基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法，屬于生物【技術領域】。該方法先制備雙鏈DNA，然后將雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶和不同濃度的甲基化酶反應，得到混合溶液；將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和TdT反應緩沖液與混合溶液反應，得到反應溶液；最后將苝衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和反應溶液反應，對甲基化酶的活性進行熒光檢測。本發(fā)明還提供一種甲基化酶抑制劑的篩選方法。本發(fā)明利用小分子探針單體與激基締合物熒光強度比值的變化來檢測甲基化酶和抑制劑的活性，測試給出的是兩個熒光信號的比值，比起單純熒光增強或減弱的信號，不易受到干擾，靈敏度更高。
【專利說明】基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 激基締合物(excimer)是指兩個同種分子和原子的聚集體,在激發(fā)態(tài)時兩個分子或原子的作用較強，產(chǎn)生新的能級，發(fā)射光譜不同于單個物種，無精細結構。而在基態(tài)時作用較弱或無作用。激基締合物(excimer)突光具有其較大的stokes位移和較長的突光壽命，在生物分析和傳感中已經(jīng)有不少應用。許多具有平面芳環(huán)結構的分子都具有激基締合物熒光。茈衍生物是一類稠環(huán)共軛化合物，它有大的共軛電子結構，具有優(yōu)良的熒光量子效率和光，熱穩(wěn)定性。通過化學修飾，可以使它帶上一個親水的基團R，它可以為帶負電荷的磺酸基團，羧酸基團，或是帶正電荷的季銨鹽。
[0003]現(xiàn)目前，越來越多的人體疾病被發(fā)現(xiàn)與異常的DNA甲基化有關系，在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在的情況下，DNA甲基化酶能夠催化DNA的甲基化過程。因此，對DNA甲基化酶活性及其抑制劑的篩選對于基礎的生物學研究，藥物發(fā)現(xiàn)，基因疾病診斷治療具有重要的意義。
[0004]許多傳統(tǒng)的方法如電泳，高效液相色譜，聚合酶鏈式反應，酶聯(lián)免疫吸附測定等已經(jīng)被用作甲基化酶活性的檢測。近些年來，越來越多的基于電化學，比色，熒光的方法已經(jīng)被報道。如2007年TanWeihong等人設計了一種帶有5’ -G-A-T-C-3’識別位點的分子信標，用來檢測甲基化酶(Anal.Chem.2007，79，1050 - 1056)。分子信標的5，端和3，端分別修飾了熒光集團和猝滅集團。在甲基化酶和限制性內切酶的存在下，Dam甲基化酶可以催化5’ -G-A-T-C-3’序列中的A堿基甲基化，限制性內切酶切割了 5’ -G-Am-T-C_3’序列，導致分子信標的熒光恢復。然而由于熒光集團和猝滅集團的修飾，使得方法有過程繁瑣，耗時，且成本高等缺陷。2011年，一種利用氧化石墨烯猝滅熒光的性質來檢測甲基化酶的方法被報道(Anal.Chem.2011, 83，8906 - 8912)，該方法設計了作為酶切底物的DNA (圖3)，其中單鏈的部分是用來與氧化石墨烯結合的，雙鏈的部分帶有甲基化酶和限制性內切酶的識別位點。同時在雙鏈的末端修飾了熒光集團，由于單鏈與石墨烯結合，石墨烯能夠猝滅熒光集團的熒光，當有限制性內切酶存在時，識別位點被切割，熒光恢復。但是，當甲基化酶和限制性內切酶同時存在時，甲基化酶催化識別位點甲基化，識別位點序列被甲基化后阻礙了內切酶的切割，此時，熒光不能恢復。此方法也有一些不足之處，首先納米材料的制備過程同樣繁瑣且成本高，需要耗費相當?shù)臅r間和資金；其次熒光集團的共價修飾也是過程繁瑣成本高；另外給出的是淬滅的熒光信號，相比于熒光增強更容易受到干擾信號的影響。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的甲基化酶活性的檢測方法和甲基化酶抑制劑的篩選方法耗時、成本高且靈敏度低的問題，而提供一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法。
[0006]本發(fā)明首先提供一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，包括如下:
[0007]步驟一:制備雙鏈DNA ；
[0008]步驟二:將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶和不同濃度的甲基化酶反應，得到混合溶液；
[0009]步驟三:將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉移酶反應緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應，得到反應溶液；
[0010]步驟四:將茈衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和步驟三得到的反應溶液反應，對甲基化酶的活性進行熒光檢測。
[0011]優(yōu)選的是，所述的甲基化酶為Dam、HpaII或M.SssI。
[0012]優(yōu)選的是，所述的甲基化酶的濃度范圍為0_80U/mL。
[0013]優(yōu)選的是，所述的步驟四中的聚陽離子的結構式為:
[0014]
【權利要求】
1.一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，包括如下: 步驟一:制備雙鏈DNA ； 步驟二:將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶和不同濃度的甲基化酶反應，得到混合溶液； 步驟三:將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉移酶反應緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應，得到反應溶液； 步驟四:將茈衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和步驟三得到的反應溶液反應，對甲基化酶的活性進行熒光檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的甲基化酶為Dam、HpaII或Μ.SssI。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的甲基化酶的濃度范圍為0-80U/mL。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的步驟四中的聚陽離子的結構式為:
5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的步驟四的反應溫度為37°C，反應時間為5min。
6.一種基于茈激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，包括如下: 步驟一:制備雙鏈DNA ； 步驟二:將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶、甲基化酶和不同濃度的甲基化酶抑制劑反應，得到混合溶液； 步驟三:將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉移酶反應緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應，得到反應溶液； 步驟四:將茈衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和步驟三得到的反應溶液反應，對甲基化酶抑制劑用熒光方法進行篩選。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制劑為慶大霉素、5-氟尿嘧啶、卞青霉素或絲裂霉素。
8.根據(jù)權利要求6所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制劑的濃度范圍為0-1 μ M。
9.根據(jù)權利要求6所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的步驟四中的聚陽離子的結構式為:
10.根據(jù)權利要求6所述的一種基于茈激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的步驟四的反應溫度為37°C，反應時間為5min。
【文檔編號】C12Q1/48GK103911454SQ201410149222
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權日:2014年4月14日
【發(fā)明者】于聰, 王燕, 陳健 申請人:中國科學院長春應用化學研究所