一株釀酒酵母及其在發(fā)酵產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株釀酒酵母及其在發(fā)酵產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC-X234，已于2014年1月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)：CCTCC?M2014005，采用了低能N+注入介導(dǎo)spt15基因技術(shù)，以SC-100為出發(fā)菌，利用TTC平板、酒精平板進(jìn)行初篩，得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，逐漸提高酵母在酒精中的耐性，最終獲取產(chǎn)量可達(dá)到15.75%的生產(chǎn)菌株SC-X234，該菌株可以大大提高發(fā)酵產(chǎn)率低的問(wèn)題，且糖醇轉(zhuǎn)化率較高。在5L發(fā)酵罐中，乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到126g/l,比原始出發(fā)菌提高了87.5%，作為燃料乙醇具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—株釀酒酵母及其在發(fā)酵產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株釀酒酵母及其在發(fā)酵產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]化石能源是當(dāng)今能源結(jié)構(gòu)的主體，卻是一類(lèi)非常寶貴的不可再生資源，其儲(chǔ)量有限，以我國(guó)為例，我國(guó)雖是石油生產(chǎn)大國(guó)，卻也是石油消費(fèi)大國(guó)和石油資源短缺大國(guó)。2008年我國(guó)生產(chǎn)原油1.9億噸；消費(fèi)石油3.65億噸，凈進(jìn)口原油1.75億噸，進(jìn)口量占消費(fèi)總量的48%。而截至2006年底，我國(guó)累積探明石油可采儲(chǔ)量為20.43億噸，照此計(jì)算，現(xiàn)有石油僅能維持幾十年的需要，石油供需矛盾十分突出，并將不斷加劇。在這種大環(huán)境下，進(jìn)行生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)，來(lái)代替不可再生的化石能源就具有重要的實(shí)際意義。目前我國(guó)政府也已充分認(rèn)識(shí)到開(kāi)發(fā)使用這種〃綠色能源〃的重要性，近年對(duì)生物質(zhì)能源研究的投入力度不斷增加，特別是對(duì)研究開(kāi)發(fā)用植物纖維替代糧食生產(chǎn)燃料乙醇給予厚望。
[0003]燃料乙醇(fuel ethanol)是指向汽油或柴油中加入一定比例的無(wú)水乙醇。一來(lái)解決作為一次能源汽油、柴油的潛在數(shù)量有限的問(wèn)題；二是提高汽油和柴油的燃燒水平，有利于加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)。雖然酒精的燃燒值僅是汽油燃燒值的2/3，但酒精分子中含有氧，燃燒過(guò)程中抗爆性能好。當(dāng)汽油中酒精的添加量不超過(guò)15%時(shí)，對(duì)汽車(chē)的行駛性能無(wú)明顯影響，但尾氣中的CO、NOx化物和CH化物的含量可降低30%~ 50%。技術(shù)研發(fā)上，世界各國(guó)均投入了巨額人力物力進(jìn)行燃料乙醇的開(kāi)發(fā)，尤其是研究開(kāi)發(fā)用植物纖維替代糧食生產(chǎn)燃料乙醇優(yōu)勢(shì)顯著。以美國(guó)為例，美國(guó)以纖維素制乙醇的技術(shù)開(kāi)發(fā)較早，美國(guó)能源部1999年提出計(jì)劃，到2005年把燃料乙醇的生產(chǎn)成本降低36%，1999年，美國(guó)可再生能源研究所和有關(guān)開(kāi)發(fā)企業(yè)的關(guān)鍵發(fā)酵技術(shù)已達(dá)到相當(dāng)高的水平，當(dāng)然尚存在一些問(wèn)題。目前各國(guó)科學(xué)家在許多領(lǐng)域已取得了重大進(jìn)展:如微生物纖維素酶的生產(chǎn)效率顯著提高，多種新的原料預(yù)處理實(shí)用技術(shù)已被開(kāi)發(fā)；能共發(fā)酵葡萄糖和木糖的工程菌成功構(gòu)建；秸桿生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇反應(yīng)器的研究取得一定進(jìn)展；纖維素生產(chǎn)乙醇中試已擴(kuò)大至數(shù)十立方米發(fā)酵罐生產(chǎn)規(guī)模等。利用數(shù)量巨大的農(nóng)作物秸桿和林產(chǎn)下腳料(含木質(zhì)纖維素)制取燃料乙醇，已經(jīng)列入我國(guó)的〃十五〃、〃十一五〃科技發(fā)展計(jì)劃中。利用纖維素原料生產(chǎn)乙醇是利用產(chǎn)纖維素酶的微生物或纖維素酶先將纖維素水解成可發(fā)酵性糖，再利用酵母將其發(fā)酵成乙醇，因此獲得高效產(chǎn)乙醇的菌株是其中的關(guān)鍵因素，同時(shí)各種篩選高產(chǎn)乙醇菌株成為研究的熱點(diǎn)。本文通過(guò)介紹了一種新型的誘變方法提高了菌株產(chǎn)酒精的能力，同時(shí)提高了釀酒酵母對(duì)乙醇的耐性。目前國(guó)內(nèi)產(chǎn)乙醇的最高水平為12%,國(guó)外最高水平`可到15%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決目前發(fā)酵產(chǎn)乙醇中乙醇產(chǎn)量低，沒(méi)有高產(chǎn)乙醇的菌株，進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)乙醇生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一株釀酒酵母SC-X234及其在發(fā)酵產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，通過(guò)誘變提高了釀酒酵母對(duì)發(fā)酵中酒精的耐性，同時(shí)保證乙醇產(chǎn)量在15.75%的水平。[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種釀酒酵母cerevisiae) SC-X234，已于2014年I月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào):CCTCC M 2014005，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0006]本發(fā)明所述的釀酒酵母SC-X234的篩選方法:釀酒酵母原始出發(fā)菌株SC-100經(jīng)過(guò)低能氮離子束注入介導(dǎo)sptl5基因后，利用高乙醇平板、TTC平板篩選得到的菌株，經(jīng)過(guò)耐乙醇馴化后且搖瓶發(fā)酵得到產(chǎn)乙醇濃度最高的釀酒酵母為下一輪誘變菌株。重復(fù)上述步驟，直至獲取目標(biāo)菌株SC-X234，具體步驟如下:
Ca)單孢子懸浮液的制備:將釀酒酵母出發(fā)菌SC-100制成孢子懸浮液，濃度為IX IO6個(gè)/mL ；
(b)低能離子束介導(dǎo)sptl5基因的誘變:取100 μ L孢子懸浮液及50 μ L含sptl5的質(zhì)粒(含sptl5的質(zhì)粒由南京工業(yè)大學(xué)許琳老師贈(zèng)送)，均勻涂布到無(wú)菌空平板上，以無(wú)菌風(fēng)吹干，在20Kev能量下，40 X 1014ions/cm2劑量下進(jìn)行氮離子誘變，離子注入完畢后，在無(wú)菌環(huán)境下用ImL TE溶液進(jìn)行洗脫，洗脫后的菌液在37°C溫浴lh，然后涂布到酒精平板上，進(jìn)行壓力篩選，37°C倒置培養(yǎng)2-3d。
[0007](c) TTC平板的初篩:將TTC上層培養(yǎng)基低溫倒在步驟(b)中已經(jīng)長(zhǎng)好的平板上，在37°C倒置培養(yǎng)l-2d，篩選到細(xì)胞脫氫酶活力強(qiáng)的菌株，活力越強(qiáng)，紅色越深。
[0008](d)發(fā)酵復(fù)篩:將步驟(C)篩選出的釀酒酵母菌接入斜面，在37°C下培養(yǎng)l-2d，然后斜面轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)8-10h。取種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%(v/v), 250mL搖瓶裝30mL培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵48h，測(cè)定發(fā)酵液中酒精的含量，篩選出酒精含量最高的釀酒酵母菌作 為下一輪誘變篩選的出發(fā)菌株，重復(fù)上述步驟直至篩選到目標(biāo)菌株SC-X234。
[0009]上述篩選方法中:步驟(b)中的酒精平板是在YPD培養(yǎng)基中加入5%_10%的酒精，步驟(c)的TTC培養(yǎng)基分為上層培養(yǎng)基和下層培養(yǎng)基，下層培養(yǎng)基即為YPD培養(yǎng)基，上層培養(yǎng)基組分為T(mén)TC 0.5g葡萄糖5g瓊脂15g定容到1L，pH自然。步驟(d)種子培養(yǎng)基成分碳源5%、氮源0.7%，無(wú)機(jī)鹽0.016%，緩沖劑0.1 %，pH=5.5，步驟(d)中發(fā)酵培養(yǎng)基成分成分:碳源36%、氮源1.1%、無(wú)機(jī)鹽0.02%、緩沖劑0.5%,其中碳源為葡萄糖或玉米淀粉中的一種或混合物；氮源:有機(jī)氮源為酵母膏，無(wú)機(jī)氮源:硫酸銨，pH=5.5，緩沖劑為磷酸二氫銨。
[0010]本發(fā)明釀酒酵母cerevisiae^ SC-X234的形態(tài)學(xué)及生理化學(xué)特性:
菌落顏色:乳白色 需氧方式:兼性厭氧 菌落大小:2-3mm 生長(zhǎng)溫度:35-40°C 最適 pH:5.0-5.5 菌落形態(tài):圓形
美蘭染色:活菌為無(wú)色，死菌為藍(lán)色。
[0011]上述釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，包括如下步驟:
I)平板培養(yǎng):將釀酒酵母SC-X234接于平板基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-40°C，培養(yǎng)時(shí)間l-2d ；
2)斜面培養(yǎng):將步驟I)中平板培養(yǎng)的釀酒酵母SC-X234轉(zhuǎn)接到斜面基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時(shí)間18-20h，培養(yǎng)溫度35-40°C ；
3)種液培養(yǎng):將步驟2)中斜面培養(yǎng)的釀酒酵母SC-X234接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間8-10h，培養(yǎng)溫度35-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min ；
4)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟3)中的種液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，培養(yǎng)時(shí)間為48h，培養(yǎng)溫度為35-40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min。
[0012]其中:步驟I)和2)中的基本培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源2%、氮源3-4%、瓊脂2%，其余為水，pH自然；其中所述的碳源為葡萄糖或玉米淀粉中的一種或兩種，所述氮源為蛋白胨或酵母粉的混合物。
[0013]步驟3)種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源5%、氮源0.5-1%，無(wú)機(jī)鹽
0.01-0.02%，緩沖劑0.1-0.2%，pH=5.5，其中碳源為葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母粉、硫酸銨或者磷酸氫二銨中的一種或幾種，緩沖劑為磷酸二氫銨。
[0014]步驟4)發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源32-36%、氮源1_2%、無(wú)機(jī)鹽
0.02-0.05%、緩沖劑0.5-1%，pH=5.5，其中碳源為葡萄糖或玉米淀粉中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨中的一種或幾種，緩沖劑為磷酸二氫銨。
[0015]注入介導(dǎo)sptl5基因是為了提高釀酒酵母對(duì)乙醇的耐性，sptl5是起始轉(zhuǎn)錄因子，sptl5基因的突變會(huì)使釀酒`酵母的酒精耐性發(fā)生改變，為了篩選高耐乙醇的釀酒酵母，從而獲取高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母。
[0016]有益效果:本發(fā)明采用了低能N+注入介導(dǎo)sptl5基因技術(shù)，以SC-100為出發(fā)菌，利用TTC平板、酒精平板進(jìn)行初篩，得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，逐漸提高酵母在酒精中的耐性，最終獲取產(chǎn)量可達(dá)到15.75%的生產(chǎn)菌株SC-X234，該菌株可以大大提高發(fā)酵產(chǎn)率低的問(wèn)題，且糖醇轉(zhuǎn)化率較高。在5L發(fā)酵罐中，乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到126g/L，比原始出發(fā)菌提高了87.5%，作為燃料乙醇具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0017]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1釀酒酵母SC-X234的篩選方法
出發(fā)菌株釀酒酵母SC-100是購(gòu)自于安琪酵母股份公司的安琪酵母干粉便于標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)室將其命名為SC-100。
[0019]以SC-100為出發(fā)菌篩選釀酒酵母SC-X234，具體步驟如下:
a)單孢子懸浮液的制備:將釀酒酵母出發(fā)菌制成孢子懸浮液，濃度為I X IO6個(gè)/mL。
[0020]b)低能離子束介導(dǎo)sptl5基因的誘變:取IOOyL孢子懸浮液及50yL含sptl5的質(zhì)粒，均勻涂布到無(wú)菌平板上，以無(wú)菌風(fēng)吹干，在20Kev能量下,40X 1014ions/cm2劑量下進(jìn)行氮離子誘變，離子注入完畢后，在無(wú)菌環(huán)境下用ImL TE溶液進(jìn)行洗脫，洗脫后的菌液在37°C溫浴lh，然后涂布到酒精平板上，進(jìn)行壓力篩選，37°C倒置培養(yǎng)2-3d。
[0021]c)誘變株的篩選TTC平板的初篩:將TTC上層培養(yǎng)基低溫倒在步驟(b)中長(zhǎng)好的平板上，在37°C倒置培養(yǎng)l-2d，篩選到細(xì)胞活力強(qiáng)的菌株，脫氫酶活力越強(qiáng)，紅色越深。
[0022]d)發(fā)酵復(fù)篩:將步驟(C)篩選出的釀酒酵母菌接入斜面培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)l-2d，然后斜面轉(zhuǎn)入種液中，在37°C下培養(yǎng)8-10h。取種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%(v/v), 250mL搖瓶裝30mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為100r/min，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵48h，測(cè)定發(fā)酵液中酒精的含量，篩選出酒精含量最高的釀酒酵母菌作為下一輪誘變篩選的出發(fā)菌株，重復(fù)上述步驟直至篩選到目標(biāo)菌株SC-X234。
[0023]其中培養(yǎng)基配方為:
步驟b)中的酒精平板培養(yǎng)基為:葡萄糖2%、魚(yú)粉蛋白胨2%、瓊脂2%、酵母膏2%、酒精8%其余為水PH自然。步驟c)中的TTC培養(yǎng)基為:TTC0.5g、葡萄糖5g、瓊脂15g定容到IL自然pH
步驟(c)的TTC平板分為上層培養(yǎng)基和下層培養(yǎng)基，下層培養(yǎng)基即為YPD培養(yǎng)基，上層培養(yǎng)基組分為T(mén)TC 0.5g葡萄糖5g瓊脂15g定容到1L，pH自然。
[0024]步驟d)中的種子液培養(yǎng)基:葡萄糖5%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.01%、氯化鈣0.06g/L、硫酸銨0.2%、磷酸氫二銨0.1%、ρΗ為5.5，其中葡萄糖需要分消(分消為分開(kāi)單獨(dú)滅菌的意思)。
[0025]步驟d)中的發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖36%、酵母膏0.1%、氯化鈣0.01%、硫酸銨1%、磷酸氫二銨0.5%、硫酸鎂0.01%、pH5.5，其中葡萄糖需要分消。
[0026]發(fā)酵結(jié)果酒精含量檢測(cè)如表1
表 I___
【權(quán)利要求】
1.一種釀酒酵母(cerevisiae) SC-X234,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)=CCTCC M 2014005。
2.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟: 1)平板培養(yǎng):將釀酒酵母SC-X234接于平板基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35-40°C，培養(yǎng)時(shí)間l-2d ； 2)斜面培養(yǎng):將步驟I)中平板培養(yǎng)的釀酒酵母SC-X234轉(zhuǎn)接到斜面基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時(shí)間18-20h，培養(yǎng)溫度35-40°C ； 3)種液培養(yǎng):將步驟2)中斜面培養(yǎng)的釀酒酵母SC-X234接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間8-10h，培養(yǎng)溫度35-40°C ； 4)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟3)中的種液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，培養(yǎng)時(shí)間為48h，培養(yǎng)溫度為35-40°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于:步驟I)和2)中的基本培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源2%、氮源3-4%、瓊脂2%，其余為水，PH自然；其中所述的碳源為葡萄糖或玉米淀粉中的一種或兩種，所述氮源為蛋白胨或酵母膏。
5.根據(jù)權(quán)利要 求3所述的釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于:步驟3)種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源5%、氮源0.5-1%，無(wú)機(jī)鹽.0.01-0.02%，緩沖劑0.1-0.2%，pH=5.5，其中碳源為葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨或者磷酸氫二銨中的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂和氯化鈣中的一種或幾種；緩沖劑為磷酸二氫銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母SC-X234在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于:步驟4)發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分:碳源32-36%、氮源1-2%、無(wú)機(jī)鹽.0.02-0.05%、緩沖劑0.5-1%，pH=5.5，其中碳源為葡萄糖、糖蜜或玉米淀粉中的一種或幾種混合物；氮源為酵母膏、硫酸銨中的一種或幾種，緩沖劑為磷酸二氫銨，無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂和氯化鈣中的一種或幾種。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103820346SQ201410088818
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】虞龍, 陳曉雙, 李玉燕, 劉媛 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)