一種角蛋白酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種角蛋白酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的角蛋白酶的第13位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第27位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第46位氨基酸由Gln變?yōu)長ys；其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：4。本發(fā)明提供的角蛋白酶突變體最適作用pH值為7.0，在堿性條件下的相對酶活水平均高于野生型，耐堿性更強；其最適作用溫度為50℃，在45℃-60℃范圍內(nèi)，能保持60％以上的相對酶活，在65℃條件下處理5min后能保持85％以上的酶活，在70℃條件下處理5min后仍能保持55％以上的酶活，與野生型相比耐熱性得到較大提升。
【專利說明】一種角蛋白酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因功能改造【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種角蛋白酶突變體及其應(yīng)用。技術(shù)背景
[0002]角蛋白(keratinase)是一種廣泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于動物的毛發(fā)、鱗片、羽毛、蹄、角等結(jié)構(gòu)中。角蛋白的肽鏈是以α-螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)組成的，通過二硫鍵、氫鍵和其他交聯(lián)鍵作用形成非常穩(wěn)定的高度交聯(lián)的三維結(jié)構(gòu)，不溶于水，不能被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。但角蛋白營養(yǎng)豐富，例如羽毛中含粗蛋白80%以上，含各種氨基酸總量70%以上，并且含多種動物所需要的必需氨基酸，若加以妥善處理，是一種良好的飼料蛋白來源。且隨著現(xiàn)代家禽養(yǎng)殖規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)生了大量角蛋白類廢物，如不及時處理，將造成局部環(huán)境的嚴重污染，而自然界中某些微生物可利用自身分泌的角蛋白酶將其分解利用，作為生長所需的碳源和氮源。
[0003]角蛋白酶是一種特異性降解角蛋白的酶類，可由多種微生物產(chǎn)生，它能將角蛋白水解成游離的氨基酸或多肽。目前普遍認為角蛋白酶的降解過程分三個步驟，即變性作用、水解作用和轉(zhuǎn)氨基作用。首先二硫鍵還原酶作用于角蛋白二硫鍵，將胱氨酸(-S-S-)還原為半胱氨酸(-SH)，使角蛋白高級結(jié)構(gòu)階梯而形成變性角蛋白；變性角蛋白在多肽水解酶作用下逐漸水解成多肽、寡肽和游離氨基酸；最后由轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生氨氣和硫化物而使角蛋白徹底水解。角蛋白酶的這種特性，可用于處理廢棄的動物羽毛、毛發(fā)等，并將這些原來污染環(huán)境的物質(zhì)變廢為寶，使其在飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)及環(huán)境治理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，通過篩選或改造的方法獲得性能優(yōu)良的角蛋白酶成為本領(lǐng)域內(nèi)的研究執(zhí)占。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種角蛋白酶突變體及其應(yīng)用，本發(fā)明通過對來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的角蛋白酶進行蛋白質(zhì)工程改造,獲得了突變體蛋白，使其耐熱性得到顯著提高，PH作用范圍擴大，有利于其廣泛應(yīng)用。
[0005] 申請人:對枯草芽孢桿菌角蛋白酶的N末端進行突變，經(jīng)過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)S13N，S27N和Q46K這三個突變位點能引起角蛋白酶耐堿性和耐熱性的改變，從而促成本發(fā)明。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種角蛋白酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的角蛋白酶的第13位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第27位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第46位氨基酸由Gln 變?yōu)?Lys。
[0007]上述角蛋白酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID NO:4o
[0008]本發(fā)明一方面提供了攜帶有上述角蛋白酶突變體編碼基因的重組質(zhì)粒。
[0009]本發(fā)明另一方面提供了攜帶有上述重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌重組菌株。
[0010]本發(fā)明還提供了上述角蛋白酶突變體在飼料中的應(yīng)用。[0011]本發(fā)明提供的角蛋白酶突變體最適作用pH值為7.0，在堿性條件下的相對酶活水
平均高于野生型，耐堿性更強；其最適作用溫度為50°C，在45°C -60°C范圍內(nèi)，能保持60%
以上的相對酶活，在65°C條件下處理5min后能保持85%以上的酶活，在70°C條件下處理
5min后仍能保持55%以上的酶活，與野生型相比耐熱性得到較大提升。此外，本發(fā)明的角
蛋白酶突變體對飼用蛋白原料的酶解效果顯著高于野生型，因此更有利于提高養(yǎng)殖動物對
飼料中蛋白原料的利用率，進而可以減少蛋白原料的添加量，降低飼料成本，增加經(jīng)濟效.、
Mo
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:本發(fā)明角蛋白酶突變體Ker7與野生型KerI作用pH-相對酶活曲線圖；
[0013]圖2:本發(fā)明角蛋白酶突變體Ker7與野生型KerI pH穩(wěn)定性比較圖；
[0014]圖3:本發(fā)明角蛋白酶突變體Ker7與野生型KerI作用溫度-相對酶活曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體實施例的限定。
[0016]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。
[0017]實施例1角蛋白酶基因突變庫的構(gòu)建
[0018]為了提高來源于枯草芽孢桿菌的角蛋白酶KerI (氨基酸序列為SEQ ID N0:1，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:2)的耐熱性，通過定向進化技術(shù)對該酶進行了大量突變的篩選，設(shè)計PCR引物Ker-F、Ker-R如下:
[0019]Ker-F:GCGTCGACTTCAACAACATGTCTGCGCAGGCTG(下劃線為限制件內(nèi)切酶 Sal I 識別位點)
[0020]Ker-R: CATGCATGCTTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTGATTAAC (下劃線為限制性內(nèi)切酶Sph I識別位點)
[0021]以KerI基因為模板，以上述引物用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產(chǎn)物，Sal 1、Sph I進行酶切處理后與經(jīng)同樣酶切后的pWB980載體連接，轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，涂布于LB+Kan平板，37°C倒置培養(yǎng)過夜，平板上長出轉(zhuǎn)化子。
[0022]實施例2耐熱角蛋白酶突變體的篩選
[0023]用牙簽將平板上生長出的轉(zhuǎn)化子逐個挑至96孔板，每個孔中加入500 μ L LB+Kan培養(yǎng)基，370C 220rpm培養(yǎng)24h左右，離心收集上清，獲得含有角蛋白酶的發(fā)酵液。
[0024]分別取出40 μ L適當(dāng)稀釋的上清液至兩塊新的96孔板，其中一塊于70°C處理IOmin后，兩塊96孔板都加入40 μ L底物，于40°C反應(yīng)10min后，用福林試劑顯色的方法測定酶活。不同的突變子高溫處理后殘留的活性不同。有些角蛋白酶突變子的耐熱性沒有變化，有些突變子的耐熱性降低了，對依然保持高活性的突變子進行DNA測序，最終獲得了能顯著提高角蛋白酶耐熱性的突變組合S13N，S27N和Q46K。
[0025]含S13N，S27N和Q46K三點突變的角蛋白酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3，編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:4，基因命名為Ker7。
[0026]實施例3枯草芽孢桿菌表達菌株的構(gòu)建和發(fā)酵
[0027]將突變體基因Ker7用引物Ker-F、Ker_R進行PCR擴增，引物兩端引入Sal 1、Sph I位點。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸1.5min，30個循環(huán)后，72°C保溫IOmin。
[0028]通過上述同樣的PCR方法擴增得到野生型角蛋白酶KerI的基因片段。
[0029]將得到的KerI和Ker7基因用Sal 1、Sph I雙酶切后，與同樣進行酶切的表達載體pWB980進行連接，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細胞，涂布LB+Kan平板，37°C過夜培養(yǎng)。次日，篩選得到重組菌株。
[0030]將KerI和Ker7的重組菌株接種于50mL LB+Kan的液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)約24h，將培養(yǎng)物進行5000g，5min離心，收集上清液，即得到角蛋白酶粗酶液。
[0031]實施例4角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)測定
[0032]1、最適作用pH和pH穩(wěn)定性分析
[0033]采用pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值為8.5,9.0的硼砂-硼酸緩沖液，將發(fā)酵獲得的角蛋白酶粗酶液進行稀釋測定，角蛋白酶底物也分別用對應(yīng)PH值的緩沖液配制，在40°C下進行酶活力測定，計算酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做pH-相對酶活曲線。結(jié)果如圖1所示,野生型角蛋白酶KerI和角蛋白酶突變體Ker7的最適作用pH值均為7.0，但突變體在堿性條件下的相對酶活水平均高于野生型，說明突變后的角蛋白酶耐堿性更強。
[0034]采用pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液，將發(fā)酵獲得的粗酶液稀釋，40°C處理2h后，進行稀釋測定，計算酶活，以未處理樣品的酶活為100%，計算酶活殘留率，做pH-酶活殘留率曲線。結(jié)果如圖2所示，在pH5.5-9.0范圍內(nèi)，角蛋白酶突變體Ker7的酶活殘留率均高于野生型，尤其在pH7.5-9.0的堿性范圍內(nèi)，突變體Ker7的酶活殘留率顯著高于野生型，從而說明突變后的角蛋白酶比野生型具有更強的耐堿性。
[0035]2、最適作用溫度和熱穩(wěn)定性分析
[0036]分別在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、6(rC、65°C，pH5.5 條件下，對發(fā)酵獲得
的粗酶液進行角蛋白酶酶活測定，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，野生型角蛋白酶KerI和突變體Ker7的最適作用溫度均為50°C，但突變體Ker7在45°C _60°C范圍內(nèi)，相對酶活均高于60%，比野生型耐熱性更強。
[0037]將發(fā)酵獲得的粗酶液用pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋后，在65°C、70°C條件下分別處理2min和5min后，測定酶活，以未處理樣品的酶活為100%，計算酶活殘留率。結(jié)果顯示，野生型角蛋白酶KerI在65°C條件下處理5min后能保持60%以上的酶活，但在70°C條件下處理5min后殘留酶活僅剩12% ;而角蛋白酶突變體Ker7在65°C條件下處理5min后能保持85%以上的酶活，在70°C條件下處理5min后仍能保持55%以上的酶活，說明突變后的角蛋白酶與野生型相比耐熱性得到較大的提升。
[0038]上述的結(jié)果表明角蛋白酶突變體Ker7基因比野生型具有更強的耐堿性和耐熱性。
[0039]實施例5角蛋白酶突變體對飼用蛋白原料消化率的影響
[0040]豆柏、花生柏、玉米、小麥、魚粉、DDGS在是飼料中應(yīng)用最為廣泛的蛋白原料，本試驗通過體外模擬單胃動物胃和小腸的消化過程檢測本發(fā)明所述角蛋白酶突變體對蛋白原料消化率的影響。
[0041]試駘樣品:
[0042](I)空白:不額外添加酶制劑；
[0043](2)野生型角蛋白酶KerI (酶活5000U/g)
[0044](3)角蛋白酶突變體Ker7 (酶活5000U/g)[0045]底物:
[0046]豆柏:粗蛋白含量48%
[0047]花生柏:粗蛋白含量44.34% ；
[0048]玉米:粗蛋白含量9.25% ;
[0049]小麥:粗蛋白含量13.37% ;
[0050]魚粉:粗蛋白含量69.87% ；
[0051]DDGS:粗蛋白含量30%
[0052]消化酶:
[0053]胃蛋白酶(sigmap-70001:10000);膜蛋白酶(sigma p-7545)。
[0054]體外酶解試驗概況:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種角蛋白酶突變體，其特征在于，所述的角蛋白酶突變體是氨基酸序列為SEQ IDNO:1的角蛋白酶的第13位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第27位氨基酸由Ser變?yōu)锳sn，第46位氨基酸由Gln變?yōu)長ys。
2.如權(quán)利要求1所述的角蛋白酶突變體，其特征在于所述的角蛋白酶突變體的氨基酸序列為 SEQ ID NO:3o
3.一種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的角蛋白酶突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述的基因的核酸序列為SEQIDNO:4。
5.一種重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求3所述的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求4所述的基因。
7.—種重組菌株，其特征在于，所述的重組菌株為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌。
8.權(quán)利要求1所 述的角蛋白酶突變體在飼料中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/57GK103898081SQ201410164525
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】付娟, 肖志壯, 馬向東, 劉魯民 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司