鑒別肝素中牛基因來源的熒光pcr檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別肝素中?；騺碓吹臒晒釶CR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用，通過對(duì)?；虻臏y(cè)序和比對(duì)，提供了用于檢測(cè)肝素粗成品中牛成分來源的檢測(cè)方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針，對(duì)牛成分檢測(cè)的擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為92bp，本發(fā)明還提供了對(duì)牛基因進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒具有檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的標(biāo)本檢測(cè)能力。
【專利說明】鑒別肝素中?；騺碓吹臒晒釶CR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑，以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，在體內(nèi)外都有抗凝血作用。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析等。隨著藥理學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，肝素的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。
[0003]2010年我國肝素及其鹽的出口量創(chuàng)歷史新高，已躍居成為我國第一大西藥重點(diǎn)出口商品。2010年，我國肝素及其鹽共出口到51個(gè)國家和地區(qū)，出口集中度很高，前五大出口市場(chǎng)為法國、美國、德國、奧地利和意大利，所占出口比重累計(jì)高達(dá)86.32%。肝素原料藥可直接被用于制成標(biāo)準(zhǔn)肝素制劑，或進(jìn)一步加工制成低分子肝素原料藥再制成低分子肝素制劑。標(biāo)準(zhǔn)肝素制劑和低分子肝素制劑可直接應(yīng)用于臨床治療。肝素類產(chǎn)品主要包括肝素粗品、肝素原料藥、標(biāo)準(zhǔn)肝素制劑、低分子肝素原料藥以及低分子肝素制劑。
[0004]由于肝素類藥物主要是運(yùn)用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中在血液透析重癥治療中是唯一有效的特效藥物，其使用者集中于老齡和肥胖人群，主要消費(fèi)市場(chǎng)分布集中在歐洲、美國和日本等發(fā)達(dá)國家。國際市場(chǎng)對(duì)肝素原料藥的需求十分強(qiáng)勁，主要是由于其下游產(chǎn)品肝素類藥物市場(chǎng)迅速擴(kuò)容，并保持高速增長趨勢(shì)。預(yù)計(jì)到2015年，全球肝素類藥品的市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到79億美元，這意味著全球醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)肝素的需求仍將強(qiáng)勁增長。但是2008年的“肝素鈉事件”發(fā)生后全球肝素類藥物企業(yè)高度關(guān)注肝素鈉原料藥的質(zhì)量，對(duì)通過FDA和CEP認(rèn)證的肝素鈉原料藥需求量大幅增加，而那些不具備這項(xiàng)質(zhì)量認(rèn)證的企業(yè)今后將無法立足國際市場(chǎng)。因此，對(duì)于肝素鈉的質(zhì)量檢測(cè)成為了一個(gè)熱點(diǎn)問題，新版藥典中對(duì)于肝素鈉的來源檢測(cè)做出了明確規(guī)定，原因如下:
[0005]肝素首先從肝臟發(fā)現(xiàn)而得名，它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是動(dòng)物體內(nèi)一種天然抗凝血物質(zhì)。天然存在于肥大細(xì)胞，現(xiàn)在主要從牛肺或豬小腸粘膜提取。但是由于牛等反芻動(dòng)物可能攜帶致病性朊蛋白，從而患傳染性海綿狀腦病(俗稱羊瘙癢病和瘋牛病)。人類可能被攜帶病毒的動(dòng)物傳染而患新型克雅氏癥。由于牛海綿狀腦病以及其他動(dòng)物病毒疾病的存在，豬來源的唯一性就成為了確保肝素安全性的一條關(guān)鍵要求。因此，為確保肝素供應(yīng)鏈的安全，各國在肝素進(jìn)口方面明確要求肝素原料藥不允許來自于牛，同時(shí)加大了對(duì)中國出口肝素產(chǎn)品的質(zhì)量、來源等方面的質(zhì)量要求和抽檢力度。故開發(fā)一種高效的檢測(cè)肝素來源的試劑及方法顯得尤為必要。
[0006]目前，粗品肝素中有害雜 質(zhì)的檢測(cè)方法主要有核磁共振、高效液相色譜等方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，PCR技術(shù)得到了快速發(fā)展。由于肝素在制備的過程中需要經(jīng)過多次提取與純化，當(dāng)中的DNA會(huì)受到影響而降解為許多小片段，如果檢測(cè)目的片段太大，可能在檢測(cè)中無法發(fā)現(xiàn)陽性片段。而受電泳檢測(cè)有效性的限制，一般PCR難以采納小片段目的產(chǎn)物。中國專利申請(qǐng)?zhí)?00810123709.5由黃亞紅、侯亞義等人公開了一種通過巢式PCR的方法鑒定肝素中動(dòng)物基因的來源。但一般的PCR方法需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳完成整個(gè)檢測(cè)，而且通過電泳條帶進(jìn)行檢測(cè)靈敏度偏低，當(dāng)樣品中基因濃度差異不大時(shí)，條帶亮度很難反應(yīng)出差異，進(jìn)而影響對(duì)肝素中?；蛴袩o的判斷。而且凝膠電泳檢測(cè)會(huì)延長整個(gè)檢測(cè)時(shí)間，拖延檢測(cè)進(jìn)度。因此，這種方法存在著檢測(cè)靈敏度低、操作復(fù)雜等問題。中國專利申請(qǐng)?zhí)?00910094768.9公開的鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用的發(fā)明專利中，涉及了一種能同時(shí)鑒別包含牛、山羊及綿羊三種反芻動(dòng)物品種的生物檢測(cè)試劑，以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。但此體系并不適用于肝素中?；虻臋z測(cè)，主要原因可以歸納為以下三點(diǎn):1)經(jīng)多人的研究結(jié)果表明，肝素多糖對(duì)于PCR擴(kuò)增酶有抑制作用，不能直接用于real-time PCR實(shí)驗(yàn),必須經(jīng)過一定的處理才可行；2)此專利中方法較為復(fù)雜，多重PCR不利于肝素中牛基因的檢測(cè)；3)此外這種方法的反應(yīng)體系為50 μ 1，對(duì)試劑的消耗較大，大大提高了檢測(cè)成本，不利于實(shí)現(xiàn)企業(yè)規(guī)?；瘷z測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種能鑒別檢測(cè)肝素粗制樣品的來源組成(牛基因)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用TaqMan熒光定量PCR方法克服了普通PCR的不足之處，是檢測(cè)肝素原料藥中的反芻動(dòng)物基因的最佳方法，具有靈敏度高、線性范圍廣、分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、結(jié)果直觀等特點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測(cè)試劑，包括一對(duì)引物和一條TaqMan探針，所述一對(duì)引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探針是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0010]進(jìn)一步的，所述TaqMan探針SEQ ID N0.3的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接
有淬滅集團(tuán)。
[0011]進(jìn)一步的，所述5’端連接的熒光報(bào)告集團(tuán)為6-羧基熒光素(FAM)，所述3’端連接的淬滅集團(tuán)為6-羧基四甲基諾丹明(TAMRA)。上述的FAM全稱為6_carboxy-f Iuorescein,是標(biāo)記在探針5’端的6_羧基突光素；TAMRA的全稱為Carboxytetramethylrhodamine,是標(biāo)記在探針3端的6-羧基四甲基諾丹明。
[0012]本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0013]一種鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0014]I)選擇牛線粒體基因中特異和保守的BOV-A2基因的保守序列片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為SEQ ID N0.4；
[0015]2)根據(jù)牛特異和保守的線粒體基因保守序列的特點(diǎn),應(yīng)用Primer Express3.0軟件和DNAStar中的PrimerSelect軟件,設(shè)計(jì)合成待測(cè)引物和探針；
[0016]3)引物和探針的合成使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；
[0017]4)探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM (6_羧基熒光素)，3’端標(biāo)記的基團(tuán)是TAMRA (6-羧基四甲基諾丹明)；
[0018]5)將設(shè)計(jì)合成的引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，得到上述的引物和探針。[0019]所述的鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑的應(yīng)用，所述一種鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測(cè)試劑可用于制備熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒。
[0020]本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0021]一種鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0022]A.待檢測(cè)肝素的前處理
[0023](I)將粉末狀肝素樣品0.03g加至滅菌離心管中，向管中加入1ml無酶水，振蕩混勻，離心機(jī)3500rpm,30s, 100°C水浴5min,放冷至室溫；
[0024](2)槍頭反復(fù)吸取攪拌至樣品溶解，從溶解的樣品溶液中取10 μ I至一新的滅菌離心管中，再加入990 μ I無酶水，振蕩混勻，用Iml注射器使溶液通過45 μ m微孔濾膜過濾；
[0025](3)從上一步得到的溶液中取45 μ I溶液，加入0.7μ I試劑肝素酶，振蕩混勻，28°C水浴18h，得到待測(cè)肝素樣品；
[0026]B.熒光定量PCR
[0027](I) PCR反應(yīng)體系
[0028]突光定量PCR采用25 μ I體積反應(yīng)液,反應(yīng)擴(kuò)增體系與擴(kuò)增條件按下述反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行:
[0029]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25 μ I,向反應(yīng)管中加入下列組分,反應(yīng)體系為:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑，包括一對(duì)引物和一條TaqMan探針，其特征在于，所述一對(duì)引物分別是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探針是SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑，其特征在于，所述TaqMan探針SEQ ID N0.3的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接有淬滅集團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑，其特征在于，所述5’端連接的熒光報(bào)告集團(tuán)為6-羧基熒光素，所述3’端連接的淬滅集團(tuán)為6-羧基四甲基諾丹明。
4.一種如權(quán)利要求1所述的鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟: 1)選擇牛線粒體基因中特異和保守的B0V-A2基因的保守序列片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為SEQ ID N0.4 ； 2)根據(jù)牛特異和保守的線粒體基因保守序列的特點(diǎn)，應(yīng)用PrimerExpress3.0軟件和DNAStar中的PrimerSelect軟件,設(shè)計(jì)合成待測(cè)引物和探針； 3)引物和探針的合成使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成； 4)探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)是TAMRA (6-羧基四甲基諾丹明)； 5)將設(shè)計(jì)合成的引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，得到上述的引物和探針。
5.一種如 權(quán)利要求1所述的鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑的應(yīng)用，所述一種鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)試劑可用于制備熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒。
6.一種鑒別肝素中?；騺碓吹纳餀z測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟: A.待檢測(cè)肝素的前處理 (1)將粉末狀肝素樣品0.03g加至滅菌離心管中，向管中加入1ml無酶水， 振蕩混勻，離心機(jī)3500rpm,30s, 100°C水浴5min,放冷至室溫； (2)槍頭反復(fù)吸取攪拌至樣品溶解，從溶解的樣品溶液中取10μ I至一新的滅菌離心管中，再加入990 μ I無酶水，振蕩混勻，用Iml注射器使溶液通過45 μ m微孔濾膜過濾； (3)從上一步得到的溶液中取45μI溶液，加入0.7μ I試劑肝素酶，振蕩混勻，28°C水浴18h，得到待測(cè)肝素樣品； B.熒光定量PCR (I)PCR反應(yīng)體系 熒光定量PCR采用25 μ I體積反應(yīng)液，反應(yīng)擴(kuò)增體系與擴(kuò)增條件按下述反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25 μ I,向反應(yīng)管中加入下列組分,反應(yīng)體系為:
Μ?Χ|12.5μ I
上游引物F 0.5μ1
下游引物R 0.5μ I
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103937881SQ201410115327
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】李曄, 全爽, 金麗華 申請(qǐng)人:北京電子科技職業(yè)學(xué)院