一種胃液中幽門螺桿菌多重實時熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胃液中幽門螺桿菌多重熒光定量PCR檢測方法，本發(fā)明所述方法包括用于檢測幽門螺桿菌的特異性引物、探針，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:1，SEQ?ID?NO:2，SEQ?ID?NO:3，內參基因人上皮細胞核糖核酸酶P（Rnase?P）特異性引物、探針，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO:4，SEQ?ID?NO:5，SEQ?ID?NO:6，幽門螺桿菌陽性對照、內參基因陽性對照、陰性對照。本發(fā)明所述方法僅需要待檢者提供胃液，屬于非侵入性檢測，患者依從性好，檢測快速準確、樣品需求量?。▋H需10-500μl胃液），特異性強、靈敏度高，簡便快速的優(yōu)點，具有良好的臨床標本檢測能力。
【專利說明】—種胃液中幽門螺桿菌多重實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種胃液中幽門螺桿菌多重實時熒光定量(Real Time) PCR檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]1983年澳大利亞學者Warren和Marshal I首次從人胃黏膜標本中分離出幽門螺桿菌(Helicobacter pylroi,簡稱H.pylori或HP),是一種呈S形或弧形彎曲的革蘭氏陰性菌。研究表明，HP感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃黏膜相關性淋巴瘤有著密切的聯(lián)系。1994 年國際癌癥研究中心(international agency for research on cancer, IARC)將 HP列為I類致癌物。流行病學調查顯示，HP感染在世界各地均較為常見，具有很高的發(fā)病率。我國HP感染率40%-90%，平均59%。因此，HP感染的快速準確診斷對于下一步針對性的臨床治療具有重要意義。
[0003]目前HP感染的檢測主要分為侵入性和非侵入性兩類。(I)侵入性檢查:通過內窺鏡獲取胃粘膜組織作為實驗材料，進行微生物學培養(yǎng)、病理組織學檢測、快速尿素酶試驗和基因診斷等；(2)非侵入性檢查:不需獲得胃粘膜組織，采用胃液、血清、唾液、糞便等標本，方法有糞便幽門螺桿菌抗原檢測、血清中幽門螺桿菌抗體檢測、尿素呼氣試驗和其他標本中幽門螺桿菌基因的測定。以上方法各有利弊，侵入性檢查方法在兒童不易接受及普及，非侵入性檢查方法中，糞便抗原檢測對于已經(jīng)進行臨床治療的病例，不能得到滿意的結果；尿素呼氣試驗中，尿素酶的活性常受口咽部尿素酶陽性細菌的影響；由于幽門螺桿菌感染后數(shù)周血中才會出現(xiàn)特異抗體，且細菌根除后血中抗體可維持6個月以上，因此血清幽門螺桿菌抗體檢測不主張用于臨床診斷。
[0004]實時熒光定量PCR因`其高靈敏度和高特異性的特點被廣泛應用于各種病原體的檢測，該方法能夠有效控制PCR產物的實驗室污染，更適合臨床實驗室常規(guī)檢測。目前，沒有報道針對胃液標本的實時熒光定量PCR的成熟、系統(tǒng)的檢測方法。本發(fā)明旨在提供一種通過實時熒光定量PCR方法從胃液標本中檢測HP的感染情況，包括胃液標本的預處理方法以及檢測所需最小胃液量。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術的不足，提供一種實時熒光定量PCR檢測胃液中幽門螺桿菌的方法，該方法僅需10-500 μ L的胃液，即可快速、準確、靈敏地檢測出胃液中幽門螺桿菌的存在。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對GenBank中已知幽門螺桿菌核苷酸序列的比對分析，找到幽門螺桿菌的cag PAI上的一段保守區(qū)cagH作為靶基因。這段基因的篩選來源于中國⑶C傳染病所診斷室對全國來源的74株HP菌株的cagPAI測序分析。這些菌株代表了中國的流行菌株。同時本發(fā)明選擇人上皮細胞核糖核酸酶P (Rnase P)作為內參基因。Rnase P基因常被用作從人體標本中檢測病原微生物的內參基因。這一基因的成功擴增，可以保證試驗中模板提取的正確性和初步估計模板的濃度。
[0007]幽門螺桿菌特異性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，與之配套的特異性探針序列如SEQ ID N0:3所示。Rnase P內參基因引物序列如SEQ ID N0:4和SEQ IDNO:5所示,與之配套的特異性探針序列如SEQ ID N0:6所示。
[0008]所述用于實時熒光定量檢測幽門螺桿菌的引物的核苷酸序列為:
[0009]HP cag H 上游引物:5’ -TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’ (SEQ ID NO:1)
[0010]HP cag H 下游引物:5’ -CGCTTCTCAAATGATACTTAATCAATC-3’ (SEQ ID NO: 2)
[0011]與上述引物配合使用的探針核苷酸序列為:
[0012]HP cag H 熒光探針:5’ -FAM-AGGTGCTAGTAGCTAATC-BHQ1-3，(SEQ ID NO: 3)
[0013]該探針5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團BHQ
[0014]所述用于實時突光定量檢測Rnase P內參基因的引物的核苷酸序列為:
[0015]RnaseP 上游引物:5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’ (SEQ ID NO:4)
[0016]RnaseP 下游引物:5，-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3，(SEQ ID NO:5)
[0017]與上述引物配合使用的探針核苷酸序列為:
[0018]RnaseP 熒光探針:5’-HEX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3’ (SEQ ID NO: 6)該探針5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團BHQ1。
`[0019]本發(fā)明提供一種胃液中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，包括前處理:取10yL-500yL胃液，加入等量的Tris緩沖液(0.67M，PH7.4)，振蕩均勻，室溫孵育2h。13000rpm離心5min，棄上清留沉淀。QIAGEN DNA提取試劑盒進行核酸提取，以樣品總DNA為模板，以本發(fā)明提供的相應的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設立陽性對照和陰性對照，根據(jù)擴增曲線判定結果。
[0020]在有效擴增的情況下，樣品檢測結果可信，否則試驗需要重復；在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下:
[0021]Ct值小于等于38的標本為陽性結果；
[0022]Ct值大于40的標本為陰性結果；
[0023]Ct值在38-40之間的標本需要重復，重復試驗如Ct值依然低于40判定為陽性擴增，超過40判定為陰性擴增。
[0024]本發(fā)明的實時熒光定量PCR擴增反應體系，當為20 μ I反應體系時，其優(yōu)選配置為:
[0025]表1多重實時熒光定量PCR最優(yōu)體系
【權利要求】
1.一種多重實時熒光定量PCR檢測胃液中幽門螺桿菌的試劑盒，其特征在于，每一體系包括兩條探針，一種用于檢測幽門螺桿菌的特異性探針，其具有SEQ ID N0.3所示的序列；一種用于檢測人上皮細胞核糖核酸酶P (Rnase P)特異性探針，其具有SEQ ID N0.6所示的序列。
2.一種如權利要求1所述的試劑盒，包括熒光定量反應試劑、特異性引物和探針、陽性質控品以及陰性質控品； 所述特異性引物和探針由幽門螺桿菌特異基因cag H和內參基因人上皮細胞核糖核酸酶P (RNase P)的特異性引物和探針組成:
3.如權利要求1所述的試劑盒，陽性質控品包括幽門螺桿菌特異基因cagH和內參基因人上皮核糖核酸酶P (RNase P)的標準品，陰性質控品為大腸桿菌，濃度均為I X IO6Copies/ μ I ； 所述陽性標準品的序列如下: 幽門螺桿菌特異基因cag H標準品:
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的試劑盒，其檢測方法包括:取10-500μ I胃液提取核酸，操作步驟按QIAGEN QIAamp DNA mini kit說明書； 以該核酸作為模板進行實時熒光定量PCR，根據(jù)擴增曲線判定結果。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，胃液提取方法為: 前處理:取10yL-500yL胃液，加入等量的Tris緩沖液(0.67M，PH7.4)，振蕩均勻，室溫孵育2h ;13000rpm離心5min,棄上清留沉淀； 提取:QIAGEN DNA提取試劑盒進行核酸提取。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，實時熒光定量PCR反應體系為:
7.如權利要求4-6任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為:95°C預變性10min，l個循環(huán);95°C變性10s，58。。退火45s，45個循環(huán)。
8.前述任一項的試劑盒，其特征在于，根據(jù)擴增曲線判定結果: 在有效擴增的情況下，樣品檢測結果可信，否則試驗需要重復；在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結果判斷標準如下: Ct值小于等于38的標本為陽性結果； Ct值大于40的標本為陰性結果； Ct值在38-40之間的標本需要重復，重復試驗如Ct值依然低于40判定為陽性擴增，超過40判定為陰性擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866034SQ201410131855
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權日:2014年4月2日
【發(fā)明者】彭賢惠, 張建中, 何利華, 劉杰, 閆笑梅, 趙飛, 張茂俊, 顧一心 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所