長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測水體或土壤中長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交檢測方法，包括使用探針[FITC]-5’-CGTCCTCAGACATCATCC(SEQ ID NO：1)進(jìn)行熒光原位雜交檢測。
【專利說明】長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及長灘軍團(tuán)菌檢測鑒定的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種長灘軍團(tuán)菌的熒光原位 雜交檢測方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 軍團(tuán)菌是一類革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，廣泛分布于自然環(huán)境與人工水體環(huán) 境中，主要以空氣氣溶膠的形式進(jìn)入肺泡，并以胞內(nèi)寄生的方式感染人體細(xì)胞，可引起軍團(tuán) 菌病。目前軍團(tuán)菌屬共有58個種，20多個種與人類疾病有關(guān)，其中嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila)、長灘軍團(tuán)菌（L.longbeachae)和杜氏軍團(tuán)菌（L.dumoffii)為主要病原體。 長灘軍團(tuán)菌于1980年首次分離于美國長灘市的一位軍團(tuán)菌肺炎患者，并因此得名。同年， William分離得到長灘軍團(tuán)菌的第二個血清型，此后便不斷有長灘軍團(tuán)菌的臨床和環(huán)境分 離報道。在澳大利亞，新西蘭等地，長灘軍團(tuán)菌感染病例數(shù)量與嗜肺軍團(tuán)菌相當(dāng)，有些地區(qū) 甚至多于嗜肺軍團(tuán)菌感染病例。有研究表明，歐洲軍團(tuán)菌肺炎患者中，大約5%病例源自長 灘軍團(tuán)菌感染，并在過去的十年間呈顯著增多的趨勢。在亞洲，日本近年來也發(fā)現(xiàn)長灘軍團(tuán) 菌感染的軍團(tuán)菌病患者。與嗜肺軍團(tuán)菌以空調(diào)系統(tǒng)產(chǎn)生的氣溶膠為主要傳播途徑不同，長 灘軍團(tuán)菌主要存在于堆肥處理的土壤以及附近水體中。流行病學(xué)調(diào)查表明，長灘軍團(tuán)菌病 例大多在患病前接觸了含有長灘軍團(tuán)菌的土壤或附近水體。我國軍團(tuán)菌的研究多集中在城 市空調(diào)系統(tǒng)或環(huán)境水系中嗜肺軍團(tuán)菌的分離與培養(yǎng)，而長灘軍團(tuán)菌的相關(guān)研究基本處于空 白，更無土壤中長灘軍團(tuán)菌的分離研究報道，長灘軍團(tuán)菌對我國人群的危害尚不清楚。
[0003] 目前長灘軍團(tuán)菌的檢測鑒定主要采用分離培養(yǎng)，血清凝集實驗，生化反應(yīng)，16S rRNA基因和mip基因測序鑒定等方法。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法耗時長，分離難度大。血清凝集 容易出現(xiàn)交叉凝集反應(yīng)，生化反應(yīng)鑒定重復(fù)性差，基因測序耗費大。因此需要一種簡單的長 灘軍團(tuán)菌特異性檢測方法。突光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH) 是一種特異性的微生物圖像檢測方法。熒光標(biāo)記的核酸探針與微生物胞內(nèi)高度相似的核酸 位點雜交，并在激發(fā)光照射下發(fā)射熒光，可用于微生物的檢測和定位。目前已有針對軍團(tuán)菌 屬和嗜肺軍團(tuán)菌種的特異性FISH探針，并廣泛運用于環(huán)境、臨床等樣品的檢測。本發(fā)明設(shè) 計一種長灘軍團(tuán)菌的特異性FISH檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交檢測方法，本發(fā)明基于我們 在16SrRNA序列中新發(fā)現(xiàn)的一個長灘軍團(tuán)菌特異的探針結(jié)合位點，建立一種更為簡單、快 速、且成本低廉的長灘軍團(tuán)菌檢測方法。
[0005] 本發(fā)明實現(xiàn)過程如下：
[0006] 1.熒光原位雜交探針設(shè)計與合成：
[0007] 通過對長灘軍團(tuán)菌、非長灘軍團(tuán)菌與其他非軍團(tuán)菌的16S rRNA序列比對，發(fā)現(xiàn)長 灘軍團(tuán)菌在該序列上存在一段特異性區(qū)域"GGATGATGTCTGAGGACG"，其他非長灘軍團(tuán)菌與非 軍團(tuán)菌在此區(qū)域至少存在一個堿基差異。據(jù)此我們設(shè)計一條長灘軍團(tuán)菌特異探針，通過該 熒光原位雜交探針可鑒別軍團(tuán)菌與其他細(xì)菌。委托商業(yè)探針合成公司合成探針：
[0008]探針：[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC (核酸序列 SEQ ID NO :1)
[0009] FITC :異硫氰酸突光素 （fluorescein isothiocyanate)，通過一個氨基連接分子 與探針5'端相連。
[0010] 2.檢測所用試劑的制備
[0011] (1)探針：上面1.熒光原位雜交探針設(shè)計與合成中制備的探針以無菌蒸餾水溶 解，配制成濃度IOng/μ 1。
[0012] (2)熒光原位雜交緩沖液：20mM Tris-HCl，20% 甲酰胺，900mM NaCl。
[0013] (3)熒光原位雜交洗脫液：20mM Tris-HCl，0· 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA。
[0014] (4)陽性對照：長灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33462)，0· 5mll X IO4個菌/ml培養(yǎng)物。
[0015] (5)陰性對照：嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC35072)，0· 5mllX IO4個菌/ml的嗜肺軍 團(tuán)菌培養(yǎng)物。
[0016] 以上在_20°C保存。
[0017] 3.檢測方法
[0018] (1)樣品前處理：將待檢測樣品和對照制成4%多聚甲醛菌懸液，置于4°C過夜固 定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩沖液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液均 勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。
[0019] (2)探針雜交：將涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96%的乙醇溶液中脫水3 分鐘，自然風(fēng)干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩沖 液共計20 μ 1混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預(yù)熱的洗脫緩沖 液洗去未雜交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干。
[0020] (3)熒光顯微鏡觀察
[0021] 調(diào)整激發(fā)光波長至490?495nm，在熒光顯微鏡下觀察玻片。
[0022] 本發(fā)明的主要特點如下：
[0023] (1)高特異性：通過對19株長灘軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌屬菌株以及與探針匹配程度 較高的21株非長灘軍團(tuán)菌（包括10株嗜肺軍團(tuán)菌，1株圣克魯伊軍團(tuán)菌，1株圣海倫軍團(tuán) 菌，1株辛辛那提軍團(tuán)菌，4株博茲曼軍團(tuán)菌，2株麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌，2株杜氏軍團(tuán)菌），進(jìn)行探針的 特異性檢測試驗，證明了本發(fā)明方法能準(zhǔn)確的鑒定出長灘軍團(tuán)菌，說明本發(fā)明的方法特異 性很高。
[0024] (2)高靈敏性：本發(fā)明建立的長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交方法，靈敏性達(dá) 1. 49 X 103cfu/ml。
[0025] (3)檢測方法簡便快速，無須先進(jìn)設(shè)備，且結(jié)果容易分析。
[0026] (4)檢測范圍廣：本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計合理，可以廣泛應(yīng)用于水樣、生物膜和胞 內(nèi)寄生的長灘軍團(tuán)菌快速鑒定，但并不僅限于此。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1使用本發(fā)明方法檢測時，長灘軍團(tuán)菌在顯微鏡下的形態(tài)。
[0029] 圖2使用本發(fā)明方法檢測時，嗜肺軍團(tuán)菌在顯微鏡下的形態(tài)

【具體實施方式】：
[0030] 1.本發(fā)明所需主要試劑的制備
[0031] (1)探針合成
[0032] 委托商業(yè)探針合成公司合成探針：
[0033] 探針：[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC (核酸序列 SEQ ID NO :1)
[0034] FITC :異硫氰酸突光素 （fluorescein isothiocyanate)，通過一個氨基連接分子 與探針5'端相連
[0035] 以無菌蒸餾水溶解，配制成濃度IOng/ μ 1。
[0036] (2)配制雜交緩沖液：
[0037] 雜交緩沖液包含：20mM Tris-HCl，20% 甲酰胺，900mM NaCl。
[0038] (3)配制洗脫緩沖液：
[0039] 洗脫緩沖液包含：20mM Tris-HCl，0· 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA。
[0040] (4)制備陽性、陰性對照品：分別使用長灘軍團(tuán)菌（ATCC33462)和嗜肺軍團(tuán)菌 (ATCC35072)標(biāo)準(zhǔn)菌株，然后稀釋至0. 5麥?zhǔn)蠞岫龋?. 5mL分裝。
[0041] 2.檢測方法（以環(huán)境水樣本檢測為例）
[0042] (1)樣品處理
[0043] 將200mL水樣注入濾器，開啟真空泵，水樣通過負(fù)壓抽濾至干，直接刮取濾膜上沉 淀于5mL無菌蒸饋水中，取ImL轉(zhuǎn)移至I. 5ml EP管內(nèi)，12000rpm離心1分鐘，棄上清，向沉 淀中加入lmL4%多聚甲醛制成菌懸液，置于4°C過夜固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清， 以PBS緩沖液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液均勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。
[0044] (2)熒光原位雜交
[0045] 將涂有菌液的玻片依次置于50%，80%和96%的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風(fēng) 干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩沖液共計20 μ 1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗去未雜 交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干。
[0046] (3)熒光顯微鏡下觀察
[0047] 調(diào)整激發(fā)光波長至490?495nm，在熒光顯微鏡下觀察玻片。（陽性檢測結(jié)果見圖 1，陰性檢測結(jié)果見圖2)
[0048] 3.檢測方法（以菌株為例）
[0049] (1)樣品處理：
[0050] 用接種環(huán)挑取待檢菌落于1.5ml EP管內(nèi)制成4%多聚甲醛菌懸液，置于4°C過夜 固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩沖液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液 均勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。
[0051] (2)熒光原位雜交：
[0052] 將涂有菌液的玻片依次置于50^,80%和96%的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風(fēng) 干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩沖液共計20 μ 1 混合，滴加至玻片中央，置于46°C濕盒中雜交2h，之后于46°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗去未雜 交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干。
[0053] (3)熒光顯微鏡下觀察：
[0054] 調(diào)整激發(fā)光波長至490?495nm，在熒光顯微鏡下觀察玻片。
[0055] 4檢測方法特異性和靈敏度試驗
[0056] 特異性
[0057] 按照3.檢測方法（以菌株為例）中的方法，使用本發(fā)明的方法檢測了 19株長灘 軍團(tuán)菌、4株非軍團(tuán)菌屬菌株以及與探針匹配程度較高的21株非長灘軍團(tuán)菌（包括10株 嗜肺軍團(tuán)菌，1株圣克魯伊軍團(tuán)菌，1株圣海倫軍團(tuán)菌，1株辛辛那提軍團(tuán)菌，4株博茲曼軍團(tuán) 菌，2株麥?zhǔn)宪妶F(tuán)菌，2株杜氏軍團(tuán)菌），進(jìn)行探針的特異性檢測試驗。結(jié)果顯示，本發(fā)明的方 法能在多種類似菌中特異性的檢測出長灘軍團(tuán)菌（附圖1和2分別顯示了本發(fā)明的方法檢 測一株長灘軍團(tuán)菌和一株嗜肺軍團(tuán)菌時的顯微鏡圖像，其他陽性/陰性菌株的檢測結(jié)果類 似）。
[0058] 靈敏度
[0059] 將長灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33462)配制0. 5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，?0倍體積 作梯度稀釋至KT7倍，制成人工模擬水樣。使用本發(fā)明的方法檢測，取最低檢測濃度菌 懸液20 μ 1涂布至BCYEa平板，36°C，5% CO2，培養(yǎng)72h后計數(shù)平板上菌落。結(jié)果顯示在 1.49X 103cfU/ml的軍團(tuán)菌濃度下，本發(fā)明的方法仍然能檢測出樣本中的長灘軍團(tuán)菌。
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測水體或土壤中長灘軍團(tuán)菌的熒光原位雜交檢測方法，包括使用根據(jù)長灘軍 團(tuán)菌特異性序列區(qū)域設(shè)計的熒光標(biāo)記探針進(jìn)行熒光原位雜交檢測。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光標(biāo)記探針是根據(jù)長灘軍團(tuán)菌16S rRNA中的特異性 區(qū)域設(shè)計，為[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為 SEQ ID N0:1)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中使用的主要試劑包括： (1)探針：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為 SEQ ID NO :1)，以無菌蒸餾水 溶解，配制成濃度l〇ng/ii 1 ; ⑵熒光原位雜交緩沖液：20mM Tris-HCl，20%甲酰胺，900mM NaCl ; (3) 熒光原位雜交洗脫液：20mM Tris-HCl，0. 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA ; (4) 陽性對照：長灘軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC33462)，0. 5mllX 104個菌/ml培養(yǎng)物； (5) 陰性對照：嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC35072)，0. 5mllX 104個菌/ml的嗜肺軍團(tuán)菌 培養(yǎng)物。
4. 權(quán)利要求3的方法，具體步驟包括： (1) 樣品前處理：將待檢測樣品和對照制成4%多聚甲醛菌懸液，置于4°C過夜固定， 12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩沖液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 yl菌液均勻涂 于載玻片上，室溫風(fēng)干， (2) 探針雜交：將涂有菌液的玻片依次置于50^,80%和96%的乙醇溶液中脫水3分 鐘，自然風(fēng)干。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 yl探針溶液以及19. 5 yl雜交緩沖液 共計20 yl混合，滴加至玻片中央，置于46 °C濕盒中雜交2h，之后于46 °C預(yù)熱的洗脫緩沖液 洗去未雜交的探針，去離子水沖洗玻片，避光風(fēng)干， (3) 熒光顯微鏡觀察 調(diào)整激發(fā)光波長至490?495nm，在熒光顯微鏡下觀察玻片。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404130SQ201410201732
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】顧全, 胡朝暉, 朱慶義, 嚴(yán)慧 申請人:廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司