一種基于毛細(xì)管電泳和ssr標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法。利用11條多態(tài)性好、重復(fù)性高的引物對(duì)待測(cè)種子和標(biāo)準(zhǔn)種子的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管凝膠電泳分離，比較所得出的擴(kuò)增圖譜來判斷種子的真?zhèn)巍Ｔ摲椒婢逽SR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管凝膠電泳兩種技術(shù)的特色和優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度高，提高試驗(yàn)效率，減少人為誤差，具有快速、準(zhǔn)確、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，使試驗(yàn)結(jié)果更精確，并且鑒定過程和結(jié)果不受自然環(huán)境的影響。
【專利說明】—種基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于毛細(xì)管電泳SSR熒光標(biāo)記的農(nóng)作物種子真實(shí)性的檢測(cè)方法，特別涉及一種鑒定甘蔗種子真實(shí)性的檢測(cè)方法，屬于植物分子標(biāo)記檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]甘蔗是一種具有龐大基因組的同源或異源多倍體植物，遺傳背景十分復(fù)雜，加之其開花的復(fù)雜性及花粉保存等行為，在甘蔗雜交育種過程中，即使采取了一定的隔離措施也很難避免自交、串粉現(xiàn)象，致使甘蔗選育種不能順利進(jìn)行。這時(shí)甘蔗種子真實(shí)性的鑒定就顯得尤為重要。目前甘蔗種子真實(shí)性鑒定主要經(jīng)歷了生物學(xué)的形態(tài)鑒定、染色體鑒定、同工酶鑒定、分子鑒定等幾個(gè)階段。其中種子形態(tài)學(xué)鑒定簡(jiǎn)單直觀但準(zhǔn)確性較差；由于甘蔗具有龐大的基因組，遺傳背景非常復(fù)雜，常規(guī)的染色體方法鑒定甘蔗種子非常困難；同工酶鑒定是目前甘蔗種子鑒定應(yīng)用較多的方法，但由于同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，產(chǎn)生的多態(tài)性較少，對(duì)某些親本關(guān)系較近的品種難以鑒定。
[0003]隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于甘蔗品種與雜交后代真實(shí)性鑒定。在這些分子標(biāo)記技術(shù)中，SSR (Simple sequence repeat)標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遺傳上呈共顯性、結(jié)果穩(wěn)定可靠、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，是目前作物種子鑒定中使用最多的分子標(biāo)記技術(shù)。
[0004]目前常用的SSR分子標(biāo)記檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法，所揭示的多態(tài)性因采用的方法不同而有所差別。SSR主要表現(xiàn)為2飛個(gè)核苷酸重復(fù)次數(shù)的變化，多態(tài)性片段長(zhǎng)度的差異可以小到2~4 bp，這就需要更靈敏有效的檢測(cè)方法。PAGE理論上是分離可以達(dá)到I bp，實(shí)際在應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)；定性也不準(zhǔn)確，不能準(zhǔn)確給出片段的大小，只能粗略的估計(jì)。毛細(xì)管電泳(Capillay Electrophoresis, CE)是20世紀(jì)80年代后期在全球范圍內(nèi)迅速崛起的一種分離分析技術(shù)，具有快速、高效、高靈敏度、易定量、重現(xiàn)性好及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。CE結(jié)合熒光檢測(cè)比變性PAGE銀染檢測(cè)法的結(jié)果更精確，在微量PCR產(chǎn)物中更為靈敏，表現(xiàn)出強(qiáng)大的分析能力，大大地提高工作效率。將CE應(yīng)用于基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，不僅使分子標(biāo)記的重復(fù)驗(yàn)證工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸銀染料或同位素標(biāo)記過程中出現(xiàn)的假帶現(xiàn)象。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決甘蔗種子純度和真?zhèn)蔚蔫b定難題，提供一種高通量、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的甘蔗種子真實(shí)性鑒定方法，也可用于甘蔗品種的鑒定，保護(hù)品種所有人的合法知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
[0006]本發(fā)明所提供的甘蔗種子真實(shí)性的鑒定方法，包括以下步驟:
1)甘蔗基因組DNA提取:采取供鑒定的甘蔗新鮮嫩葉，經(jīng)液氮研磨，采用改良的SDS法提取得到待測(cè)種子的基因組總DNA ；
2)每粒待測(cè)種子PCR擴(kuò)增:以步驟I)中提取的基因組總DNA為模板，用SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到待測(cè)種子的電泳圖譜，讀出所得譜帶大小數(shù)值；
3)由按照所述步驟I)和2)的方法得到標(biāo)準(zhǔn)種子電泳圖譜中讀出所得譜帶大小數(shù)值，將所得待測(cè)種子譜帶大小與其相比較，如果待測(cè)種子與標(biāo)準(zhǔn)種子的譜帶相同，則證明該待測(cè)種子與標(biāo)準(zhǔn)種子為同一品種，得出待測(cè)種子的真實(shí)性。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述SSR引物為篩選出的11對(duì)SSR引物，引物序列由ISMC提供，正向引物5’端以CY5磷熒光染料標(biāo)記，引物序列及信息如下:
引物名稱:SMC569CS，條帶大小:165-233bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5，-GCGATGGTTCCTATGCAACTT-3，
反向:5’ -TTCGTGGCTGAGATTCACACTA-3’ ；
引物名稱:SMC7⑶Q，條帶大小:158-171bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCAAAGCAAGGGTCACTAGA-3，
反向:5’ -AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3’ ； 引物名稱:SMC703BS，條帶大小=203-229 bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -GCCTTTCTCCAAACCAATTAGT-3’
反向:5’ -GTTGTTTATGGAATGGTGAGGA-3’ ；
引物名稱:SMC851MS，條帶大小:127-152 bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -ACTAAAATGGCAAGGGTGGT-3’
反向:5’ -CGTGAGCCCACATATCATGC-3’ ；
引物名稱:SMC1604SA，條帶大小:92-127 bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -AGGGAAAAGGTAGCCTTG G-3’
反向:5’ -TTCCAACAGACTTGGGTG G-3’ ；
引物名稱:SMC1751CL，條帶大小:134-154bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCATGCCCATGCTAAAGAT-3’
反向:5’ -ACGTTGGTCCCGGAACCG-3’ ；
引物名稱:SMC31CUQ，條帶大小:138-185bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3’
反向:5’ -AGTGCCAATCCATCTCAGAGA-3’ ；
引物名稱:mSSCIR3，條帶大小:160-190bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -ATAGCTCCCACACCAAATGC-3’
反向:5’ -GGACTACTCCACAATGATGC-3’ ；
引物名稱:mSSCIR43，條帶大小:168_252bp，引物退火溫度:52°C，引物序列:
正向:5’ -ATTCAACGATTTTCACGAG-3’
反向:5’ -AACCTAGCAATTTACAAGAG-3’ ；
引物名稱:mSSCIR66，條帶大小:122_146bp，引物退火溫度:48°C，引物序列:
正向:5’ -AGGTGATTTAGCAGCATA-3’
反向:5’ -CACAAATAAACCCAATGA-3’ ；引物名稱:mSSCIR74，條帶大小:214_229bp，引物退火溫度:54°C，引物序列:
正向:5’ -GCGCAAGCCACACTGAGA-3’
反向:5’ -ACGCAACGCAAAACAACG-3’。
[0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述改良SDS提取方法為:將甘蔗嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入65°C預(yù)熱的SDS提取液，搖勻，65°C水浴45 min;加入KAc (5 mol/L，ρΗ4.8)，混勻后，冰浴15 min ；4°C, 10000 rpm離心15 min,取上清液,加入等體積氯仿混勻；4°C,12000 rpm離心7 min,取上清液,加1/10體積的NaAc (3 mol/L, pH 5.2)和2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，冰浴20 min ；4°C, 10000 rpm離心10 min，棄上清，用70%乙醇洗滌2次，晾干沉淀；加入已滅菌的TE溶液(pH8.0)，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 所述 SDS 提取液的組成為:Tris-HCl 200 mmol/L, pH8.0 ；EDTA 50 mmol/L pH8.0 ；NaCl 500 mmol/L ；SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?首先95°C預(yù)變性5 min ；隨后的30個(gè)循環(huán)為:94°C變性30 sec，退火30 sec，72°C延伸30 sec ;最后72°C下延伸2min。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述毛細(xì)管電泳分析方法為:將步驟2)中所得到的PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，在BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀上利用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)，每個(gè)CE樣品中含有I μL PCR產(chǎn)物、0.2 μL Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μLSLS溶液。在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
[0011]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述數(shù)據(jù)分析方法為:用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同參試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，利用軟件將擴(kuò)增片段與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到片段長(zhǎng)度大小。
[0012]本發(fā)明建立了 SSR熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合的鑒定方法，該方法融合了SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳檢測(cè)兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)效率，結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品進(jìn)行快速測(cè)定。具體優(yōu)點(diǎn)如下:
(1)本實(shí)驗(yàn)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記具有多態(tài)性高，穩(wěn)定性好，有高度變異、微衛(wèi)星在染色體上分布均勻等優(yōu)點(diǎn)，使得其更適用于種子的鑒定。
[0013](2)毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法的靈敏度較高，在PCR產(chǎn)物稀釋200倍后仍能正常檢測(cè)出結(jié)果，在微量的PCR產(chǎn)物分析中表現(xiàn)出來強(qiáng)大的分析能力。
[0014](3)目前常見的分子標(biāo)記鑒定種子真實(shí)性的檢測(cè)方法為聚丙烯酰胺凝膠電泳，該方法理論上分離可以達(dá)到lbp，但實(shí)際操作中很難實(shí)現(xiàn)，因此很容易將與標(biāo)準(zhǔn)品相差I(lǐng)bp左右的待測(cè)種子鑒定為真，而毛細(xì)管電泳技術(shù)能準(zhǔn)確讀出條帶大小，區(qū)分度在Ibp之內(nèi)，提高了種子鑒定的準(zhǔn)確性。
[0015](4 )毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法檢測(cè)的各電泳樣品中均含有分子量?jī)?nèi)標(biāo),各泳道的DNA片段直接與其泳道中的分子量?jī)?nèi)標(biāo)相比就可精確獲得其大小數(shù)值，而常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳所得片段大小只能用肉眼與分子量標(biāo)準(zhǔn)做比較估測(cè)得出，特別是遠(yuǎn)離分子量標(biāo)準(zhǔn)泳道的數(shù)據(jù)，使得結(jié)果產(chǎn)生人為誤差。
[0016] (5)將CE應(yīng)用于基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記,一次檢測(cè)只需一塊96孔板同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，不僅使分子標(biāo)記的重復(fù)驗(yàn)證工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸銀染料或同位素標(biāo)記過程中出現(xiàn)的假帶現(xiàn)象。不僅省去了人力，提高了工作效率，也避免了這些操作中的人為誤差，從而增強(qiáng)了試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1-1為標(biāo)準(zhǔn)種子GT96-211的電泳圖譜，圖1_2為待測(cè)樣品中的真實(shí)種子的電泳圖譜，圖1-3為待測(cè)樣品中的混雜種子的電泳圖譜，擴(kuò)增引物為SMC31CUQ。
[0018]圖2-1為標(biāo)準(zhǔn)種子R0C22的電泳圖譜，圖2_2為檢測(cè)的與標(biāo)準(zhǔn)種子條帶相同的的電泳圖譜，圖2-3為檢測(cè)的與標(biāo)準(zhǔn)種子條帶不同的的電泳圖譜，擴(kuò)增引物為SMC7CUQ。

【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
以甘蔗品種GT96-211種子為標(biāo)準(zhǔn)種子鑒定甘蔗種子真實(shí)性。
[0020]1.種子樣品的選取
從甘蔗品種GT96-211中隨機(jī)數(shù)取45粒種子，為檢驗(yàn)鑒定效果，再摻入3粒GT96-167和2粒GT96-154品種的種子，共50粒種子作為檢驗(yàn)樣品。
[0021]2.種子樣品基因組DNA提取
(1)將甘蔗種子放于30 °C恒溫下發(fā)芽出苗，待長(zhǎng)出2-3片真葉時(shí)，取甘蔗嫩葉于研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，裝入2 ml離心管中；
(2)向離心管中加入1.2 ml 65°C預(yù)熱的 SDS 提取液(Tris-HCl 200 mmol/L, ρΗ8.0 ；EDTA 50 mmol/L pH8.0 ；NaCl 500 mmol/L ;3% SDS)，將樣品粉末與提取液迅速搖勻使之不成團(tuán)，65°C水浴45 min，其間輕搖4_6次；
(3)加入200 μ I KAc (5 mol/L, pH 4.8)，混勻后，冰浴 15 min ；
(4)于4°C冷凍離心機(jī)里,10000rpm離心15 min ；
(5)取800μ I上清液,加入800 μ I氯仿混勻，于4°C, 12000 rpm離心7 min ；
(6)取400μ I上清液，加入40 μ I NaAc (3 mol/L,pH 5.2)和800 μ I預(yù)冷無水乙酉享，冰浴20 min ；
(7)于4°C，10000rpm離心10 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌2次沉淀，晾干沉淀；
(8)加入200μ I已滅菌的TE溶液(ρΗ8.0)，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于-20°C保存?zhèn)溆?
3.PCR擴(kuò)增
PCR 反應(yīng)體系(20 μ 1):1 μ I 25 ng/μ I DNA 模板、2 μ I 1XBuffer (含 20 mMMg2+)>0.5 μ I 10 mM dNTP、0.8 μ I 10 mol/L SSR 引物、0.2 μ I DNA pfu 酶(5 U/μ I),加ddH20至20 μ I (試劑購(gòu)自生工生物工程股份有限公司)。
[0022]PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性5 min ;隨后的30個(gè)循環(huán)為:94°C變性30 sec，退火30sec，72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 2 min。
[0023]4.毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)
上樣板:將所得到的PCR產(chǎn)物稀釋100倍，在96孔板的各孔中分別加入20 μL甲酰胺，
0.2 μL Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品和I μL稀釋后的PCR產(chǎn)物。
[0024]緩沖板:在96孔板的各孔中加入分離液，大約為每孔的2/3。
[0025]將上樣板和緩沖板放入BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀(美國(guó)，BECKMAN公司生產(chǎn))中，90°C變性2 min;進(jìn)樣電壓2 kV，時(shí)間30 sec;分離電壓7.5 kV，時(shí)間40min。在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
[0026]5.數(shù)據(jù)分析
用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出各供試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，軟件系統(tǒng)將根據(jù)擴(kuò)增片段目標(biāo)峰的位置與同一泳道中的Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，得到片段長(zhǎng)度大小。
[0027]6.鑒定結(jié)果分析
將待測(cè)樣品每粒種子DNA的11對(duì)引物擴(kuò)增的電泳圖譜分別與按照上述步驟1-5的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)種子GT96-211的11對(duì)引物的電泳圖譜相比較，結(jié)果表明，50粒待測(cè)種子中有45粒種子的20對(duì)引物擴(kuò)增條帶結(jié)果與均與GT96-211品種的種子相同，5粒種子帶型有差異，與預(yù)選摻雜的情況相符，說明前者為GT96-211的種子，后者為混雜種。其中，部分檢測(cè)結(jié)果如圖1-1、圖1-2、圖1-3所示。
[0028]實(shí)施例2
鑒定某單位正在使用的親本材料A是否為品種R0C22，鑒定操作流程如下: 隨機(jī)挑取待測(cè)品種A種子10粒，進(jìn)行DNA制備，PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析，具體實(shí)施步驟如實(shí)施例1。
[0029]鑒定結(jié)果分析
將待測(cè)品種A的10粒種子的11對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果分別與標(biāo)準(zhǔn)品R0C22擴(kuò)增結(jié)果相對(duì)t匕，結(jié)果表明，其中三粒種子的擴(kuò)增結(jié)果中含有與標(biāo)準(zhǔn)種子相差異的條帶，說明該單位使用的親本材料A不是甘蔗品種R0C22。其中部分檢測(cè)結(jié)果如圖2-1、圖2-2、圖2-3所示。
【權(quán)利要求】
1.一種基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法，包括以下步驟: 1)甘蔗基因組DNA提取:采取供鑒定的甘蔗新鮮嫩葉，經(jīng)液氮研磨，采用改良的SDS法提取得到待測(cè)種子的基因組總DNA ； 2)每粒待測(cè)種子PCR擴(kuò)增:以步驟I)中提取的基因組總DNA為模板，用SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到待測(cè)種子的電泳圖譜，讀出所得譜帶大小數(shù)值； 3)按步驟I)和2)的方法得到標(biāo)準(zhǔn)種子電泳圖譜并讀出譜帶大小數(shù)值，將所得待測(cè)種子譜帶大小與其相比較，如果待測(cè)種子與標(biāo)準(zhǔn)種子的譜帶相同，則證明該待測(cè)種子與標(biāo)準(zhǔn)種子為同一品種，得出待測(cè)種子的真實(shí)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法，其特征在于:所述SSR引物為篩選出的11對(duì)SSR引物，引物序列由ISMC提供，正向引物5’端以CY5磷熒光染料標(biāo)記，引物序列及信息如下: 引物名稱:SMC569CS，條帶大小:165-233bp，引物退火溫度:62°C，引物序列: 正向:5，-GCGATGGTTCCTATGCAACTT-3，
反向:5’ -TTCGTGGCTGAGATTCACACTA-3’ ； 引物名稱:SMC7⑶Q，條帶大小:158-171bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCAAAGCAAGGGTCACTAGA-3，
反向:5’ -AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3’ ； 引物名稱:SMC703BS，條帶大小=203-229 bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -GCCTTTCTCCAAACCAATTAGT-3’
反向:5’ -GTTGTTTATGGAATGGTGAGGA-3’ ； 引物名稱:SMC851MS，條帶大小:127-152 bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -ACTAAAATGGCAAGGGTGGT-3’
反向:5’ -CGTGAGCCCACATATCATGC-3’ ； 引物名稱:SMC1604SA，條帶大小:92-127 bp，引物退火溫度:58°C，引物序列:
正向:5’ -AGGGAAAAGGTAGCCTTG G-3’
反向:5’ -TTCCAACAGACTTGGGTG G-3’ ； 引物名稱:SMC1751CL，條帶大小:134-154bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCATGCCCATGCTAAAGAT-3’
反向:5’ -ACGTTGGTCCCGGAACCG-3’ ； 引物名稱:SMC31CUQ，條帶大小:138-185bp，引物退火溫度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3’
反向:5’ -AGTGCCAATCCATCTCAGAGA-3’ ； 引物名稱:mSSCIR3，條帶大小:160-190bp，引物退火溫度:60°C，引物序列:
正向:5’ -ATAGCTCCCACACCAAATGC-3’
反向:5’ -GGACTACTCCACAATGATGC-3’ ； 引物名稱:mSSCIR43，條帶大小:168_252bp，引物退火溫度:52°C，引物序列:
正向:5’ -ATTCAACGATTTTCACGAG-3’
反向:5’ -AACCTAGCAATTTACAAGAG-3’ ；引物名稱:mSSCIR66，條帶大小:122_146bp，引物退火溫度:48°C，引物序列:
正向:5’ -AGGTGATTTAGCAGCATA-3’
反向:5’ -CACAAATAAACCCAATGA-3’ ； 引物名稱:mSSCIR74，條帶大小:214_229bp，引物退火溫度:54°C，引物序列:
正向:5’ -GCGCAAGCCACACTGAGA-3’
反向:5’ -ACGCAACGCAAAACAACG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法，其特征在于:所述的改良SDS提取方法為將甘蔗嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入1.2 ml 65°C預(yù)熱的SDS提取液，搖勻，65°C水浴45 min;加入200 μ I KAc，混勻后，冰浴15 min ；4°C,10000 rpm離心15 min,取I ml上清液,加入等體積氯仿混勻；4°C, 12000 rpm離心7 min,取上清液，加1/10體積的NaAc和2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，冰浴20 min ；4°C，10000 rpm離心10 min,棄上清，用70%酒精洗滌2次，晾干沉淀；加入200 μ I已滅菌的TE溶液，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?首先95°C預(yù)變性5 min ;隨后的30個(gè)循環(huán)為:94°C變性30 sec，退火 30 sec，72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 2 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于毛細(xì)管電泳和SSR標(biāo)記的甘蔗種子真實(shí)性檢測(cè)方法，其特征在于:所述的毛細(xì)管電泳方法為，將PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，在遺傳分析系統(tǒng)儀上利用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)，每個(gè)CE樣品中含有I μL PCR產(chǎn)物、0.2 μL Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品和20 μL SLS溶液；在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的改良SDS提取方法，其特征在于:所述SDS提取液的組成為Tris-HCl 200 mmol/L, ρΗ8.0 ；EDTA 50 mmol/L ρΗ8.0 ；NaCl 500 mmol/L ；3% SDS。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的毛細(xì)管電泳檢測(cè)，其特征在于:用GeneMapper-V軟件對(duì)遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同參試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，利用軟件將擴(kuò)增片段與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到片段長(zhǎng)度大小。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104073551SQ201410090898
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】梁俊, 劉守廷, 甘志勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 甘國(guó)勇 申請(qǐng)人:南寧泰格瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司