用于二惡英類物質生物檢測的重組載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組載體，具體涉及一種用于二惡英類物質生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質生物檢測方面的用途。
【專利說明】用于二惡英類物質生物檢測的重組載體
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體，具體涉及一種用于二惡英類物質生物檢測的重組載體以及包含該重組載體的細胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細胞在二惡英類物質生物檢測方面的用途。
【背景技術】
[0002]二惡英(Dioxin)是持久性有機污染物(POPs)的一種，以其強烈的毒性及對生物體巨大的危害而被稱為“世紀之毒”。[0003]就目前二惡英的檢測方法而言，一般來說有兩大類方法，即儀器分析法和生物分析法。上世紀90年代美國環(huán)境保護局公布的檢測二惡英的標準方法US EPA Methodl613和1618界定了用高分辨氣相色譜-高分辨質譜(HRGC-HRMS)聯(lián)機檢測二惡英，該方法也被公認為是鑒定和定量二惡英的“黃金標準”方法。這種方法雖然準確，但是成本高，檢測周期長，而且需要一定的專業(yè)技術人員，因此限制了這種方法的的應用性。
[0004]而生物檢測方法普遍具有價格低廉、高通量和便于推廣應用等特點，近年來在全球范圍內得到了飛速的發(fā)展和應用。如果從所使用的檢測體系來分類，生物檢測方法大致可以分為體內法和體外法兩大類。體內法是利用活體動物，比如說小鼠、斑馬魚等等，通過檢測其生物學標記物表達的變化或其生理指標的變化來檢測二惡英類化合物。雖然任何化合物毒性的最后確定都需要體內法，但這種方法費時費力費錢，并不適合大規(guī)模篩查。第二大類，就是體外法。簡單的講就是脫離動物活體，以細胞或者抗體等簡單的手段檢測二惡英的含量，狹義地講二惡英的生物分析方法就是指的體外法。在體外法中，又可以根據其基本原理分為兩大類:一類是基于二惡英毒性信號通路的，主要包括基于CYPlAl酶活的EROD法、和基于報告基因的CALUX法；另外一類是基于二惡英抗體酶聯(lián)免疫反應的，包括酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、熒光免疫測定法(DELFIA)等。而CALUX是這些生物檢測方法中最靈敏的，也是其中具有代表性的檢測方法之一。
[0005]CALUX法靈敏度高、通量高、便于操作，已在很多國家和地區(qū)得到了實際應用。目前發(fā)達國家包括美國、歐盟、日本相繼建立和完善了各國自己的基于該方法的標準，例如USEPA Method4435 ；EU Commission Regulation N01883/2006 等等。目前 CALUX 技術的最低檢測閾值(MDL)已經可以達到ΙρΜ，而半數(shù)效應濃度(EC50)則已經達到20pM，已經達到了儀器分析的靈敏度，顯示了其良好的應用價值。
[0006]CALUX法的基本原理是:二惡英進入細胞后與細胞質內的芳香烴受體(AhR)結合并活化該受體，活化的AhR進核并與芳香烴受體核轉位蛋白(ARNT)結合，而后AhR = ARNT異源二聚體可以直接充當轉錄因子結合于一些基因啟動子區(qū)中的二惡英反應元件(DRE)上從而調控這些基因的表達水平。在這些基因中，CYPlAl是目前公認的二惡英反應標記物。所以將CYPlAl啟動子中的富含DRE的區(qū)段克隆下來，并插入到小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子的調控區(qū)域，最后把這個重組啟動子構建于報告基因上游，那么二惡英就可以誘導報告基因的表達了，這就是CALUX法的基本原理。[0007]CALUX使用MMTV作為重組啟動子的骨架既有優(yōu)點又有缺點，優(yōu)點是MMTV本身是強啟動子所以在一定程度上可以放大二惡英反應的信號，缺點是MMTV啟動子區(qū)域很長，可能還會受到未知其他轉錄因子的調控，增加了該生物檢測系統(tǒng)的不確定性。而且在實際應用中，人們的確發(fā)現(xiàn)了利用該系統(tǒng)檢測一些環(huán)境樣品時其報告基因反應值高于飽和濃度二惡英標準品2，3，7,8-四氯二苯并二惡英(IODD)的反應值，這表明一些環(huán)境樣品中的確存在一些未知的化合物通過活化MMTV區(qū)段或其他區(qū)段而誘導了報告基因的表達。
[0008]根據二惡英類物質生物檢測的現(xiàn)狀并結合我國檢測設備和水平較落后的具體情況，仍需開發(fā)成本低廉、靈敏度高以及克服現(xiàn)有系統(tǒng)缺陷的生物報告檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的發(fā)明人經過大量實驗，提供了改進的二惡英類化合物生物報告檢測載體和細胞，由此完成了本發(fā)明。
[0010]本發(fā)明第一方面涉及重組載體，所述載體沿著其基因轉錄的方向可操作地連接有來源于CYPlAl啟動子的CYPlAl啟動子基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段，以及報告基因，所述CYPlAl啟動子基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段調節(jié)該報告基因的轉錄。
[0011]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的CYPlAl啟動子為哺乳動物CYPlAl啟動子，例如為小鼠、豚鼠或人的CYPlAl啟動子。在本發(fā)明的實施方案中，所述的CYPlAl啟動子為小鼠啟動子。
[0012]在本發(fā)明中，所述的CYPlAl啟動子基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段都來源于CYPlAl全長啟動子。
[0013]在本發(fā)明的實施方案中，所述啟動子基本區(qū)段包括啟動子核心啟動序列和近端啟動序列。
`[0014]在本發(fā)明的實施方案中，所述的二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段包含四個二惡英反應元件。
[0015]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段的序列為SEQ ID NO:8所示的序列；和/或所述二惡英反應元件的富集區(qū)段的序列為SEQ IDNO:9所不的序列。
[0016]在本發(fā)明中，所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和所述二惡英反應元件的富集區(qū)段之間的連接方式為本領域所公知，例如可以通過linker或酶切位點連接。在本發(fā)明的實施方案中，所述二惡英反應元件的富集區(qū)段位于CYPlAl啟動子的基本區(qū)段的上游方向。
[0017]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)的富集區(qū)段連接的序列為SEQ ID N0:10所示的序列。
[0018]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
[0019]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，所述載體含有螢火蟲熒光素酶基因。
[0020]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其是在pGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)的富集區(qū)段。[0021]在本發(fā)明的實施方案中，其是在多克隆位點連接有所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)的富集區(qū)段。
[0022]根據本發(fā)明第一方面任一項的重組載體，其中所述的pGL系列載體例如為pGL2、pGL3、pGL4 或pGL6。
[0023]在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3系列載體。在本發(fā)明的實施方案中，所述pGL系列載體為pGL3 — basic載體。
[0024]在本發(fā)明的實施方案中，所述重組載體為pCL-CRl。
[0025]本發(fā)明第二方面涉及重組細胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項的重組載體。
[0026]根據本發(fā)明第二方面任一項的重組細胞，所述細胞為哺乳動物細胞。
[0027]根據本發(fā)明第二方面任一項的重組細胞，其為重組肝源細胞，例如為重組肝癌細胞(例如!fepal、HePG2、SMMC-7721、BEL-7402, QGY-7701)，例如為重組!fepal 細胞。
[0028]在本發(fā)明中，所述肝源細胞是指來源于肝實質的 細胞。
[0029]本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
[0030]本發(fā)明第四方面涉及一種二惡英類化合物生物檢測方法，所述方法使用本發(fā)明第一方面任一項的重組載體或第二方面任一項的重組細胞的步驟。
[0031]根據本發(fā)明第三方面任一項的用途或者第四方面任一項的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3，7,8-四氯二苯并二惡英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物。
[0032]發(fā)明的有益效果
[0033]本發(fā)明采用CYPlAl的基礎啟動子與DRE富集區(qū)段連接作為熒光素酶報告基因的啟動子，構建了二惡英類物質生物檢測的重組載體，由于該啟動子未添加任何外源基因，更有利于二惡英類物質與二惡英反應元件的特異性結合，以盡可能模擬二惡英類物質暴露的真實情況；
[0034]同時，該組合啟動子的長度較短，且含有的DRE個數(shù)少于CYPlAl全長啟動子，但仍具有較好的靈敏度，因此在保證檢測靈敏度的同時可以降低非特異性序列與二惡英類物質的結合，從另一方面也提高了檢測特異性；
[0035]并且，在相同處理及儀器檢測條件下，熒光檢測強度(RLU)較目前常用的生物檢測載體提高了一個數(shù)量級，這樣可以降低對酶標儀檢測參數(shù)的要求，進而降低檢測成本，為實現(xiàn)檢測方法的大范圍推廣提供了更加有利的條件；
[0036]通過將DRE富集區(qū)段與CYPlAl啟動子基礎區(qū)段近距離連接得到的重組載體，與基于原始CYPlAl啟動子的重組載體相比。其具有更好的響應效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為pCL-CRl與pCL-FL構建示意圖；
[0038]圖2為pCL-CRl、pCL-FL和pGL6.1對T⑶D的反應，其中左側縱坐標為熒光強度，其單位為RLU，即相對發(fā)光值，右側縱坐標為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)；
[0039]圖3為pCL-CRl瞬轉Ifepal后對梯度濃度的T⑶D的反應，縱坐標為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)。
[0040]圖4為pCL-FL瞬轉Hepal后對梯度濃度的T⑶D的反應，縱坐標為熒光素酶水平相對于溶劑對照的倍數(shù)。
【具體實施方式】
[0041]下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
[0042]本發(fā)明中使用的縮寫，具有以下含義:AhR，芳基烴受體;ARNT，芳基烴受體核轉蛋白；TCDD，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英；TCDF，2，3，7，8-四氯二苯并呋喃；PeCDF，2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃；DRE，二惡英反應元件；POTDS，多氯代二苯并-對-二惡英；P⑶Fs,，多氯代二苯并呋喃；PCBs，多氯聯(lián)苯；DLCs，二惡英類化合物。
[0043]其中Hepal 細胞也叫 Hepalclc7 細胞，Michael S.Denison 贈，參見 Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.Μ.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P., andDenison, M.S.(1996).Species-specific recombinant cell lines as bioassay systems for thedetection of2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like chemicals.Fund.App1.Toxicol.30, 194 - 203.[0044]pGL6.1,也叫 pGudLuc6.1,Michael S.Deni son 贈，參見 Han, D._H.，Nagy, S.R.，andDenison, M.S.(2004).Comparison of recombinant cell bioassays for the detectionof Ah receptor agonists.Biofactors20, 11 - 22.[0045]pGL3_basic 購自 Promega。
[0046]實施例1
[0047]1.pCL-FL質粒的構建
[0048]小鼠基因組DNA來自于肝癌細胞Ifepal細胞，按照試劑盒標準方法抽提。并通過標準的分子克隆手段構建獲得PCL-FL (圖1)。
[0049]本實驗的目的是構建獲得包括小鼠CYPlAl啟動子(-1400~+3)原始序列的二惡英報告基因檢測質粒，該序列包含6個DRE序列。以小鼠基因組DNA為模板，用以下引物進行PCR反應。
[0050]5’ 引物為:5’ -CACGCTCGAGAACAGGTTGAGTTAGAC-3，(SEQ ID NO:1)
[0051]3，引物為:5，-CACGAAGCTTCAGGGTTAGGGTGAAG-3，(SEQ ID NO:2)
[0052]獲得PCR片段后，以Xho I和Hind III雙酶切，并對載體質粒pGL3_basic進行同樣的雙酶切，最后將該片段構建入pGL3-basic中。最后經酶切測序鑒定后，獲得pCL-FL質粒。
[0053]其中啟動子的序列為:
[0054]AACAGGTTGAGTTAGACACGCCAAGTTCAGATGTTCTTCTTACACTAATCTCACTCTGGGAGCACCCTTCAGGGCCAGAGAGCACCTGCAAAACAGCCAGCTAGGCGTGCCGGGTGGTGCTGCGTGTCCTGCCACTAAAAATGTGGACACACGCTGTTCAGGCCTTTGCTCTCAGGCAGAAGCCGAGCATCGCACGCAAACCCGGCCCTTTGCACCGCTGGCGCTGTCTTGTCGCGCCCTTGCAAAGCATAGACTATTTCTATCTCTTAAACCCCACCCCAACGCCCCAGGAGAGCTGGCCCTTTAAGAGCCTCACCCACGGTTCCCCTCCCCCAGCTAGCGTGACAGCACTGGGACCCGCGCCCGGTTGTGAGTTG
【權利要求】
1.重組載體，所述載體沿著其基因轉錄的方向可操作地連接有來源于CYPlAl啟動子的CYPlAl啟動子基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段，以及報告基因，所述CYPlAl啟動子基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)富集區(qū)段調節(jié)該報告基因的轉錄。
2.權利要求1的重組載體，其中所述的CYPlAl啟動子為哺乳動物CYPlAl啟動子，例如為小鼠CYPlAl啟動子。
3.權利要求1的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段的序列為SEQID NO:8所示的序列；和/或所述二惡英反應元件的富集區(qū)段的序列為SEQ ID NO:9所示的序列。
4.權利要求1的重組載體，其中所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)的富集區(qū)段的序列為SEQ ID N0:10所示的序列。
5.權利要求1的重組載體，其中所述的報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。
6.權利要求1-5任一項的重組載體,其是在pGL系列載體的螢火蟲突光素酶基因的上游可操作地連接有所述CYPlAl啟動子的基本區(qū)段和二惡英反應元件(DRE)的富集區(qū)段。
7.權利要求6的重組載體，其中所述的pGL系列載體為pGL2、pGL3、pGL4或pGL6，優(yōu)選地，所述重組載體為pCL-CRl。
8.重組細胞，其含有權利要求1-7任一項的重組載體。
9.權利要求8的重組細胞,其為重組肝源細胞,例如為重組肝癌細胞，例如為重組Hepal細胞。
10.權利要求1-7`任一項的重組載體或權利要求8或9的重組細胞用于二惡英類化合物生物檢測的用途。
11.一種二惡英類化合物生物檢測方法，所述方法使用權利要求1-7任一項的重組載體或權利要求8或9的重組細胞的步驟。
12.權利要求10的用途或者權利要求11的方法，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3，7，8-四氯二苯并二惡英)、多氯二苯并呋喃(P⑶Fs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物。
【文檔編號】C12Q1/66GK103820497SQ201410100210
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權日:2014年3月18日
【發(fā)明者】趙斌, 裴新輝, 謝群慧 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心