一種抗菌肽活性檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種瓊脂溶液，它包括瓊脂與強(qiáng)堿，其中，瓊脂的濃度為2～3%（w/v），強(qiáng)堿的濃度不低于0.8mol/L。本發(fā)明還提供了包含前述瓊脂溶液的檢測試劑盒，以及該試劑盒的檢測方法。采用本發(fā)明試劑盒檢測抗菌肽活性，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對實(shí)驗條件的要求低，操作簡便，普通人即可使用，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說明】一種抗菌肽活性檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗菌肽活性檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽的活性檢測通常采用管碟法，管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品兩者對指示菌的抑菌圈大小來測定待檢品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置牛津杯，杯內(nèi)放入標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品的溶液，經(jīng)16~18小時恒溫培養(yǎng)，抗生素擴(kuò)散的有效范圍內(nèi)則產(chǎn)生透明的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。抑菌圈直徑大小與抗生素效價相關(guān)，比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。[0003]使用管碟法進(jìn)行檢測時，需要制備新鮮的瓊脂溶液，即將瓊脂粉加熱至95°C以上制成瓊脂溶液，滅菌后，降低溫度，在適當(dāng)溫度下加入指示菌進(jìn)行檢測。然而，對于試驗條件比較差或者完全沒有實(shí)驗操作能力的人員來說，難以有效滅菌，同時，因凝膠溶液降溫至400C以下時形成凝膠，而大部分細(xì)菌生長繁殖的適宜溫度通常為20~40°C，若在40°C以下加入指示菌，則指示菌與凝膠狀的瓊脂不能有效混勻，導(dǎo)致指示菌分布不均，致使檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，若在40°C以上加入指示菌，將導(dǎo)致指示菌難以有效生長，降低檢測效率或者導(dǎo)致檢測失敗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的瓊脂溶液，以及包含該瓊脂溶液的抗菌肽活性檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明瓊脂溶液，它包括瓊脂與強(qiáng)堿，其中，瓊脂的濃度為2~3%(w/v)，強(qiáng)堿的濃度不低于0.8mol/L。
[0006]w/v,即 g/ml。
[0007]強(qiáng)堿，溶于水能發(fā)生完全電離的堿，如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、。
[0008]其中，所述瓊脂的濃度為3% (w/v)。
[0009]其中，所述強(qiáng)堿為氫氧化鈉，濃度不低于1.0mol/Lo
[0010]其中，所述強(qiáng)堿為氫氧化鉀，濃度為0.8~1.0mol/Lo
[0011]本發(fā)明還提供了一種制備前述瓊脂溶液的方法，步驟如下:按照前述配比取原料，混勻，滅菌，即可。
[0012]本發(fā)明抗菌活性檢測試劑盒，可用于檢測品(如，抗菌肽)的抗菌活性，它包括如下組分:
[0013]指示菌；
[0014]營養(yǎng)液:指示菌的液體培養(yǎng)基；
[0015]基質(zhì)液:前述瓊脂溶液；
[0016]稀釋液:強(qiáng)酸溶液。[0017]強(qiáng)酸，溶于水能發(fā)生完全電離的酸，如，磷酸、鹽酸或者硝酸、硫酸。
[0018]其中，所述指示菌中，活菌數(shù)為IO7~IO8個/g。
[0019]其中，所述指示菌為大腸桿菌時，營養(yǎng)液是LB液體培養(yǎng)基。
[0020]LB液體培養(yǎng)基，大腸桿菌常用的培養(yǎng)基，其制備方法:取胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化鈉(NaCl) IOg,定容至 1L,調(diào) ρΗ7.0,121°C滅菌15分鐘，即得。
[0021]優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸溶液是磷酸溶液、鹽酸溶液或者硝酸溶液。
[0022]優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸溶液的濃度為0.3~0.4mol/L。
[0023]本發(fā)明使用前述試劑盒檢測樣品(如，抗菌肽)的抗菌活性的方法，包括如下步驟:
[0024]( I)取待檢樣品，制成樣品溶液；
[0025](2)取指示菌，加入營養(yǎng)液，制成菌懸液；
[0026](3)在溫度大于等于20°C的條件下，往基質(zhì)液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟(2)的菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中；
[0027](4)待培養(yǎng)皿中的溶液凝固后，倒置培養(yǎng)，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟(1)制備的樣品溶液，培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小，即可。
[0028]本發(fā)明瓊脂溶液pH值高，不易染菌，可以長時間放置，用于抗菌肽檢測時，無需滅菌，對實(shí)驗條件和實(shí)驗者操作技巧的要求低，同時，其在溫度為20°C時，即呈液態(tài)，在較低溫度(20°C )下加入指示菌也可以充分混勻，能夠在保證指示菌與瓊脂溶液混勻的同時維持指示菌的正常生長。采用本發(fā)明試劑盒檢測抗菌肽活性，無需配制新鮮瓊脂溶液，對實(shí)驗條件的要求低，操作簡便，普通人即可使用，實(shí)用性強(qiáng)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有良好的應(yīng)用前
旦
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[0029]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0030]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1本發(fā)明檢測方法可靠性的結(jié)果圖【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1本發(fā)明瓊脂溶液的制備
[0032]取瓊脂粉，制成濃度為2% (g/ml)的瓊脂溶液，加入氫氧化鉀至濃度為0.8mol/L,混勻，滅菌，即可。
[0033]實(shí)施例2本發(fā)明瓊脂溶液的制備
[0034]取瓊脂粉，制成濃度為2% (g/ml)的瓊脂溶液，加入氫氧化鈉至濃度為lmol/L，混勻，滅菌，即可。
[0035]實(shí)施例3本發(fā)明瓊脂溶液的制備
[0036]取瓊脂粉，制成濃度為3% (g/ml)的瓊脂溶液，加入氫氧化鉀、氫氧化鈉至濃度分別為0.8mol/L和lmol/L,混勻，滅菌，即可。[0037]實(shí)施例4本發(fā)明抗菌肽檢測試劑盒的組成及檢測方法
[0038]1、檢測試劑盒的組成
[0039]指示菌:活菌數(shù)為IO7~IO8個/g大腸桿菌制劑。
[0040]營養(yǎng)液:指示菌的液體培養(yǎng)基，如，LB液體培養(yǎng)基，制備方法:將胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化鈉(NaCl) IOg,定容至 1L,調(diào) ρΗ7.0,121°C滅菌15分鐘。
[0041]基質(zhì)液:實(shí)施例1的瓊脂溶液；
[0042]稀釋液:硝酸溶液，濃度為0.4mol/L。
[0043]2、檢測方法
[0044]( I)取待檢抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0045](2)取菌制劑，加入營養(yǎng)液，制成菌懸液；
[0046](3)在溫度大于等于20°C的條件下，往基質(zhì)液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟(2)的菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中；
[0047](4)待培養(yǎng)皿中的溶液凝固后，倒置培養(yǎng)，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟(1)制備的抗菌肽溶液，培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小，即可。
[0048]實(shí)施例5本發(fā)明抗菌肽檢測試劑盒的組成及檢測方法
[0049]1、檢測試劑盒的組成
[0050]指示菌:活菌數(shù)為IO7~IO8個/g大腸桿菌制劑。
[0051]營養(yǎng)液:指不菌的液體培養(yǎng)基，如，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，制備方法:取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，定容至1L，調(diào)ρΗ7.4~7.6，121°C滅菌15分鐘。
[0052]基質(zhì)液:實(shí)施例2的瓊脂溶液； [0053]稀釋液:磷酸溶液，濃度為0.3mol/L。
[0054]2、檢測方法
[0055]( I)取待檢抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0056](2)取菌制劑，加入營養(yǎng)液，制成菌懸液；
[0057](3)在溫度大于等于20°C的條件下，往基質(zhì)液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟(2)的菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中；
[0058](4)待培養(yǎng)皿中的溶液凝固后，倒置培養(yǎng)，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟(1)制備的抗菌肽溶液，培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小，即可。
[0059]實(shí)施例6本發(fā)明抗菌肽檢測試劑盒的組成及檢測方法
[0060]1、檢測試劑盒的組成
[0061]指示菌:活菌數(shù)為107~108個/g大腸桿菌制劑。
[0062]營養(yǎng)液:指不菌的液體培養(yǎng)基，如，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，制備方法:取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，定容至1L，調(diào)ρΗ7.4~7.6，121°C滅菌15分鐘。
[0063]基質(zhì)液:實(shí)施例3的瓊脂溶液；
[0064]稀釋液:鹽酸溶液，濃度為0.4mol/L。
[0065]2、檢測方法
[0066]( I)取待檢抗菌肽，制成抗菌肽溶液；
[0067](2)取菌制劑，加入營養(yǎng)液，制成菌懸液；[0068](3)在溫度大于等于20°C的條件下，往基質(zhì)液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟(2)的菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中；
[0069]( 4 )待培養(yǎng)皿中的溶液凝固后，倒置培養(yǎng)，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟(1)制備的抗菌肽溶液，培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小，即可。
[0070]實(shí)施例7本發(fā)明試劑盒中的基質(zhì)液(瓊脂溶液)的組成篩選試驗
[0071]一、強(qiáng)堿的種類和用量選擇
[0072]1、試驗方法
[0073]將2%濃度的瓊脂溶液中加入不同濃度梯度的NaOH或KOH溶液，混合均勻后，待冷卻至15°C或20°C下時觀察瓊脂的凝固狀態(tài)，然后將處理后的瓊脂再放入90°C的水中水浴加，觀察瓊脂熔化狀態(tài)。
[0074]2、試驗結(jié)果
[0075]實(shí)驗結(jié)果如表1所示:
[0076]表1不同濃度的強(qiáng)堿處理后的瓊脂凝固狀態(tài)
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種瓊脂溶液，其特征在于:它包括瓊脂與強(qiáng)堿，其中，瓊脂的濃度為2~3%(w/v)，強(qiáng)堿的濃度不低于0.8mol/Lo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于:所述瓊脂的濃度為3%(w/v)0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于:所述強(qiáng)堿為氫氧化鈉，濃度不低于 1.0mol/Lo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于:所述強(qiáng)堿為氫氧化鉀，濃度為0.8~ 1.0mol/Lo
5.一種制備權(quán)利要求1~4任意一項所述瓊脂溶液的方法，其特征在于:步驟如下:按照權(quán)利要求1~4任意一項所述配比取原料，混勻，滅菌，即可。
6.一種檢測抗菌活性的試劑盒，其特征在于:它包括如下組分: 指示菌； 營養(yǎng)液:指示菌的液體培養(yǎng)基； 基質(zhì)液:權(quán)利要求1~4任意一項所述的瓊脂溶液； 稀釋液:強(qiáng)酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述指示菌中，活菌數(shù)為IO7~IO8個/g ; 所述指示菌為大腸桿菌時，營養(yǎng)液是LB液體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述強(qiáng)酸溶液是磷酸溶液、鹽酸溶液或者硝酸溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述強(qiáng)酸溶液的濃度為0.3~0.4mol/L。
10.一種使用權(quán)利要求6~9任意一項所述試劑盒檢測抗菌活性的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取待檢樣品，制成樣品溶液； (2)取指示菌，加入營養(yǎng)液，制成菌懸液； (3)在溫度大于等于20°C的條件下，往基質(zhì)液中加入稀釋液至溶液pH為5-7，再加入步驟(2)的菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中； (4)待培養(yǎng)皿中的溶液凝固后,倒直培養(yǎng)，放入牛津杯，在牛津杯中加入步驟(1)制備的樣品溶液，培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小，即可。
【文檔編號】C12Q1/18GK103911423SQ201410103880
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】李鋼, 鄒輝琴, 溫靜 申請人:四川華德生物工程有限公司