變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種變形鏈球菌重組亞單位基因工程獲選疫苗抗原Glu的純化方法，包含步驟：收集發(fā)酵的變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗Glu蛋白的大腸桿菌菌體，采用高壓勻漿破菌，收集上清，離心上清，收集沉淀；包涵體洗滌；包涵體裂解：用含尿素的PBS緩沖液重懸，離心，棄沉淀，保存上清；初步復(fù)性：取含尿素的PB緩沖液，將包涵體溶解液逐滴緩慢加入到上述攪拌的緩沖液中，離心，棄沉淀，上清上柱純化；親和層析純化：在含尿素的PB緩沖液條件下對目的蛋白進(jìn)行純化，目的蛋白與填料結(jié)合后，用含氟化鈉的PB緩沖液進(jìn)行酶切洗脫，收集洗脫液即為層析純化的Glu蛋白。采用本發(fā)明的方法純化的抗原純度高，工藝簡捷。
【專利說明】變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，涉及一種重組變形鏈球菌齲齒疫苗候選抗原Glu制備中的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素作用下，牙齒硬組織發(fā)生的慢性、進(jìn)行性破壞的一種感染性疾病。其特點(diǎn)是發(fā)病率高，分布廣。一般平均齲患率可在50%左右，是口腔主要的常見病，也是人類最普遍的疾病之一，世界衛(wèi)生組織已將其與癌腫和心血管疾病并列為人類三大重點(diǎn)防治疾病。
[0003]目前研究認(rèn)為細(xì)菌是齲病發(fā)生的必要條件，一般認(rèn)為致齲菌有兩種類型，一種是產(chǎn)酸菌屬，其中主要為變形鏈球菌、放線菌屬和乳桿菌，可使碳水化合物分解產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙齒無機(jī)質(zhì)脫礦；另一種是革蘭氏陽性球菌，可破壞有機(jī)質(zhì)，經(jīng)過長期作用可使牙齒形成齲洞。目前公認(rèn)的主要致齲菌是變形鏈球菌。
[0004]自20世紀(jì)80年代以來，人們就開始用變形鏈球菌的有效抗原成分來制備亞單位防齲疫苗。傳統(tǒng)的滅活死疫苗和減毒活疫苗雖可抑制變形鏈球菌對牙面的粘附，但全細(xì)胞誘導(dǎo)的抗體與心腎組織有交叉反應(yīng)，減毒活疫苗具有減毒不充分或毒力回復(fù)則可造成對機(jī)體的傷害而均難以應(yīng)用于臨床。隨后多種以S.Mutans抗原為基礎(chǔ)的防齲疫苗可顯著降低動(dòng)物齲齒發(fā)生率，抗原主要有:表面蛋白抗原I/II(Ag 1/11)、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)和葡聚糖結(jié)合蛋白(GBP)等抗原分子(Hajishengallis G.1nfectImmun,1998，66(4):1740-1743;Katz J.1nfect Immun, 1993，61 (5):1964-1971;Childers NK.0ral Microbiol Immunol, 2006，21 (5):309-313;Childers NK.J DentRes, 2002, 81(I):48-52.;Peacock ZS.0ral Microbiol Immunol, 2005, 20 (I):60-64;SmithD J.1nfect Immun, 2005，73(5):2797-2804)。
[0005]葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase, GTF)是變形鏈球菌合成的重要致頻因子，催化鹿糖合成包括葡聚糖在內(nèi)的多種胞外多糖。GTF結(jié)構(gòu)包括催化區(qū)(Catalytie,Cat)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(Glucan binding, Glu)兩個(gè)功能區(qū)段。催化活性區(qū)具有催化蔗糖水解的活性，能夠催化蔗糖產(chǎn)生葡聚糖；葡聚糖結(jié)合區(qū)與葡聚糖結(jié)合，這種結(jié)合是特異性，不可逆的，且結(jié)合力非常強(qiáng)，由此介導(dǎo)了變形鏈球菌之間、菌體與葡聚糖、菌體與牙面之間的相互作用，從而使變形鏈球菌粘附、聚集在牙齒的表面并產(chǎn)酸，酸引起牙齒表面脫礦，最終導(dǎo)致齲病的發(fā)生，是齲病發(fā)生的主要因素。Glu具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，其可高效誘導(dǎo)抗GTF抗體,從而抑制GTF合成葡聚糖的能力，減少菌斑形成。(Xu QA, Vaccine.2007Jan26;25(7):1191-5 ；Jespersgaard C，Infect Tmmun.1999Feb;67(2):810-6 ；Taubman MA, InfectImmun.2001Jul; 69 (7):4210-6.)因此，抑制GTF催化合成葡聚糖有可能預(yù)防齲病的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的，是提供一種變形鏈球菌重組亞單位基因工程獲選疫苗抗原Glu的純化方法。采用本發(fā)明的方法純化的抗原Glu(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，其純度> 90%，完成整個(gè)純化過程后無需額外再置換緩沖液，是一種工藝簡捷、所獲得目標(biāo)蛋白純度高、回收率較好的純化方法。
[0007]本發(fā)明提供的一種變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu的純化方法，其主要包含步驟:
[0008]I)收集菌體、破菌:收集發(fā)酵的變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗Glu蛋白的大腸桿菌菌體，采用高壓勻漿破菌，收集上清，離心上清，收集沉淀；
[0009]2)包涵體洗滌:將步驟I)收集的沉淀，用PBS緩沖液重懸，洗滌多次，然后離心，收集沉淀；
[0010]3)包涵體裂解:用含尿素的PBS緩沖液重懸，離心，棄沉淀，保存上清；
[0011]4)初步復(fù)性:取含尿素的PB緩沖液，將包涵體溶解液逐滴緩慢加入到上述攪拌的緩沖液中，離心，棄沉淀，上清上柱純化；
[0012]5)親和層析純化:選擇蛋白純化系統(tǒng)，在含尿素的PB緩沖液條件下對目的蛋白進(jìn)行純化，目的蛋白與填料結(jié)合后，用含氟化鈉的PB緩沖液進(jìn)行酶切洗脫，收集洗脫液即為層析純化的Glu蛋白。
[0013]變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu的純化方法，進(jìn)一步包含以下步驟:
[0014]6)透析濃縮:將純化的Glu蛋白置于透析袋中，封口，懸浮于裝有含尿素的PB緩沖液中，攪拌透析，取出透析袋用高分子聚合物撒在透析袋外，待體積濃縮后，取出。
[0015]變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu的純化方法，進(jìn)一步還包含步驟:
[0016]7)加入助溶劑:加入L-精氨酸、甘油、海藻糖或PEG后保存。
[0017]優(yōu)選地，步驟I)具體為:將發(fā)酵的變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗Glu蛋白的大腸桿菌菌體用PH7.0-7.5的10-20mmol/L PBS緩沖液按1:9比例混勻懸浮，預(yù)冷后采用高壓勻漿破菌，破碎后的樣品經(jīng)750 X g離心30分鐘，收集上清，上清再以13000 X g離心30分鐘，收集沉淀。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)具體為:將離心沉淀用9倍體積含有1% TRITON X-100的PBS緩沖液重懸，充分混勻，用攪拌器溫和攪拌30分鐘，再以10000 X g離心30分鐘，棄上清，沉淀再重復(fù)洗滌一次；將離心沉淀用9倍體積含有l(wèi)mol/L尿素的PBS緩沖液重懸，充分混勻后，棄上清，沉淀再重復(fù)洗滌一次，離心后收集沉淀。
[0019]優(yōu)選地，步驟3)具體為:每克包涵體用19ml含8M尿素的PBS緩沖液重懸，4°C溫和攪拌12h，13000G離心30分鐘，棄沉淀，上清4°C保存。
[0020]優(yōu)選地，步驟4)具體為:取一定體積的含2M尿素pH7.0I OOmmo I/L PB的緩沖液，并置于攪拌器攪拌，將包涵體溶解液逐滴緩慢加入到上述攪`拌的緩沖液中，13000g離心30分鐘，棄沉淀，上清上柱純化。
[0021]優(yōu)選地,步驟5)具體為:選擇Profinity eXactTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化,使用含2mol/L尿素的pH7.0100mmol/L PB緩沖液條件下對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，目的蛋白與填料結(jié)合后，用含lOOmmol/L氟化鈉的PB緩沖液進(jìn)行酶切洗脫，收集洗脫液即為層析純化的Glu蛋白。
[0022]優(yōu)選地，步驟6)具體為:將純化的Glu蛋白置于麗10000的透析袋中，封口。懸浮于裝有含Imol尿素pH7.0的lOOmmol/L PB緩沖液中，4°C攪拌透析10小時(shí)；更換緩沖液為不含尿素的100mmol/L PB緩沖液，4°C攪拌透析10小時(shí)；取出透析袋用高分子聚合物或蔗糖撒在透析袋外，待體積濃縮20倍體積后，取出。
[0023]優(yōu)選地，高分子聚合物為聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
[0024]所述抗原是通過以下步驟制備的:
[0025]I)設(shè)計(jì)正向引物和反向引物通過PCR擴(kuò)增或全基因合成以獲得編碼變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu蛋白活性片段的核酸序列；
[0026]2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，然后將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌；
[0027]3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)重組蛋白。
[0028]本發(fā)明所述的上述方法的優(yōu)點(diǎn)是:
[0029]步驟I)中，所采用生產(chǎn)或中試純化中的60_80MPa高壓勻漿破菌技術(shù)，破菌率大于96%，通過差速離心取出破菌碎片后，再進(jìn)行高速離心獲取包涵體蛋白。
[0030]步驟4)中:所述的蛋白初步復(fù)性，將包涵體溶解液中的尿素通過稀釋復(fù)性的方式從8mol/L的濃度緩慢降至2mol/L左右，在此過程中，由于尿素濃度的降低至2M，包涵體蛋白得到初步復(fù)性的作用，蛋白`的終濃度控制在0.05-0.lmg/ml左右，避免因蛋白濃度過高，分子間作用力加大，造成蛋白質(zhì)分子間聚合趨向增大，而形成寡聚體和多聚體產(chǎn)生沉淀。
[0031]步驟5)中:所述的親和層析純化,所使用的填料為Profinity eXact融合標(biāo)簽系統(tǒng)，通過氟化鈉將純化和去除標(biāo)簽合為一體，簡化純化過程。
[0032]步驟6)中:所述透析濃縮的方法可采用透析袋法或中空纖維柱法進(jìn)行，滿足工藝放大的要求。
[0033]采用本發(fā)明所述純化方法主要有包涵體洗滌和裂解、稀釋復(fù)性、親和層析、透析濃縮。通過上述工藝處理不同批次的Glu作12%SDS-PAGE，呈現(xiàn)出單一目標(biāo)蛋白條帶，分子量約為43kD，純度在90%以上。等電點(diǎn)在pH9.1左右。純化后的Glu與LTB佐劑共同滴鼻免疫Waster大鼠，發(fā)現(xiàn)Glu加免疫佐劑組抗原特異性唾液slgA和血清中的IgG水平顯著高于陰性對照組(PBS組)(P〈0.0I)，證明使用本發(fā)明純化方法獲得的Glu可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答。
[0034]為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為Glu基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，泳道1:核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根Marker III);泳道 2-3:為 Glu PCR 產(chǎn)物；
[0036]圖2為BamH I和Not I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，圖中，泳道1:核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根Marker III);泳道2_3:重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7_Glu經(jīng)雙酶切后的鑒定結(jié)果，酶切后分離的片段5900bp和1140bp ；
[0037]圖3為重組Glu工程菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)圖，其中泳道I重組工程菌(pPAL7_Glu/XLlBlue)誘導(dǎo)前；泳道2為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas，#SM0671);泳道3-7分別為重組工程菌誘導(dǎo)l_5h ；
[0038]圖4為Glu蛋白親和層析及氟化鈉酶切SDS-PAGE結(jié)果圖，圖中，泳道1:重組Glu包涵體蛋白樣品；泳道2:上柱流穿樣品；泳道3:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas,#SM0671);泳道4-9:氟化鈉酶切后洗脫樣品；泳道10:磷酸清洗后的洗脫樣品；
[0039]圖5為Glu蛋白親和層析純化層析圖；其中峰I為流穿峰，峰2為目的蛋白洗脫峰，峰3為磷酸清洗峰。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述:
[0041 ] 實(shí)施例1抗原Glu的制備
[0042](一)變形鏈球菌Glu基因的克隆
[0043]1.變形鏈球菌UA159(來源于美國模式菌種收集中心，ATCC)(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室保存)
[0044]2.液氮罐中取出保存的變形鏈球菌UA159菌株涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，于37°C，培養(yǎng)過夜?；蚪M抽提試劑盒抽提變形鏈球菌基因組。
[0045]3.采用PCR方法自變形鏈球菌基因組分別擴(kuò)增Glu的編碼基因。
[0046]1)引物設(shè)計(jì)合成如下(下劃線示酶切位點(diǎn)堿基序列)
[0047]根據(jù)GenBank公布的基因序列及引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，引入酶切位點(diǎn)。
[0048]2 )目的基因的PCR擴(kuò)增:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原GlU的純化方法，其特征在于，包含步驟: O收集菌體、破菌:收集發(fā)酵的變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗Glu蛋白的大腸桿菌菌體，采用高壓勻漿破菌，收集上清，離心上清，收集沉淀； 2)包涵體洗滌:將步驟I)收集的沉淀，用PBS緩沖液重懸，洗滌多次，然后離心，收集沉淀； 3)包涵體裂解:用含尿素的PBS緩沖液重懸，離心，棄沉淀，保存上清； 4)初步復(fù)性:取含尿素的PB緩沖液，將包涵體溶解液逐滴緩慢加入到上述攪拌的緩沖液中，離心，棄沉淀，上清上柱純化； 5)親和層析純化:選擇蛋白純化系統(tǒng)，在含尿素的PB緩沖液條件下對目的蛋白進(jìn)行純化，目的蛋白與填料結(jié)合后，用含氟化鈉的PB緩沖液進(jìn)行酶切洗脫，收集洗脫液即為層析純化的Glu蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含步驟: 6)透析濃縮:將純化的Glu蛋白置于透析袋中，封口，懸浮于裝有含尿素的PB緩沖液中，攪拌透析，取出透析袋用高分子聚合物撒在透析袋外，待體積濃縮后，取出。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含步驟: 7)加入助溶劑:加入L-精氨酸、甘油、海藻糖或PEG后保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3`任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟I)具體為:將發(fā)酵的變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗Glu蛋白的大腸桿菌菌體用pH7.0-7.5的10-20mmol/LPBS緩沖液按1:9比例混勻懸浮，預(yù)冷后采用高壓勻漿破菌，破碎后的樣品經(jīng)750Xg離心30分鐘，收集上清，上清再以13000 Xg離心30分鐘，收集沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)具體為:將離心沉淀用9倍體積含有1% TRITON X-100的PBS緩沖液重懸，充分混勻，用攪拌器溫和攪拌30分鐘,再以10000 Xg離心30分鐘，棄上清，沉淀再重復(fù)洗滌一次；將離心沉淀用9倍體積含有l(wèi)mol/L尿素的PBS緩沖液重懸，充分混勻后，棄上清，沉淀再重復(fù)洗滌一次，離心后收集沉淀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)具體為:每克包涵體用19ml含8M尿素的PBS緩沖液重懸，4°C溫和攪拌12h，13000G離心30分鐘，棄沉淀，上清4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4)具體為:取一定體積的含2M尿素pH7.0IOOmmoI/L PB的緩沖液，并置于攪拌器攪拌，將包涵體溶解液逐滴緩慢加入到上述攪拌的緩沖液中，13000g離心30分鐘，棄沉淀，上清上柱純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟5)具體為:選擇Profinity eXactTM蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，使用含2mol/L尿素的pH7.0I OOmmo I/L PB緩沖液條件下對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，目的蛋白與填料結(jié)合后，用含100mmol/L氟化鈉的PB緩沖液進(jìn)行酶切洗脫，收集洗脫液即為層析純化的Glu蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟6)具體為:將純化的Glu蛋白置于麗10000的透析袋中，封口。懸浮于裝有含Imol尿素pH7.0的100mmol/L PB緩沖液中，4°C攪拌透析10小時(shí)；更換緩沖液為不含尿素的100mmol/L PB緩沖液，4°C攪拌透析10小時(shí)；取出透析袋用高分子聚合物或蔗糖撒在透析袋外，待體積濃縮20倍體積后，取出，所述高分子聚合物為聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的純化方法，其特征在于，所述抗原是通過以下步驟制備的: . 1)設(shè)計(jì)正向引物和反向引物通過PCR擴(kuò)增或全基因合成以獲得編碼變形鏈球菌重組亞單位基因工程疫苗候選抗原Glu蛋白活性片段的核酸序列； . 2)將步驟1)所獲得的核酸序列克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，然后將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌； . 3 )誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)重組蛋白。
【文檔編號】C12R1/19GK103820414SQ201410082929
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】張衛(wèi)軍, 劉開云, 付強(qiáng), 鄒全明, 郭剛, 張怡, 孫紅武, 付啟歡, 樊紹文, 盧陸, 高鶯 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)