一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，該方法包括以下步驟：⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌細(xì)胞；⑵制備磁性殼聚糖微球；⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌細(xì)胞：將磁性殼聚糖微球用鹽酸溶液充分溶脹，再加入NaOH，得到磁性殼聚糖溶液；然后將枯草芽孢桿菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌細(xì)胞加入到磁性殼聚糖溶液中振蕩吸附，加入戊二醛溶液再振蕩交聯(lián)，最后得到固定化的枯草芽孢桿菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌細(xì)胞；⑷制備香蘭素：a.制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；b.制備香蘭素轉(zhuǎn)化液；c.固定化的枯草芽孢桿菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）菌細(xì)胞的回收；d.分離香蘭素；e.制備香蘭素粗品。本發(fā)明低成本、高轉(zhuǎn)化率，且操作簡便，易于實施。
【專利說明】一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種香蘭素的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]香蘭素(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)，分子式為C8H8O3，又名香草醛、香草素、香蘭醛或香茅醛，是香子蘭豆莢中的一種主要成分，通常作為香料添加劑，天然藥物和醫(yī)藥中間體，還可作為輪滑油消泡劑、電鍍光亮劑、印制線路板生產(chǎn)導(dǎo)電劑、橡膠的除臭劑和除草劑使用。
[0003]微生物法合成香蘭素方法具有安全、低污染、生產(chǎn)清潔、副產(chǎn)物無污染等優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注。然而，香蘭素的生物轉(zhuǎn)化過程中，物料的不斷進(jìn)入和排出，極易使微生物隨轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的排出而流失，浪費了資源降低了轉(zhuǎn)化效率。因此，采用載體使微生物細(xì)胞固定化，可防止其微生物細(xì)胞的流失，降低微生物培養(yǎng)成本，極大地提高轉(zhuǎn)化效率。
[0004]磁性殼聚糖微球具有磁性粒子和生物高分子材料的雙重特性，是一種性能優(yōu)良的固定化材料，它不僅可以在外加磁場的作用下快速、簡單地分離，而且還具有與生物活性物質(zhì)反應(yīng)的特殊功能基團(tuán)。將微生物菌細(xì)胞固定于磁性殼聚糖微球，使得細(xì)胞固定于載體材料，可有效提高香蘭素轉(zhuǎn)化效率，同時固定化材料可重復(fù)回收、利用，進(jìn)一步節(jié)省香蘭素生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種低成本、高轉(zhuǎn)化率的磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)
化生產(chǎn)香蘭素的方法。
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，包括以下步驟:
⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
①制備營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基: 將5~15g蛋白胨、2~IOg牛肉提取物、2~15g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得pH值為5.(T9.0的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基；
②將一環(huán)生長良好的枯草芽孢桿菌B7-S{Bacillus subtilis B7-S)斜面培養(yǎng)物按1-20%的接種量接種至含有5(T200mL所述營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在2(T40°C的條件下以10(T500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12~36h，即得枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液；
③將所述枯草芽抱桿菌B7-S(.Bacillus subtilis B7-S)菌液以8000~12000r/min的速率離心15飛Omin，分別得到上清液A和沉淀物A，該沉淀物A用5~20mL且pH=6.8的
0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮后，再以800(Tl2000r/min的速率離心5~15min，分別得到上清液B和沉淀物B，該沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮至菌懸浮液OD6tltlnm為0.4~0.8時，即得枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞；
⑵制備磁性殼聚糖微球:
I將納米Fe3O4微球與質(zhì)量濃度為f 5%的殼聚糖溶液按2mg: lmL~8mg =ImL的比例混合后，在3(T50°C條件下進(jìn)行超聲分散，r3h后得到Fe3O4的殼聚糖溶液；
II在三角瓶中按5 mL:1 mL~20 mL:1 mL的比例加入液體石蠟和司盤80，在2(T60°C下磁力攪拌混合均勻，然后逐滴加入所述Fe3O4的殼聚糖溶液，并在2(T60°C下磁力攪拌IOlOmin后加入5~20mL體積濃度為2~10%的戊二醛溶液，反應(yīng)0.5~2h，再加入0.lmol/LNaOH，得到pH值為7.(Til.0的混合液；
III將所述混合液升溫至4(T80°C，并繼續(xù)反應(yīng)f3h，得到反應(yīng)液，該反應(yīng)液經(jīng) 0.03、.0SMPa減壓過濾后，即得磁性殼聚糖微球粗品；
IV所述磁性殼聚糖微球粗品依次用異丙醇、丙酮、乙醇、去離子水清洗后，在4(T80°C下真空干燥至恒重，即得磁性殼聚糖微球，并置于4°C冰箱內(nèi)保存；
⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
將所述磁性殼聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的鹽酸溶液充分溶脹5~15h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值為4.0~10.0的磁性殼聚糖溶液；然后，將所述枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞加入到所述磁性殼聚糖溶液中，在2(T50°C以10(T500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附0.5~2h后，加入體積濃度為1%~4%的戊二醛溶液，再在20~50°C以100~500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩交聯(lián)0.5~2h,最后用磁鐵收集磁性固定化細(xì)胞,該磁性固定化細(xì)胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽抱桿菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞；
⑷制備香蘭素: a制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:
將0.2~Ig阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~IOg酵母浸出粉、2~15g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，加入5mol/L NaOH溶液，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min，即得pH值為6.0-10.0的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；b制備香蘭素轉(zhuǎn)化液:
將所述固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞按f 20%的接種量接種至含有5(T200mL的所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在2(T50°C的條件下以10(T500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)2(T40h，即得香蘭素轉(zhuǎn)化液；c固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞的回收:
將所述香蘭素轉(zhuǎn)化液以100(T5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5~30min，得到沉淀物C和上清液C，該沉淀物C即為固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞；d分離香蘭素:
將所述上清液C以800(Tl2000r/min的轉(zhuǎn)速離心l(T60min,即得香蘭素粗沉淀物；
e制備香蘭素粗品:
將所述香蘭素粗沉淀物在溫度為4(T80°C、壓力為0.05、.1OMPa的條件下真空干燥4(T100h，得到干燥的沉淀物，該干燥的沉淀物經(jīng)研磨、過100-400目篩后，即得香蘭素粗
品O
[0007]所述步驟②中的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7_S)其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美國Genbank的訪問號為JQ086379 ;菌株全基因組測序草圖在DDBJ/EMBL/GenBank訪問號為ΑΖΝΙ00000000。
[0008]所述步驟⑴或所述步驟⑶中pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液是指首先將27.2gKH2PO4 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L KH2PO4 ;然后將 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到
0.2mol/L NaOH ;最后，將 250mL 0.2mol/L KH2PO4 和 118mL 0.2mol/L NaOH 混合均勻后稀釋至1000mL所得的緩沖液。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明以磁性殼聚糖微球為載體，通過吸附-交聯(lián)法將枯草芽孢桿菌B7-S{Bacillus subtilis B7-S)固定于磁性殼聚糖微球上,然后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素。其中磁性殼聚糖微球可回收重復(fù)使用，極大地減少微生物反復(fù)培養(yǎng)次數(shù)，有效地提高微生物利用率。同時固定化方法對細(xì)胞無損害，細(xì)胞的生物活性降低少。
[0010]2、本發(fā)明磁性殼聚糖微球固定化枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，不但可以提高阿魏酸的轉(zhuǎn)化率，而且容易回收重復(fù)使用，避免枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)細(xì)胞隨轉(zhuǎn)化液流出體系，在降低生產(chǎn)成本的同時提高了生產(chǎn)效率。
[0011]3、本 發(fā)明操作簡便，易于實施。
【具體實施方式】
[0012]實施例1 一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，包括以下步驟: ⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
①制備營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基:
將5g蛋白胨、2g牛肉提取物、2g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得pH值為5.0的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基。
[0013]②將一環(huán)生長良好的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7_S)斜面培養(yǎng)物按1%的接種量接種至含有50mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上,在20°C的條件下以100r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)36h,即得枯草芽孢桿菌B7_S(ifeci77w5.subtilisB7-S)菌液。
[0014]③將枯草芽抱桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以8000r/min的速率離心60min，分別得到上清液A和沉淀物A，該沉淀物A用5mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮后，再以8000r/min的速率離心15min，分別得到上清液B和沉淀物B，該沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮至菌懸浮液OD6tltol為0.4時，即得枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0015]⑵制備磁性殼聚糖微球:
I將納米Fe3O4微球與質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液按2mg =ImL的比例混合后，在30°C條件下進(jìn)行超聲分散，3h后得到Fe3O4的殼聚糖溶液。
[0016]II在三角瓶中按5 mL:1 mL的比例加入液體石蠟和司盤80，在20°C下磁力攪拌混合均勻，然后逐滴加入Fe3O4的殼聚糖溶液，并在20°C下磁力攪拌40min后加入5mL體積濃度為2%的戊二醛溶液，反應(yīng)0.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值為7.0的混合液。
[0017]III將混合液升溫至40°C，并繼續(xù)反應(yīng)3h，得到反應(yīng)液，該反應(yīng)液經(jīng)0.03MPa減壓過濾后，即得磁性殼聚糖微球粗品。
[0018]IV磁性殼聚糖微球粗品依次用異丙醇、丙酮、乙醇、去離子水清洗后，在40°C下真空干燥至恒重，即得磁性殼聚糖微球，并置于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0019]⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
將磁性殼聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的鹽酸溶液充分溶脹5h，再加入
0.lmol/L NaOH，得到pH值為4.0的磁性殼聚糖溶液；然后，將枯草芽孢桿菌subtilis B7-S)菌細(xì)胞加入到磁性殼聚糖溶液中，在20°C以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附2h后，加入體積濃度為1%的戊二醛溶液，再在20°C以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩交聯(lián)2h，最后用磁鐵收集磁性固定化細(xì)胞，該磁性固定化細(xì)胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0020]⑷制備香蘭素: a制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基: 將0.2g阿魏酸、5g蛋白胨、2g酵母浸出粉、2g NaCl與IL蒸懼水混合均勻后，加入5mol/L NaOH溶液，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min，即得pH值為
6.0的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。
[0021]b制備香蘭素轉(zhuǎn)化液:
將固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞按1%的接種量接種至含有50mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在20°C的條件下以lOOr/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)40h，即得香蘭素轉(zhuǎn)化液。
[0022]c固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7_S)菌細(xì)胞的回收:
將香蘭素轉(zhuǎn)化液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，得到沉淀物C和上清液C，該沉淀物
C即為固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0023]d分離香蘭素:
將上清液C以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心60min,即得香蘭素粗沉淀物。
[0024]e制備香蘭素粗品:
將香蘭素粗沉淀物在溫度為40°C、壓力為0.05MPa的條件下真空干燥100h，得到干燥的沉淀物，該干燥的沉淀物經(jīng)研磨、過100目篩后，即得香蘭素粗品。
[0025]實施例2 —種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，包括以下步驟: ⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
①制備營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基:
將15g蛋白胨、IOg牛肉提取物、15g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得pH值為9.0的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基。
[0026]②將一環(huán)生長良好的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)斜面培養(yǎng)物按20%的接種量接種至含有200mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在40°C的條件下以500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12h，即得枯草芽孢桿菌B7_S {Bacillussubtilis B7-S)菌液。
[0027]③將枯草芽抱桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以 12000r/min 的速率離心15min，分別得到上清液A和沉淀物A，該沉淀物A用20mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮后，再以12000r/min的速率離心5min，分別得到上清液B和沉淀物B，該沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮至菌懸浮液OD6tltlnm為0.8時，即得枯草芽孢桿菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0028]⑵制備磁性殼聚糖微球:
I將納米Fe3O4微球與質(zhì)量濃度為5%的殼聚糖溶液按8mg =ImL的比例混合后，在50°C條件下進(jìn)行超聲分散，Ih后得到Fe3O4的殼聚糖溶液。
[0029]II在三角瓶中按20 mL:1 mL的比例加入液體石蠟和司盤80，在60°C下磁力攪拌混合均勻，然后逐滴加入Fe3O4的殼聚糖溶液，并在60°C下磁力攪拌IOmin后加入20mL體積濃度為10%的戊二醛溶液，反應(yīng)0.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值為11.0的混合液。
[0030]III將混合液升溫至80°C，并繼續(xù)反應(yīng)lh，得到反應(yīng)液，該反應(yīng)液經(jīng)0.08MPa減壓過濾后，即得磁性殼聚糖微球粗品。
[0031]IV磁性殼聚糖微球粗品依次用異丙醇、丙酮、乙醇、去離子水清洗后，在80°C下真空干燥至恒重，即得磁性殼聚糖微球，并置于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0032]⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
將磁性殼聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的鹽酸溶液充分溶脹15h，再加Λ 0.lmol/L NaOH，得到pH值為10.0的磁性殼聚糖溶液；然后，將枯草芽孢桿菌B7_S(.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞加入到磁性殼聚糖溶液中，在50°C以500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附0.5h后，加入 體積濃度為4%的戊二醛溶液，再在50°C以500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩交聯(lián)0.5h,最后用磁鐵收集磁性固定化細(xì)胞,該磁性固定化細(xì)胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilisB7-S)菌細(xì)胞。
[0033]⑷制備香蘭素: a制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:
將Ig阿魏酸、15g蛋白胨、IOg酵母浸出粉、15g NaCl與IL蒸懼水混合均勻后，加入5mol/L NaOH溶液，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min，即得pH值為10.0的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。
[0034]b制備香蘭素轉(zhuǎn)化液:
將固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞按20%的接種量接種至含有200mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在50°C的條件下以500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)20h，即得香蘭素轉(zhuǎn)化液。
[0035]c固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞的回收:
將香蘭素轉(zhuǎn)化液以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，得到沉淀物C和上清液C，該沉淀物C
即為固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0036]d分離香蘭素:
將上清液C以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,即得香蘭素粗沉淀物。
[0037]e制備香蘭素粗品:
將香蘭素粗沉淀物在溫度為80°C、壓力為0.1OMPa的條件下真空干燥40h，得到干燥的沉淀物，該干燥的沉淀物經(jīng)研磨、過400目篩后，即得香蘭素粗品。
[0038]實施例3 —種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，包括以下步驟:⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
①制備營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基:
將IOg蛋白胨、6g牛肉提取物、9g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得pH值為7.0的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基。
[0039]②將一環(huán)生長良好的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)斜面培養(yǎng)物按10%的接種量接種至含有125mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上,在30°C的條件下以300r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌B7_S {Bacillussubtilis B7-S)菌液。
[0040]③將枯草芽抱桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌液以 10000r/min 的速率離心35min，分別得到上清液A和沉淀物A，該沉淀物A用12mL且pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮后，再以10000r/min的速率離心10min，分別得到上清液B和沉淀物B，該沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮至菌懸浮液OD6tltlnm為0.6時，即得枯草芽抱桿菌 B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。[0041]⑵制備磁性殼聚糖微球:
I將納米Fe3O4微球與質(zhì)量濃度為3%的殼聚糖溶液按5mg =ImL的比例混合后，在40°C條件下進(jìn)行超聲分散，2h后得到Fe3O4的殼聚糖溶液。
[0042]II在三角瓶中按12 mL:1 mL的比例加入液體石蠟和司盤80，在40°C下磁力攪拌混合均勻，然后逐滴加入Fe3O4的殼聚糖溶液，并在40°C下磁力攪拌25min后加入12mL體積濃度為6%的戊二醛溶液，反應(yīng)1.5h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值為9.0的混合液。
[0043]III將混合液升溫至60°C，并繼續(xù)反應(yīng)2h，得到反應(yīng)液，該反應(yīng)液經(jīng)0.05MPa減壓過濾后，即得磁性殼聚糖微球粗品。
[0044]IV磁性殼聚糖微球粗品依次用異丙醇、丙酮、乙醇、去離子水清洗后，在60°C下真空干燥至恒重，即得磁性殼聚糖微球，并置于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0045]⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞:
將磁性殼聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的鹽酸溶液充分溶脹10h，再加入
0.lmol/L NaOH，得到pH值為7.0的磁性殼聚糖溶液；然后，將枯草芽孢桿菌
subtilis B7-S)菌細(xì)胞加入到磁性殼聚糖溶液中，在35°C以300r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附
1.5h后，加入體積濃度為2.5%的戊二醛溶液，再在35°C以300r/min的轉(zhuǎn)速振蕩交聯(lián)1.5h，最后用磁鐵收集磁性固定化細(xì)胞，該磁性固定化細(xì)胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0046]⑷制備香蘭素:
a制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:
將0.6g阿魏酸、IOg蛋白胨、6g酵母浸出粉、8g NaCl與IL蒸懼水混合均勻后，加入5mol/L NaOH溶液，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min，即得pH值為
8.0的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。
[0047]b制備香蘭素轉(zhuǎn)化液:
將固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞按10%的接種量接種至含有125mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在35°C的條件下以300r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)30h，即得香蘭素轉(zhuǎn)化液。
[0048]c固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞的回收:
將香蘭素轉(zhuǎn)化液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心18min，得到沉淀物C和上清液C，該沉淀物
C即為固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞。
[0049]d分離香蘭素:
將上清液C以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心35min,即得香蘭素粗沉淀物。
[0050]e制備香蘭素粗品:
將香蘭素粗沉淀物在溫度為60°C、壓力為0.0SMPa的條件下真空干燥70h，得到干燥的沉淀物，該干燥的沉淀物經(jīng)研磨、過250目篩后，即得香蘭素粗品。
[0051]上述實施例廣3中，枯草芽孢桿菌subtilis B7-S)其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美國Genbank的訪問號為JQ086379 ;菌株全基因組測序草圖在DDBJ/EMBL/GenBank訪問號為ΑΖΝΙ00000000。
[0052]pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液是指首先將27.2g KH2PO4溶于1000mL水，得到
0.2mol/L KH2PO4 ;然后將 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L NaOH ;最后，將 250mL
0.2mol/L KH2PO4和118mL 0.2mol/L NaOH混合均勻后稀釋至1000mL所得的緩沖液。
[0053]醫(yī)藥用納米Fe3O4微球(99.6%, ( 20nm球形,市售),殼聚糖(Sigma公司生產(chǎn))，蛋白胨(OXIDE公司生產(chǎn))，牛肉提取物(BBI公司生產(chǎn))，其他試劑均為分析純。
【權(quán)利要求】
1.一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，包括以下步驟: ⑴制備枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌細(xì)胞: ①制備營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基: 將5~15g蛋白胨、2~10g牛肉提取物、2~15g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得pH值為5.0-9.0的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基； ②將一環(huán)生長良好的枯草芽孢桿菌B7-S{Bacillus subtil is B7-S)斜面培養(yǎng)物按1-20%的接種量接種至含有50-200mL所述營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在20-40°C的條件下以100-500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12~36h，即得枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌液； ③將所述枯草芽抱桿菌B7-S(.Bacillus subtil is B7-S)菌液以8000~12000r/min的速率離心15飛Omin，分別得到上清液A和沉淀物A，該沉淀物A用5~20mL且pH=6.8的.0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮后，再以8000-l2000r/min的速率離心5~15min，分別得到上清液B和沉淀物B，該沉淀物B用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮至菌懸浮液OD6tltlnm為.0.4~0.8時，即得枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌細(xì)胞； ⑵制備磁性殼聚糖微球: I將納米Fe3O4微球與質(zhì)量濃度為f 5%的殼聚糖溶液按2mg: lmL~8mg =ImL的比例混合后，在30-50°C條件下進(jìn)行超聲分散，r3h后得到Fe3O4的殼聚糖溶液； II在三角瓶中按5 mL:1 mL~20 mL:1 mL的比例加入液體石蠟和司盤80，在20-60°C下磁力攪拌混合均勻，然后逐滴加入所述Fe3O4的殼聚糖溶液，并在20-60°C下磁力攪拌10-10min后加入5~20mL體積濃度為2~10%的戊二醛溶液，反應(yīng)0.5~2h，再加入0.lmol/LNaOH，得到pH值為7.0-l.0的混合液； III將所述混合液升溫至40-80°C，并繼續(xù)反應(yīng)f3h，得到反應(yīng)液，該反應(yīng)液經(jīng).0.03、.0SMPa減壓過濾后，即得磁性殼聚糖微球粗品； IV所述磁性殼聚糖微球粗品依次用異丙醇、丙酮、乙醇、去離子水清洗后，在40-80°C下真空干燥至恒重，即得磁性殼聚糖微球，并置于4°C冰箱內(nèi)保存； ⑶固定枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌細(xì)胞: 將所述磁性殼聚糖微球加入到三角瓶中，用0.lmol/L的鹽酸溶液充分溶脹5~15h，再加入0.lmol/L NaOH,得到pH值為4.0~10.0的磁性殼聚糖溶液；然后，將所述枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtil is B7-S)菌細(xì)胞加入到所述磁性殼聚糖溶液中，在20-50°C以100-500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附0.5~2h后，加入體積濃度為1%~4%的戊二醛溶液，再在20~50°C以100~500r/min的轉(zhuǎn)速振蕩交聯(lián)0.5~2h,最后用磁鐵收集磁性固定化細(xì)胞,該磁性固定化細(xì)胞用pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌后在4°C下保存，即得固定化的枯草芽抱桿菌 B7-S (.Bacillus subtil is B7-S)菌細(xì)胞； ⑷制備香蘭素: a制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基: 將0.2~Ig阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~IOg酵母浸出粉、2~15g NaCl與IL蒸餾水混合均勻后，加入5mol/L NaOH溶液，在壓強為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min，即得pH值為6.0-10.0的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；b制備香蘭素轉(zhuǎn)化液:將所述固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (Mcillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞按f 20%的接種量接種至含有5(T200mL的所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在2(T50°C的條件下以10(T500r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)2(T40h，即得香蘭素轉(zhuǎn)化液；c固定化的枯草芽孢桿菌B7-S (.Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞的回收: 將所述香蘭素轉(zhuǎn)化液以100(T5000r/min的轉(zhuǎn)速離心5~30min，得到沉淀物C和上清液C，該沉淀物C即為固定化的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)菌細(xì)胞；d分離香蘭素: 將所述上清液C以800(Tl2000r/min的轉(zhuǎn)速離心l(T60min,即得香蘭素粗沉淀物； e制備香蘭素粗品: 將所述香蘭素粗沉淀物在溫度為4(T80°C、壓力為0.05、.1OMPa的條件下真空干燥4(T100h，得到干燥的沉淀物，該干燥的沉淀物經(jīng)研磨、過100-400目篩后，即得香蘭素粗品O
2.如權(quán)利要求1所述的一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于:所述步驟②中的枯草芽孢桿菌B7-S {Bacillus subtilis B7-S)其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2011162 ;其菌株16S rRNA在美國Genbank的訪問號為JQ086379 ;菌株全基因組測序草圖在DDBJ/EMBL/GenBank訪問號為ΑΖΝΙ00000000。
3.如權(quán)利要求1所述的一種磁性材料固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于:所述步驟⑴或所述步驟⑶中pH=6.8的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液是指首先將27.2g KH2PO4溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/L KH2PO4 ;然后將 8.0g NaOH 溶于 1000mL 水，得到 0.2mol/LNaOH ;最后，將 250mL 0.2mol/L KH2PO4 和1181^ 0.2mol/L NaOH 混合均勻后稀釋至 1000mL所得的緩沖液。
【文檔編號】C12R1/125GK103981226SQ201410233573
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】陳朋, 李素岳, 王寧波, 嚴(yán)曉娟 申請人:甘肅省商業(yè)科技研究所