本發(fā)明的試劑盒內(nèi)還有分別放置的PCR緩沖液、d NTP混合液、TaqDNA聚合酶，以及IXLCGreen PLUS+飽和熒光染料。[0008]本發(fā)明試劑盒的使用方法是在待檢羊DNA中加入所述試劑盒中的引物核苷酸序列和探針核苷酸序列，以及PCR緩沖液、d NTP混合液、Taq DNA聚合酶、LCGreen PLUS+飽和熒光染料，再進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線分析儀中進行熔解曲線分析，得到熔解曲線中的T、C峰分布情況，根據(jù)熔解曲線中的T、C峰可預(yù)測待檢羊只是否攜帶綿羊黃脂遺傳病基因情況。
[0009]本發(fā)明試劑盒的最佳使用方法是:
在進行PCR擴增時，其擴增條件為-M0C 5分鐘，94°C 45秒，60.(TC 30秒，720C 20秒，72 0C 10分鐘，共進行50個循環(huán)；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進行2個95 °C 2分鐘，25°C 30秒的變性和復(fù)性的循環(huán)；
所得PCR產(chǎn)物在高分辨率熔解曲線分析儀中進行熔解曲線分析時將PCR產(chǎn)物以0.30C/秒的速度從40°C升溫到90°C過程中，獲得樣品的熔解曲線，依據(jù)熔解曲線獲得待測羊只BC02基因突變位點(c.196C>T)的基因型。
[0010]本發(fā)明是利用HRM (High Resolution Melt)技術(shù)進行檢測。HRM中文譯為“高分辨率熔解”是近幾年來在國外興起的最新的SNP及突變研究工具。HRM分析技術(shù)是2002年由猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)，最初應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)(Single NucleotidePolymorphism, SNP)檢測分析的一項新技術(shù)。它是在PCR結(jié)束后，根據(jù)不同堿基序列構(gòu)成核苷酸熔解溫度不同這一物理性質(zhì)，在同一容器中直接進行高分辨率熔解，利用飽和染料監(jiān)控核苷酸的熔解過程，得到特征性熔解曲線，再根據(jù)熔解曲線的形態(tài)變化來判斷核苷酸性質(zhì)的差異。目前，HRM的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)擴展到突變掃描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等諸多方面，近年來已成為生命科學(xué)研究中的熱點技術(shù)。
[0011]本發(fā)明即是一種利用高分辨率熔解曲線分析儀對BC02基因突變位點(c.196C>T)進行分型鑒定的快速、簡便、準(zhǔn)確的新手段。本發(fā)明改進了現(xiàn)有技術(shù)中BC02基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定中的缺點。在本發(fā)明的BC02基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定過程中，實驗樣本基因組DNA應(yīng)用本發(fā)明中試劑盒中的特異引物和探針進行擴增后，可直接應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析儀進行基因分型，而無需現(xiàn)有技術(shù)中BC02基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定方法在PCR擴增后還需要進行一輪延伸反應(yīng)或限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染等技術(shù)難度大、重復(fù)性差的技術(shù)環(huán)節(jié)，從而擺脫了對電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)等大中型設(shè)備的依賴，使BC02基因突變位點(c.196C>T)分型簡便易操作，并且可在一個小時內(nèi)完成1000個樣品的基因分型，因此應(yīng)用本發(fā)明進行BC02基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定降低了每一基因鑒定的成本，提高了檢測速度。總之，本發(fā)明較上述已有BC02基因突變位點(c.196C>T)分型鑒定方法準(zhǔn)確、快速、簡便、成本低、實用，具有很好的實用價值和市場價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1分別為實測的.pMD19-T BC02 (CC)、pMD19_T BC02 (TT)兩個載體基因的部分序列。
[0013] 圖2為待檢樣品PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線，其中:樣品I的BC02基因突變位點(c.196C>T)的基因型為野生純合基因型CC ;樣品2的BC02基因突變位點(c.196C>T)的基因型為突變純合基因型TT ;樣品3的BC02基因突變位點(c.196C>T)的基因型為野生/突變雜合基因型CT。
【具體實施方式】
[0014]以下為本發(fā)明的【具體實施方式】:
BC02基因克隆標(biāo)準(zhǔn)品的制備及BC02基因突變位點(c.196C>T)基因分型檢測(I).以下表1所列的本發(fā)明所使用的引物基因序列和探針序列均由上海生工生物工程科技發(fā)展有限公司合成。
【權(quán)利要求】
1.檢測攜帶綿羊黃脂遺傳病基因的試劑盒，其特征是試劑盒內(nèi)包括有:序列表中引物核苷酸序列SEQ ID Na I和SEQID Na 2，探針核苷酸序列SEQ ID Na 3 , BC02基因CC基因型核酸序列SEQ ID Na 4和BC02基因TT基因型核酸序列SEQ ID Ns 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒內(nèi)還有分別放置的PCR緩沖液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶，以 及IXLCGreen PLUS+飽和熒光染料。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993094SQ201410245526
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】岳耀敬, 郭婷婷, 秦哲, 楊博輝, 劉建斌, 郭健, 牛春娥, 孫曉萍, 馮瑞林 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所