慢病毒干擾載體pll3.7-Neo及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo及其構(gòu)建方法。該載體是以pll3.7作為骨架質(zhì)粒，通過PCR擴(kuò)增的方法在質(zhì)粒pEGFP-C3中的SV40啟動子序列及其Neo/Kana的基因表達(dá)框兩端加入Not1和EcoR1的酶切位點，并將此序列克隆入pll3.7質(zhì)粒，從而替換pll3.7中的CMV啟動子序列及其下游的GFP基因表達(dá)框，構(gòu)建成帶有Neo/Kana篩選標(biāo)志并且不表達(dá)GFP蛋白的pll3.7-Neo慢病毒干擾載體。該干擾載體帶有Neo篩選標(biāo)志，并且去除了GFP的基因表達(dá)框，便于對各種蛋白的過表達(dá)和敲除同時進(jìn)行，并且不影響對目的蛋白在細(xì)胞中定位的觀察。
【專利說明】慢病毒干擾載體pi 13.7-Neo及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種以pll3.7為骨架，去除了 GFP蛋白的表達(dá)序列并且插入Neo篩選標(biāo)志的慢病毒干擾載體。
【背景技術(shù)】
[0002]慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)。它能高效的介導(dǎo)基因表達(dá)或RNAi干擾作用，具有廣泛感染譜，可以有效的感染分裂期和靜止期細(xì)胞，并且能夠長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具。目前市售的各種慢病毒載體主要分為兩大類，一類是過表達(dá)載體，另一類是干擾載體。這兩類載體大都帶有puix)抗性基因和(或)綠色熒光蛋白GFP基因，便于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和目的蛋白的定位。在細(xì)胞生物學(xué)以及細(xì)胞信號通路的研究中，往往需要在細(xì)胞中同時過表達(dá)或者敲除多個蛋白，然而現(xiàn)有慢病毒載體篩選標(biāo)志基因的單一性，無法滿足在一株細(xì)胞中同時過表達(dá)或者敲低兩個以上蛋白，限制了慢病毒感染技術(shù)在復(fù)雜信號通路研究中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的慢病毒載體存在的問題，發(fā)明一種帶有Neo篩選基因，但刪除GFP蛋白表達(dá)序列的慢病毒載體，從而便于對各種蛋白的過表達(dá)和敲除同時進(jìn)行，并且不影響對目的蛋白在細(xì)胞中定位的觀察。
[0004]本發(fā)明提供的一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo,其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
[0005]本發(fā)明提供的一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0006](I)、根據(jù)pEGFP -C3載體中的從2160到3672共1512個堿基對，即SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設(shè)計上下游引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點；
[0007](2)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以PEGFP-C3質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收；然后利用Notl和EcoRl切除片段兩端的保護(hù)堿基；
[0008](3)pll3.7質(zhì)粒經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切，切除從3065到4431共1366個堿基對，即CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收；
[0009](4)利用T4連接酶將上述經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切后SV40和Neo/Kana片段與P113.7的大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，過夜培養(yǎng)；
[0010](5)挑取單克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果分別如圖1、2，表明構(gòu)建成功，構(gòu)建成功的pll3.7-Neo載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示，核苷酸序列為SEQID NO:1。
[0011]本發(fā)明慢病毒干擾載 體pi 13.7-Neo帶有Neo篩選標(biāo)志，并且去除了 GFP的基因表達(dá)框，其便于對各種蛋白的過表達(dá)和敲除同時進(jìn)行，并且不影響對目的蛋白在細(xì)胞中定位的觀察，為細(xì)胞復(fù)雜信號通路的研究提供了新的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:PCR鑒定pll3.7-Neo載體構(gòu)建成功的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖中:M泳道為核酸maker, I泳道以pEGFP_C3載體為模板，2泳道以新構(gòu)建的pll3.7-Neo載體為模板。
[0013]圖2:pll3.7載體雙酶切產(chǎn)物電泳圖。圖中:M泳道為核酸maker，I泳道為pi 13.7-Neo載體雙酶切產(chǎn)物。2泳道為pi 13.7載體雙酶切產(chǎn)物。
[0014]圖3:構(gòu)建成功的pll3.7-Neo載體結(jié)構(gòu)圖。
[0015]圖4:pll3.7-Neo-β-catenin重組載體的菌液PCR產(chǎn)物電泳圖。圖中M泳道為核酸maker，I泳道以pi 13.7-Neo載體為模板作為對照。2-7泳道為pll3.7-Neo-β -catenin-1,8-13 泳道為 ρ113.7_Neo_β-catenin-2,14-19 泳道為pll3.7-Neo-β -catenin-3。
[0016]圖5:ρ113.7-Neo-β-catenin重組載體測序圖。圖中I為pll3.7-Neo-β -catenin-1 的測序結(jié)果，圖中 2 為 pll3.7-Neo-β -catenin-2 的測序結(jié)果，圖中3為pi 13.7-Neo-β-catenin-3的測序結(jié)果。
[0017]圖6:Western Blot實驗檢測β-catenin蛋白表達(dá)量。
[0018]圖7:Realtime_PCR 實驗檢測 β-catenin mRNA 達(dá)量。
【具體實施方式】
[0019]以下具體實施例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體試驗條件和試驗方法的按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件實施。
[0020]本發(fā)明所使用的各種器材和試劑盒均為本領(lǐng)域所熟知的產(chǎn)品，可市售獲得。
[0021]實施例1
[0022]1、根據(jù)pEGFP-C3載體中的從2160到3672共1512個堿基對，即SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設(shè)計引物，并且在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點。引物序列為SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0023]2、利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以pEGFP-C3質(zhì)粒為模板，用上述引物擴(kuò)增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收。然后利用Notl和EcoRl將擴(kuò)增片段兩端的保護(hù)堿基切除。
[0024]3、ρ113.7質(zhì)粒在37。。經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切2h,切除從3065到4431共1366個堿基對，即CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收。
[0025]4、利用T4連接酶將PCR擴(kuò)增出的SV40和Neo/Kana片段與上述經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切后的P113.7的大片段在16°C過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，過夜培養(yǎng)。
[0026]5、 挑取單克隆于5mlLB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果分別如圖1、2，表明構(gòu)建成功，構(gòu)建成功的P113.7-Neo載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示，核苷酸序列為SEQ ID NO =10
[0027]實施例2
[0028]本實施例以在過表達(dá)融合蛋白GFP-GRP78的DLDl穩(wěn)定細(xì)胞株中敲除β -catenin為例做進(jìn)一步說明，具體步驟如下:[0029]1、針對人源的 β-catenin (GenBank ΝΜ_001098209.I)基因，設(shè)計三條 shRNA 干擾序列，并且在序列的兩端分別加入Hpal和Xhol的酶切位點，分別命名為β-catenin-1、β _catenin_2、i3_catenin_3。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo,其特征在于核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
2.—種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)根據(jù)PEGFP-C3載體中SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設(shè)計上下游引物SEQIDNO:2和SEQ ID NO:3，并在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點； (2)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以PEGFP-C3質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收；然后利用Notl和EcoRl切除片段兩端的保護(hù)堿基； (3)pll3.7質(zhì)粒經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切，切除CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收； (4)利用T4連接酶將上述經(jīng)Notl和EcoRl雙酶切后SV40和Neo/Kana片段與pll3.7的大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，過夜培養(yǎng); (5)挑取單克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。
【文檔編號】C12N15/867GK103882062SQ201410092705
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】李宗偉, 張立超, 李漢卿, 李卓玉, 史通麟, 武海麗 申請人:山西大學(xué)