影響豬肉脂肪酸組分的主效snp標記及其在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種影響豬肉脂肪酸組分的主效SNP標記，所述SNP標記位于豬SCD基因的核苷酸序列上，所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718核苷酸位點為C與T的突變，對應于SEQ?ID?NO:1上的第4513位，或所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963819核苷酸位點為C與G的突變，對應于SEQ?ID?NO:1上的第4614位，前述兩個位點完全連鎖；并且所述SNP標記能夠提高豬的單不飽和脂肪酸含量和/或降低飽和脂肪酸含量，所述單不飽和脂肪酸為C18:1和/或C16:1，所述飽和脂肪酸為C18:0和/或C16:0。本發(fā)明還相應提供一種位于豬14號染色體上的SCD基因的核苷酸序列，以及提供該SNP標記和核苷酸序列在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用。
【專利說明】影響豬肉脂肪酸組分的主效SNP標記及其在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物技術及動物遺傳育種領域，具體涉及鑒別能顯著提高商品豬肌肉不飽和脂肪酸C18:1和C16:1含量同時降低飽和脂肪酸C18:0和C16:0含量的主效基因標記及其在種豬肉質遺傳改良中的應用。
【背景技術】
[0002]脂肪酸(fatty acid)是指一端含有一個羧基的長脂肪碳氫鏈，是動植物脂肪組織、磷脂和糖脂的主要組成部分。按照碳鏈中的雙鍵數目，脂肪酸可分為飽和脂肪酸(不含雙鍵，SFA)、單不飽和脂肪酸(只含一個雙鍵，MUFA)和多不飽和脂肪酸(含有多個雙鍵，PUFA)ο豬肉中含有18種常見脂肪酸，其中含量最豐富的為C18:1、C16:0、C18:0、C18:2和C16:1等，這些脂肪酸的總含量占豬肌肉中總脂肪酸的90%以上。脂肪酸組成是影響豬肉營養(yǎng)、風味和加工的重要因素。一般來說，飽和脂肪酸(SFA)特別是C12:0、C14:0和C16:0會促使人體血液中低密度脂蛋白和總膽固醇含量的升高，引發(fā)心腦血管疾病，對人體健康極為不利；然而不飽和脂肪酸如C16:1、C18:1、18:2和C18:3有助于降低人體血液中低密度脂蛋白和總膽固醇含量、提高免疫力和降低癌癥風險，因此，優(yōu)化豬肉中脂肪酸組成可以提高豬肉營養(yǎng)水平并且有益于人類健康。
[0003]檢測豬肉脂肪酸組成需要將生豬進行屠宰測定，成本昂貴，且不能實現個體的直接選擇，這使得基于家系和表型測定的傳統育種效率低下。而通過尋找引起豬肉脂肪酸組成差異的主效基因及其關鍵變異位點，并利用這些位點作為分子標記選擇脂肪酸組成優(yōu)異的豬種來生產，不需要詳細的系譜記錄和后代表型信息，且可實現早期選種，能極大提高種豬肉質遺傳改良的效率。
[0004]鑒定主效基因突變位點是實現現代分子育種的必要前提，在家畜中實現這一目的通常需要經過數量性狀位點(QTL)定位、后裔同源染色體(IBD)精細定位、eQTL定位、置信區(qū)間的重測序、多態(tài)位點的搜尋以及大群體關聯驗證分析等一系列的研究。定位豬肌肉脂肪酸含量QTL的研究始于2000年,西班牙Perez-Enciso小組利用伊比利亞黑豬X長白豬的F2資源群體，在豬4號染色體上定位了顯著影響C18:2含量的QTL。該小組在2003年利用同一個群體進行全基因組QTL掃描，并在8號染色體上發(fā)現影響C16:0和C16: 1，10號染色體上影響C14:0含量的多個QTL。此后，多個研究小組對肌肉和脂肪組織的脂肪酸含量組成進行了全基因組QTL定位。
[0005]發(fā)明人利用一個大規(guī)模白色杜洛克X 二花臉F2資源群體開展了全基因組QTL定位研究，并在4、7、8和X號染色體上定位了多個效應顯著的QTL。從國際豬QTL數據庫網站(http://www.animalgenome.0rg/cgi_bin/QTLdb/SS/index)可知，目前在豬所有染色體上都已定位到影響 脂肪酸組成的QTL，但大部分是利用微衛(wèi)星標記定位的QTL，置信區(qū)間多在10-20cM，無法確定真正的主效基因及其關鍵變異位點，因此難以直接應用于種豬選育改良。
【發(fā)明內容】

[0006]因此，本發(fā)明提供一種影響豬肉脂肪酸組分的主效SNP標記，所述SNP標記位于豬14號染色體上的硬脂酰輔酶A脫氫酶基因(SCD基因)的核苷酸序列上，所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718核苷酸位點，且其為C與T的突變，對應于SEQ ID NO:1上的第4513位，或所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963819核苷酸位點，且其為C與G的突變，對應于SEQ ID NO:1上的第4614位，前述兩個位點完全連鎖；并且所述SNP標記能夠提高豬的單不飽和脂肪酸含量和/或降低飽和脂肪酸含量，所述單不飽和脂肪酸為C18:1和/或C16:l，所述飽和脂肪酸為C18:0和/或C16:0。
[0007]本發(fā)明通過現代分子生物學技術檢測這兩個關鍵標記位點的基因型，判定攜帶增加不飽和脂肪酸含量并降低飽和脂肪酸含量有利等位基因的個體。
[0008]本發(fā)明還相應提供一種鑒定如上所述的SNP標記的引物，所述引物的序列如SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
[0009]本發(fā)明還提供一種如上所述的SNP標記在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用，且所述種豬肉質性狀遺傳改良包括提高豬的單不飽和脂肪酸含量和/或降低飽和脂肪酸含量。根據該應用，優(yōu)選所述種豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
[0010]本發(fā)明中，利用所鑒別的主效標記信息開展種豬選育，利用標記輔助選擇(MAS)選擇有利基因型個體留種生產，以提高種豬豬肉的不飽和脂肪酸含量并降低飽和脂肪酸含量改良豬肉品質。
[0011]本發(fā)明還提供一種與S⑶基因中所述SNP標記的連鎖不平衡程度(r2)大于0.8的SNP分子標記在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用。
[0012]本發(fā)明提供一種種豬遺傳改良的方法，包括，種豬繼代選育國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718位點的TT型個體和/或其g.120963819位點的GG型個體，淘汰g.120963718位點的TC基因型和CC基因型個體和/或淘汰g.120963819位點的GC基因型和CC基因型個體。
[0013]本發(fā)明中，還提供一種檢測豬的生產性狀的方法，包括檢測序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4513位核苷酸為C還是T，或者檢測檢測序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4614位核苷酸為C還是G，確定基因型，然后通過基因型確定生產性狀；且所述豬的生產性狀為單不飽和脂肪酸C18:1和/或C16:1含量的高低，或為飽和脂肪酸C18:0和/或C16:0含
量的高低。
[0014]本發(fā)明又提供一種位于豬14號染色體上的SCD基因的核苷酸序列，所述序列為SEQ ID NO:1的第4513位由C突變?yōu)門且其4614位由C突變?yōu)镚而得的序列；對應于國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718位點由C突變?yōu)門且其g.120963819位點由C突變?yōu)镚而得的序列。
[0015]本發(fā)明相應提供一種如上所述的核苷酸序列或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在與豬肉中單不飽和脂肪酸C18:1含量相關的種豬選育中的應用，優(yōu)選所述種豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
[0016] 本發(fā)明還提供一對擴增SCD基因核苷酸序列片段的引物，其中，上游引物的序列為如SEQ ID N0:2所示的序列，下游引物的序列為如SEQ ID N0:3所示的序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為染色體上影響豬肌肉C18:0含量的GWAS定位結果示意圖。其中，圖1a為白色杜洛克豬X 二花臉豬F2群體的GWAS定位結果，圖1b為蘇太豬群體的GWAS定位結果，圖1c為兩個群體GWAS薈萃分析(meta-analysis)結果。其中,豬的18條常染色體信息標識于X軸，SNP與C18:0相關性的-1oglO(P)值按SNP在基因組中的位置顯示于Y軸。橫虛線表示的是染色體顯著水平閾值，橫實線表示的是基因組顯著水平的閾值。
[0018]圖2為豬14號染色體上影響豬肌肉C18:0含量QTL精細定位和S⑶主效基因鑒別示意圖。在圖2的上半部分中，曲線條表示在白色杜洛克X 二花臉F2群體和蘇太豬群體中采用連鎖不平衡/連鎖(LDLA)定位分析結果，點表示GWAS分析結果，兩條曲線線條中位于上方的一條表不F2群體,位于下方的一條表不蘇太群體,米用-1oglO(P)值下降2確定的置信區(qū)間用陰影表示。在圖2的下半部分中，該表格展示的是置信區(qū)間內所有11個位置候選基因表達量與C16:0、C16:1、C18:0和C18:1脂肪酸含量的相關性分析，表格中數字為Pearson相關系數，星號表示相關性對應的顯著性P值小于0.05，從中可見S⑶基因表達量與C18:0含量的關聯性最強。[0019]圖3為S⑶基因結構示意圖及12個候選主效突變位點在S⑶基因的物理位置，以及部分候選主效突變位點的生物信息學功能分析圖。圖3具體分為三部分。其中，最上部分為S⑶的基因結構圖，它包括6個外顯子、5’ UTR區(qū)、3’ UTR區(qū)和啟動子區(qū)，且12個候選主效突變位點標識在相應的位置上(最上方的長橫線上連接的12根短豎線表示)。中間部分為2個最有可能的主效突變位點在哺乳動物中的序列比對保守性分析。最下部分為利用UCSC網站查看相應人類SCD基因的生物信息學功能，其中2根長豎線為2個在豬基因組中的候選主效突變位點對應人類參考SCD基因序列的相應位置。
[0020]圖4為SCD基因兩個主效突變位點(g.120963718和g.120963819)不同基因型的Sanger測序結果峰圖。
【具體實施方式】
[0021]實驗豬群:本發(fā)明共使用了三種豬實驗群體:白色杜洛克豬X 二花臉豬&資源群體、蘇太豬(50%杜洛克豬和50%太湖豬血緣)群體和三元雜(杜洛克豬X (長白豬X大白豬))群體。
[0022]白色杜洛克豬X 二花臉豬F2資源群體以2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母豬為祖代繁殖F1代，選9頭F1代公豬與59頭F1母豬交配，分6批次產生1912頭F2代個體，將這些個體飼養(yǎng)至240日齡屠宰。
[0023]蘇太豬是一個中國培育品種，由中國太湖豬和西方杜洛克豬雜交并經過超過18個世代的培育而成(各含50%太湖豬和50%杜洛克豬的血緣)；本發(fā)明所利用的蘇太豬群是由4頭蘇太公豬與55頭蘇太母豬交配獲得的461頭后代，其中421頭在240±3日齡屠宰。
[0024]杜長大三元雜交商品豬來自南昌蔣巷鎮(zhèn)江西國鴻有限公司屠宰場，分多個批次屠宰并取602頭195±3日齡的三元雜商品豬的背最長肌樣本。三個豬群體均使用統一的飼料進行喂養(yǎng)，控制飼料對脂肪酸組成的影響。[0025]脂肪酸組分的檢測:取屠宰個體左半邊胴體的第5至第6根胸椎處背最長肌樣品約log。使用氯仿甲醇溶液(3:1)提取總脂肪，送至江西省分析測試中心，用正己烷溶解總脂肪，在0.4mol KOH的甲醇溶液中進行甲酯化，最后使用氣相色譜儀(GC-2010plus，日本島津)進行檢測。通過脂肪酸色譜峰圖和脂肪酸標準溶液各成分的出峰時間對比確定脂肪酸成分，采用面積歸一法計算各脂肪酸成分的百分含量。
[0026]實施例1
[0027]本實施例為具體解釋得到本發(fā)明中SNP位點的發(fā)明過程。
[0028]豬全基因組6萬個(60K)SNP基因型檢測:從上述3個實驗群體中的每個個體采集一小塊耳組織樣，利用標準苯酚-氯仿法提取全基因組DNA，經過Nanodrop-100分光光度計檢測質量后統一將濃度稀釋至50ng/ul,在Illumina Beadstation平臺上根據公司標準流程進行豬全基因組60K SNP (Illumina，美國)基因型判定。利用PLINK (1.07)對所有樣本60K芯片數據進行質量控制，剔除檢出率低于95%、家系孟德爾錯誤率高于0.1的個體；以及檢出率低于95%，最小等位基因頻率小于0.05和哈代-溫伯格平衡顯著性高于10_6的SNP標記。
[0029]全基因組關聯(GWAS)分析，精細定位及候選基因的確定:使用R軟件包GenABEL中的混合線性模型利用上述3個實驗群體所有個體的60K SNP標記基因型數據和脂肪酸組成表型數據進行GWAS分析，采用Bonfeironi法確定SNP與脂肪酸表型性狀關聯程度的顯著性閾值。白色杜洛克豬X 二花臉豬F2資源群體和蘇太豬群體的GWAS結果均顯示，豬14號染色體上存在與硬脂酸C18:0含量顯著相關的SNP位點(圖1)。在蘇太豬群體中，采用整合連鎖與連鎖不平衡分析(LDLA)法，利用DualPHASE軟件構建14號染色體SNP標記的單倍型并分析單倍型和表型之間的關聯性，通過最顯著位點的-1oglO (P)值下降2界定QTL的置信區(qū)間為1.4Mb，再通過基于單倍型效應估計的QTL基因型與SNP標記基因型的一致性分析，將該QTL位點確定在14號染色體上1.0Mb的范圍內。該區(qū)域對應于國際豬基因組參考序列(10.2 版本)14 號染色體上的 120546475(H3GA0042050)至 121556717(ASGA0066126)的區(qū)間，在區(qū)間內一共存在11個已注釋基因，分別為:NGRN、C10orf2、SCD、BL0ClS2、MRPL43、RPLP0、CHUK、CWE19L1、DNMBP、ERLINl 和 KAZALD1。利用白色杜洛克豬 X 二花臉豬 F2 資源群體中前期測量的600頭豬肌肉基因數字表達譜數據(digital gene expression,DGE),分析這11個基因與C18:0含量的相關性(spearman correlation),結果顯示S⑶基因表達水平與C18:0的相關性最強(圖2)，這表明SCD基因是該區(qū)域最有可能影響脂肪酸組成的因果基因(causative gene)。
[0030]目標基因重測序:S⑶基因是多不飽和脂肪酸合成的限速酶，催化肌肉中的飽和脂肪酸C16:0、C18:0分別轉化為C16:l、C18:l不飽和脂肪酸。該基因在哺乳動物中也與脂肪沉積性狀相關。S⑶基因長度約16.7Kb，共有6個外顯子。在Ensembl網站(http://asia.ensembl.0rg/index, html)下載豬硬脂酰輔酶A脫氫酶基因(SO))的基因組DNA序列，利用Primer3.0在線軟件(http://frod0.w1.mit.edu/)設計28對引物(見表1)，以白色杜洛克豬X 二花臉豬F2資源群體中經標記輔助分離分析確定QTL基因型為雜合子(Qq)的2頭H)公豬和QTL基因型為純合子(qq) 9頭H)母豬為模板，擴增SCD基因轉錄起始位點上游5kb和轉錄終止位點下游5kb區(qū)段。50ul的聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系中，包括IOOng的豬基因組DNA，2.5mM MgCl2,0.4mM dNTP，正反向引物各20pmol，2.5單位DNA聚合酶(Taq酶)及10*PCR buffer (緩沖液)(上海申能博彩有限公司)。PCR采用Touchdown程序，擴增條件為:94°C 5min ；94°C 30s，68°C(每個循環(huán)降 0.5°C)30s，72°C 60s。94V 30s,55V 30s, 72°C 60s, 18個循環(huán)；最后在72°C延伸lOmin。PCR擴增產物采用QIAquick DNA純化試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)純化后送至上海生工生物工程有限公司直接測序，測序結果利用公用的DNAStar的SeqMan軟件進行分析。共檢測到72個多態(tài)位點，其中包括70個SNP和兩個缺失插入位點。
[0031]表1
[0032]
【權利要求】
1.一種影響豬肉脂肪酸組分的主效SNP標記，其特征在于，所述SNP標記位于豬14號染色體上的硬脂酰輔酶A脫氫酶基因(SCD基因)的核苷酸序列上，所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718核苷酸位點，且其為C與T的突變，對應于SEQ ID NO:1上的第4513位，或所述SNP標記的位點為國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963819核苷酸位點，且其為C與G的突變，對應于SEQID NO:1上的第4614位，前述兩個位點完全連鎖；并且所述SNP標記能夠提高豬的單不飽和脂肪酸含量和/或降低飽和脂肪酸含量，所述單不飽和脂肪酸為C18:1和/或C16:1，所述飽和脂肪酸為C18:0和/或C16:0。
2.一種鑒定如權利要求1所述的SNP標記的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
3.—種如權利要求1所述的SNP標記在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用，且所述種豬肉質性狀遺傳改良包括提高豬的單不飽和脂肪酸含量和/或降低飽和脂肪酸含量。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述種豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
5.與權利要求1的S⑶基因中SNP標記的連鎖不平衡程度(r2)大于0.8的SNP分子標記在種豬肉質性狀遺傳改良中的應用。
6.一種種豬遺傳改良的方法，其特征在于，種豬繼代選育國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718位點的TT型個體和/或其g.120963819位點的GG型個體，淘汰g.120963718位點的TC基因型和CC基因型個體和/或淘汰g.120963819位點的GC基因型和CC基因型個體。
7.一種檢測豬的生產性狀的方法，包括檢測序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4513位核苷酸為C還是T，或者檢測檢測序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4614位核苷酸為C還是G，確定基因型，然后通過基因型確定生產性狀；且所述豬的生產性狀為單不飽和脂肪酸C18:1和/或C16:1含量的高低，或為飽和脂肪酸C18:0和/或C16:0含量的高低。
8.一種位于豬14號染色體上的S⑶基因的核苷酸序列，所述序列為SEQ ID NO:1的第4513位由C突變?yōu)門且其4614位由C突變?yōu)镚而得的序列；對應于國際豬基因組10.2版本參考序列豬14號染色體上g.120963718位點由C突變?yōu)門且其g.120963819位點由C突變?yōu)镚而得的序列。
9.一種如權利要求8所述的核苷酸序列或SEQ ID ΝΟ:1所示的核苷酸序列在與豬肉中單不飽和脂肪酸C18:1含量 相關的種豬選育中的應用，優(yōu)選所述種豬為杜洛克豬或含有杜洛克血緣的豬。
10.一對擴增SCD基因核苷酸序列片段的引物，其特征在于，上游引物的序列為如SEQID NO:2所示的序列，下游引物的序列為如SEQ ID NO:3所示的序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911373SQ201410100377
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權日:2014年3月18日
【發(fā)明者】任軍, 楊斌, 麻駿武, 張萬昌, 黃路生 申請人:江西農業(yè)大學