棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體涉及一個(gè)分離克隆自棉花的細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及應(yīng)用。本發(fā)明從海島棉纖維不同發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫中獲得海島棉纖維特異表達(dá)的缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其中52-306為堿基所示的區(qū)域是編碼區(qū)，它特異地在海島棉纖維伸長期、轉(zhuǎn)換期及次生壁合成初期高效表達(dá)。將獲得的全長ORF構(gòu)建到植物超量表達(dá)載體pCAMBIA2301m上，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化陸地棉，對(duì)轉(zhuǎn)基因后代的纖維品質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它能夠有效促進(jìn)纖維的伸長；馬克隆值降低；使纖維從C2級(jí)上升到B2級(jí)；斷裂比強(qiáng)度的升高。利用本發(fā)明可以有效改良棉花纖維品質(zhì)?！緦＠f明】棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【
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】。具體涉及一種棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及應(yīng)用。利用反向遺傳學(xué)的方法，通過對(duì)海島棉纖維不同發(fā)育時(shí)期cDNA文庫的分析，發(fā)現(xiàn)該基因GbEXPATR缺少細(xì)胞壁伸展蛋白(a-expansin)第二個(gè)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明分離克隆的GbEXPATR基因在海島棉纖維伸長期、轉(zhuǎn)換期及次生壁合成初期優(yōu)勢(shì)表達(dá)。在棉花體內(nèi)超量表達(dá)該基因能夠有效促進(jìn)纖維的伸長、馬克隆值的降低并使纖維從C2級(jí)上升到B2級(jí)，斷裂比強(qiáng)度升高。利用本發(fā)明可有效改良棉花纖維品質(zhì)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，為紡織業(yè)提供了最主要的自然纖維，它的品質(zhì)好壞直接關(guān)系到紡織產(chǎn)品質(zhì)量、檔次的高低。棉花纖維是由胚珠外表皮細(xì)胞分化而來的單細(xì)胞表皮毛，成熟的纖維細(xì)胞長度一般為30-40mm，厚度為15μm(Qin,Y.M.;Zhu,Y.X.,Howcottonfiberselongate:ataleoflinearcell-growthmode.Currentopinioninplantbiology2011,14(I)，106-11.)。纖維的發(fā)育分為起始(Initiation)、伸長(Elongation)、轉(zhuǎn)換(Transition)、次生壁合成(Secondarycellwallbiosynthesis)和脫水成熟(Maturation)五個(gè)彼此重疊的過程(Haigler，C.H.等，Cottonfiber:apowerfulsingle-cellmodelforcellwallandcelluloseresearch.FrontiersinPlantScience2012，3.)。細(xì)胞壁在纖維發(fā)育過程中起著重要的作用，從伸長時(shí)初生壁的合成到次生壁加厚時(shí)纖維素的合成，這種細(xì)胞壁性質(zhì)的轉(zhuǎn)換決定了纖維的品質(zhì)(長度、強(qiáng)度、成熟度)。近幾年，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，RNA、DNA測(cè)序技術(shù)的逐漸完善，不同纖維發(fā)育時(shí)期細(xì)胞壁相關(guān)基因被大量挖掘出來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)這些基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們影響了纖維的品質(zhì):將纖維伸長期高量表達(dá)的木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)移酶基因GhXTH超量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因株系纖維-的長度與對(duì)照相比增長了15-20%，而斷裂比強(qiáng)度和馬克隆值沒有改變(Lee，J.等，Xyloglucanendotransglycosylase/hydrolasegenesincottonandtheirroleinfiberelongation.Planta2010，232(5)，1191-205.)。GhPEL是一個(gè)10DPA纖維高量表達(dá)的果膠裂解酶，它能夠降低去酯化果膠的含量，將該基因抑制后，轉(zhuǎn)基因株系纖維長度下降了16%(WangjH.等，TheessentialroleofGhPELgene,encodingapectatelyase,incellwalllooseningbydepolymerizationofthede—esterifiedpectinduringfiberelongationincotton.Plantmolecularbiology2010,72(4-5),397-406.)。蔗糖合成酶能夠催化蔗糖生成果糖和UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是纖維素合成的重要底物，將GhSusAl超量表達(dá)后能夠使纖維的長度、強(qiáng)度增加，并且提高幼苗的生物量(Jiang，Y.等，OverexpressionofGhSusAlincreasesplantbiomassandimprovescottonfiberyieldandquality.PlantBiotechnologyJournal2012,10(3)，301-312.)。[0003]從1992年McQueen-Mason發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁伸展蛋白一expansin到現(xiàn)在已有二十年的時(shí)間，它被認(rèn)為是一種在酸性條件下誘導(dǎo)細(xì)胞壁發(fā)生不可逆伸展的細(xì)胞壁蛋白。典型的細(xì)胞壁伸展蛋白expansin是由250-275個(gè)氨基酸組成，包括一個(gè)N端的信號(hào)肽(20-30個(gè)氨基酸)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域domainl(120-135個(gè)氛基酸)和domain2(90-120個(gè)氛基酸)(Cosgrove,D.J.,Looseningofplantcellwallsbyexpansins.Nature2000，407(6802)，321-326.)。通過序列的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，在植物中存在四個(gè)expansin家族:a-expansin(EXPA),β-expansin(EXPB),expansin-likeA(EXLA)^Pexpansin-1ikeB(EXLB)0a-expansin存在于雙子葉植物中，β-expansin只存在禾本科植物。a-expansin和β-expansin已被證實(shí)具有細(xì)胞壁松弛的活性，而expansin-likeA和expansin-likeB的功能還在研究Φ(Cosgrove,J.S.a.D.J.,Theexpansinsuperfamily.2005.)?生物信息學(xué)分析表明，禾本科植物中存在一組只與expansin第二個(gè)結(jié)構(gòu)域(domain2)同源的分泌蛋白，在免疫學(xué)上劃分為禾本科第二組花粉過敏源G2As(grassgroup-2pollenallergens)。它們可能是由β-expansin進(jìn)化而來，與β-expansin的相似度達(dá)35-45%,但是其生物學(xué)功能還不清楚。還有兩類與expansin第一個(gè)結(jié)構(gòu)域相似度達(dá)25-35%的植物蛋白:pl2和植物尿鈉肽(PNP,plantnatriureticpeptide),它們大量的存在于患有黃萎病的柑橘木質(zhì)部中，具有信號(hào)功能而不具備細(xì)胞壁松弛的活性。類Barwin蛋白是抗真菌蛋白PR4家族的成員，與expansin的相似度只有20-30%。[0004]細(xì)胞壁伸展蛋白expansin存在于不同的組織和器官中，例如:下胚軸、根尖、節(jié)間、莖間、根毛、花和成熟的果實(shí)，參與調(diào)控了許多植物的生長、發(fā)育、繁殖以及對(duì)逆境響應(yīng)等過程。超表達(dá)PhEXPAl能增加細(xì)胞的大小，影響細(xì)胞壁成分及葉腋分生組織的形成(Zenoni，S.等,OverexpressionofPhEXPAlincreasescellsize,modifiescellwallpolymercompositionandaffectsthetimingofaxillarymeristemdevelopmentinPetuniahybrida.NewPhytologist2011.);下調(diào)IbEXPl能夠增強(qiáng)甘薯儲(chǔ)藏根的形成(Noh，S.Α.等，Down-regulationoftheIbEXPlgeneenhancedstoragerootdevelopmentinsweetpotat0.JournalofExperimentalBotany2012.);在煙草中超表達(dá)形成層富集的CiEXPAl和CiEXPA2，能夠影響植株的生長發(fā)育，并且增加莖桿細(xì)胞壁的纖維素含量(Wang，G.等，Overexpressionoftwocambium-abundantChinesefir(Cunninghamialanceolata)a-expansingenesClEXPAlandClEXPA2affectgrowthanddevelopmentintransgenictobaccoandincreasetheamountofcelluloseinstemcellwalls.PlantBiotechnologyJournal2011，9(4)，486-502.)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的棉花細(xì)胞壁伸展蛋白(a-expansin)的GbEXPATR基因及應(yīng)用。本發(fā)明可釆用已經(jīng)克隆的GbEXPATR基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因；也可以釆用PCR(polymerasechainreaction)的方法，從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的GbEXPATR基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA分子。釆用以上技術(shù)，可以分離得到包含GbEXPATR基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體連接后轉(zhuǎn)化植物，可獲得成熟蛋白a-expansin含量較高的轉(zhuǎn)基因植株；而將這一序列的一部分序列作為靶標(biāo)構(gòu)建的可在植物體內(nèi)產(chǎn)生RNA干涉載體轉(zhuǎn)化植物，可獲得成熟蛋白a-expansin含量降低的植物。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，可以在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子、特異啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，也可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供一種缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的棉花a-expansin基因GbEXPATR在促進(jìn)棉花纖維細(xì)胞伸長、馬克隆值降低、斷裂比強(qiáng)度升高中的應(yīng)用。申請(qǐng)人:將得到的GbEXPATR基因的ORF區(qū)域(見序列表SEQIDNO:2，序列長度為567bp)構(gòu)建了超量表達(dá)，通過農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化在棉花植株中超量表達(dá)，利用RT-PCR、Southern等雜交等方法篩選出表達(dá)量高的低拷貝轉(zhuǎn)基因株系后，發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)該基因能夠有效促進(jìn)棉花纖維的發(fā)育，從而導(dǎo)致了成熟纖維的長度增長7%左右；馬克隆值降低6%左右，使纖維從C2級(jí)升到B2級(jí)(按照馬克隆值的大小，棉花纖維分為以下幾個(gè)等級(jí):A級(jí):范圍為3.7-4.2；B1級(jí):范圍為3.5-3.6;B2級(jí):范圍為4.3-4.9;C1級(jí):范圍為3.4以下；C2級(jí):范圍為5.0及以上。其中，A級(jí)最優(yōu)，B1、B2次之，C1、C2最差)；斷裂比強(qiáng)度提高6%左右，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)改良棉花纖維品質(zhì)的目的。[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:[0008]為了獲得一種缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的棉花細(xì)胞壁伸展蛋白(a-expansin)GbEXPATR基因，我們采用了如下的分離方法，具體步驟如下:[0009]申請(qǐng)人:所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的前期工作中從海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫中分離出一條與其它植物a-expansin基因同源度較高的cDNA(序列見SEQIDNO:1)，生物信息學(xué)分析表明，該cDNA包含一個(gè)完整的ORF(見SEQIDNO:2),通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可知該ORF可以翻譯出一條缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的a-expansin蛋白(SEQIDNO:3)，申請(qǐng)人:將其命名為GbEXPATR基因。該基因在纖維伸長、轉(zhuǎn)換、次生壁合成期高效表達(dá)，從海島棉品種3-79中提取10DPA纖維總RNA(提取方法參照Zhu等AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659報(bào)道的方法)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIIK購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0用引物GbEXPATR(5，ATGGCAACCAAAACGATGATGT3’)和GbEXPATR(5’CATAAATATCATGCACCTCCCAC3’)擴(kuò)增出GbEXPATR基因的全長ORF(567bp)。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min；94°C30sec,60°C30sec，72°C30sec，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測(cè)序，獲得所需的基因全長0RF。結(jié)果表明:該基因是從海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫中分離克隆到的全長序列，該基因的cDNA序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，該基因的ORF的序列是SEQIDNO:3，或至少50%同源性的序列，以及上述DNA片段編碼的蛋白:該基因翻譯后對(duì)應(yīng)的蛋白，為與SEQIDNO:3所示的蛋白質(zhì)的序列。本發(fā)明克隆的基因GbEXPATR基因在海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期中均有一定量的表達(dá)，在伸長期的纖維中的表達(dá)量相對(duì)較高，隨著纖維的發(fā)育表達(dá)量下降，但在根、莖、葉、花瓣、花藥和柱頭中沒有表達(dá)。[0010]根據(jù)上述GbEXPATRcDNA設(shè)計(jì)超表達(dá)引物，在引物兩端分別加上NcoI和BstEII的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，我們分別將該引物命名為引物GbEXPATRPoef和GbEXPATRPoer，再以GbEXPATR基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物通過酶切連接的方法連入到以相同酶消化的pCAMBIA230r載體上(pCAMBIA230r載體的前體是由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture惠贈(zèng)的pCAMBIA2301，通過PCR介導(dǎo)突變法去掉載體pCAMBIA2301的NPTII上游的Nco1、BglII兩個(gè)酶切位點(diǎn)改造而成，可由專利發(fā)明人張獻(xiàn)龍直接提供)，構(gòu)建得到一種過量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR，所述的過量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示核苷酸片段的表達(dá)載體，一種過量表達(dá)載體P35S::GbEXPATR，所述的表達(dá)載體為植物表達(dá)載體pCAMBIA2301m。其表達(dá)翻譯后形成含有SEQIDNO:2所示序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。[0011]上述克隆的基因GbEXPATR在促進(jìn)棉花纖維細(xì)胞伸長、馬克隆值降低、斷裂比強(qiáng)度升高中等到應(yīng)用，其應(yīng)用的具體過程是:[0012]將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水稻組林擁軍提供)，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化棉花，所采用的轉(zhuǎn)化受體材料為YZ-1(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所馬奇祥惠贈(zèng))，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化棉花的方法參照J(rèn)in等的文獻(xiàn)(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519-524)。轉(zhuǎn)化方法和程序參照J(rèn)in等建立的高效轉(zhuǎn)化體系(Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCell,TissueandOrganCulture,85:181-185，2006)。[0013]GbEXPATR基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因系得到3個(gè)表達(dá)量較高的家系。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系提取基因組DNA，通過Southernblot分析，鑒定其轉(zhuǎn)基因的效果以及拷貝數(shù)。按單株提取轉(zhuǎn)基因株系總RNA，每個(gè)株系至少三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，通過RealtimePCR進(jìn)行表達(dá)分析，Realtime-PCR方法同實(shí)施例2。[0014]通過HFT9000大容量纖維測(cè)試儀對(duì)成熟纖維長度、馬克隆值、斷裂比強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，轉(zhuǎn)基因超表達(dá)的三個(gè)株系0E2、0E3和0E4的成熟纖維長度對(duì)比野生型顯著增長了1.6-2.1毫米；馬克隆值下降了0.23-0.38，使纖維從C2級(jí)上升到B2級(jí)；斷裂比強(qiáng)度升高了1-1.73cN/texo[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):[0016](I)通過海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫中得到缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞壁伸展蛋白GbEXPATR基因，本發(fā)明的方法高效，準(zhǔn)確性高。[0017](2)將攜帶有本發(fā)明GbEXPATR基因的表達(dá)載體載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(ffeissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463；GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)。[0018](3)通過轉(zhuǎn)基因?qū)bEXPATR基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證，證實(shí)該基因的高效表達(dá)能夠顯著提高棉花纖維中GbEXPATR的表達(dá)量，從而進(jìn)一步促進(jìn)棉花纖維細(xì)胞的伸長、馬克隆值的降低、斷裂比強(qiáng)度的升高，為棉花纖維品質(zhì)改良創(chuàng)造了理論基礎(chǔ)。[0019](4)可使用包括本發(fā)明的GbEXPATR基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主是包括棉花在內(nèi)多種植物，來促進(jìn)細(xì)胞的伸長；可使用包括本發(fā)明的GbEXPATR基因片段為靶標(biāo)的連接35S高效啟動(dòng)子的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主棉花，可用于培育較長纖維的棉花品種?！緦＠綀D】【附圖說明】[0020]序列表SEQIDNO:1是從海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫中分離出一條與其它植物a-expansin基因同源度較高的cDNA序列，序列全長為820bp，其中該序列的第52-306bp所在的區(qū)段是該基因的編碼區(qū)，它編碼85個(gè)氨基酸。[0021]序列表SEQIDNO:2是上述GbEXPATR基因片段編碼區(qū)的蛋白質(zhì)的序列。[0022]序列表SEQIDNO:3是從上述SEQIDNO:1所述的cDNA序列中分離出的完整ORF(缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的棉花a-expansin基因片段)，序列長度為567bp。序列I包含序列SEQIDNO:3o[0023]圖1:采用ClustalW軟件(公開使用軟件)對(duì)GbEXPATR基因序列的分析結(jié)果。[0024]結(jié)果表明:與陸地棉的6個(gè)a-expansin基因相比(AF512539,AF512540,AF512541，AF512542,AF512543和AF512544)，GbEXPATR基因的氨基酸序列在N端的a-expansin信號(hào)肽以及6-8個(gè)半胱氨酸殘基和HFD基元(His-Phe-Aap)是完全保守的。[0025]圖2:利用Real-timePCR方法檢測(cè)GbEXPATR基因在棉花不同組織中的表達(dá)水平。圖中顯不:[0026]GbEXPATR基因只在海島棉3_79纖維發(fā)育不同時(shí)期中有表達(dá)，在陸地棉TM-1中沒有表達(dá)。在伸長期的纖維中的表達(dá)量相對(duì)較高，并隨著纖維的發(fā)育表達(dá)量下降，但在根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭沒有表達(dá)。選取的24個(gè)組織分別是海島棉3-79和陸地棉TM-1的:1.根；2.莖；3.葉；4.花瓣；5.花藥；6.柱頭；7.0DPA胚珠；8.5DPA纖維；9.1ODPA纖維；10.15DPA纖維；11.20DPA纖維；12.25DPA纖維(DPA:daypostanthesis開花后天數(shù))。[0027]圖3:是本發(fā)明利用的原始質(zhì)粒和改造后的質(zhì)粒圖。其中:圖3A是質(zhì)粒PCAMBIA2301的原始質(zhì)粒圖，圖3B是本發(fā)明構(gòu)建的超量表達(dá)載體所用的pCAMBIA2301m質(zhì)粒圖，圖3C是本發(fā)明構(gòu)建的過量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR圖。[0028]圖4=GbEXPATR轉(zhuǎn)基因棉花Southern雜交檢測(cè)結(jié)果。圖中:0E為超表達(dá)株系，其中0E2為雙拷貝，0E3和0E4為單拷貝。[0029]圖5:通過Realtime-PCR方法對(duì)GbEXPATR轉(zhuǎn)基因棉花T4代進(jìn)行表達(dá)分析的結(jié)果。[0030]取10DPA、15DPA.20DPA的纖維提取總RNA對(duì)GbEXPATR轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行表達(dá)分析。通過Realtime-PCR對(duì)GbEXPATR轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明在0E2、0E3和0E4三個(gè)株系中的表達(dá)量顯著提高。[0031]圖6=GbEXPATR轉(zhuǎn)基因棉花圖片，GbEXPATR能促進(jìn)纖維變長。[0032]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明?！揪唧w實(shí)施方式】[0033]實(shí)施例1=GbEXPATR基因分離克隆及其在棉花不同組織的表達(dá)特性[0034]申請(qǐng)人:的作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的前期工作中從建立的海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫(Tu,L.L.;等Genesexpressionanalysesofsea-1slandcotton(GossypiumbarbadenseL.)duringfiberdevelopment.Plantcellreports2007,26(8),1309-1320.)中分離出一條與陸地棉細(xì)胞壁伸展蛋白a-expansin基因(基因登陸號(hào):AF043284)高度同源但缺少第二個(gè)結(jié)構(gòu)域的cDNA(見SEQIDNO:1),生物信息學(xué)分析表明，該cDNA包含一個(gè)完整的ORF(見SEQIDNO:3)，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可知該ORF可以翻譯出一條非完整的a-expansin蛋白(其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列見SEQIDN0:2)，我們將該片段命名為GbEXPATR基因。該基因在纖維伸長各個(gè)時(shí)期高效表達(dá)，從海島棉品種3-79中提取10DPA纖維總RNA(提取方法參照Zhu等報(bào)道的方法:Zhu等。AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0用引物GbEXPATR(5，ATGGCAACCAAAACGATGATGT3’)和GbEXPATR(5’CATAAATATCATGCACCTCCCAC3’)擴(kuò)增出GbEXPATR基因的全長ORF(567bp)。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min；94°C30sec,60°C30sec，72°C30sec，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司總代理)，篩選陽性克隆并測(cè)序，獲得所需的基因全長0RF。結(jié)果表明:該基因是從海島棉纖維發(fā)育不同時(shí)期cDNA文庫中分離克隆到的全長序列，該基因的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，其中第52_306bp處的區(qū)段為該基因的編碼框即ORF(見SEQIDNO:1中所示對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，編碼85個(gè)氨基酸)，該基因編碼的蛋白質(zhì)的序列見SEQIDN0:3所不。[0035]實(shí)施例2:超量表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化[0036]為了驗(yàn)證GbEXPATR基因在棉花中的功能，申請(qǐng)人:構(gòu)建了超量表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化棉花。[0037]根據(jù)實(shí)施例1中得到GbEXPATRcDNA的ORF區(qū)域(見SEQIDNO:1中52-306堿基對(duì)應(yīng)的區(qū)域)設(shè)計(jì)超表達(dá)引物對(duì)(該引物對(duì)的DNA序列見本段后的描述)，我們?cè)谝飳?duì)兩端分別加上NcoI和BstEII的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，分別將該引物對(duì)命名為引物GbEXPATRPoef和GbEXPATRPoer，再以GbEXPATR基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物通過酶切連接的方法連入到以相同酶消化的PCAMBD^SOlni載體上(pCAMBIA2301m載體的前體是由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture惠贈(zèng)的pCAMBIA2301,通過PCR介導(dǎo)突變法去掉載體PCAMBIA2301的NPTII上游的Nco1、BglII兩個(gè)酶切位點(diǎn)改造而成(pCAMBIA230r載體圖見圖3B)，構(gòu)建得到一個(gè)過量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR(見圖3C):用GbEXPATR的基因片段替換了pCAMBIA230r載體中的GusSecondExon片段。超量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR含有SEQIDNO:2所示的其中之一核苷酸片段的表達(dá)載體，其表達(dá)翻譯后形成含有SEQIDNO:2的序列。本發(fā)明構(gòu)建的超量表達(dá)載體p35S::GbEXPATR的圖譜見圖3C。[0038]上述引物對(duì)的DNA序列如下:[0039]GbEXPATRPoef:5’gcgtCCATGGCAACCAAAACGATGATGT3’；[0040]GbEXPATRPoer:5’gtcGGTCACCCATAAATATCATGCACCTCCCAC3’。[0041]將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化棉花，所采用的轉(zhuǎn)化受體材料為棉花YZ-1，該材料是本申請(qǐng)人:所在的作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花課題組經(jīng)過大量的篩選發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有很高胚胎發(fā)生能力的材料(Jin等，Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,200650(4):519-524),農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化棉花的方法參照J(rèn)in等的文獻(xiàn)(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006,50:519-524)o轉(zhuǎn)化方法和程序參照J(rèn)in等建立的高效轉(zhuǎn)化體系(Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL).PlantCell,TissueandOrganCulture，85:181-185，2006)，并作了相應(yīng)的調(diào)整和修改，具體方法和流程如下:[0042]1、無菌苗的培養(yǎng)[0043]將陸地棉YZ-1)棉籽殼去掉，先用0.1%的升汞溶液滅菌十分鐘，無菌水沖洗三遍，接種于無菌苗培養(yǎng)基上(配方如下:2/lMS大量元素+葡萄糖15g.l-1+植物膠phytagel2.5g.L_1)，滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基的pH至7.0，在121°C的高壓蒸汽下滅菌30min，將接種后的培養(yǎng)容器置于培養(yǎng)室內(nèi)，280C，暗培養(yǎng)3-6天。[0044]2..農(nóng)桿菌的活化和保存[0045]2..1培養(yǎng)基和相關(guān)材料的準(zhǔn)備:[0046]農(nóng)桿菌LBA4404;制備含卡那霉素50mg.l-1的MGL液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的配方:胰化蛋白胨5g/L，氯化鈉5g.L'MgSCM.7H200.1g.ΙΛΚΗ2Ρ040.25g.L—1，甘露醇5g.L—1，甘氨酸1.0g.L—1，用蒸餾水補(bǔ)充培養(yǎng)基至1L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0);滅菌的三角瓶；LB培養(yǎng)基(固體、液體)(配方:胰化蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化鈉5g/L+瓊脂粉15g/L，滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基的pH至7.0，在121°C的高壓蒸汽下滅菌；卡那霉素50mg.l-1;滅菌甘油；槍頭；5mL離心管。接種后的培養(yǎng)容器置于培養(yǎng)室內(nèi)。[0047]2..2操作:[0048]2..2..1活化，懸浮:[0049]從超低溫冰箱內(nèi)取出保存的具有超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404的甘油管在冰上融化，LB平皿上劃線，26.5°C暗培養(yǎng)36-48hr，待皿內(nèi)長出清晰的單菌落，挑取單菌落在另外的LB平皿劃線，26.5°C暗培養(yǎng)36-48hr，待皿內(nèi)長出足夠的菌落結(jié)束培養(yǎng)，把培養(yǎng)基表面菌落刮入三角瓶內(nèi)的MGL培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)2hr，使OD值在0.5-1.5之間即可用于侵染。[0050]2..2..2菌株的保存:[0051]從培養(yǎng)皿內(nèi)挑取單菌落接于LB液體培養(yǎng)基中150rpm，26°C搖48hr，按菌液和甘油體積比為1:1加入到1.5mL離心管混勻，-70°c保存。[0052]3..浸染，共培養(yǎng):[0053]3..I準(zhǔn)備:[0054]暗培養(yǎng)5天左右幼嫩健壯的YZ-1幼苗，經(jīng)活化的農(nóng)桿菌，無菌培養(yǎng)皿和無菌濾紙[0055]3..2操作:[0056]無菌條件下將YZ-1幼苗下胚軸用鋒利的刀片切成0.5-lcm長的切段，轉(zhuǎn)入到經(jīng)活化的農(nóng)桿菌菌液中，攪勻，靜置5-10分鐘，倒掉菌液，濾紙吸干殘余菌液，吹5分鐘使表面稍為干燥，薄層分散布于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(配方:MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)物+2，4-D0.lmg/L+KT(激動(dòng)素)0.lmg/L+氯化鎂lg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,調(diào)pH至7.0)，于19-21°C暗培養(yǎng)38-42小時(shí)。[0057]4..愈傷組織的誘導(dǎo)[0058]將侵染共培養(yǎng)后的下胚軸切段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(配方:MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)物+2，4-D0.lmg/L+KT(激動(dòng)素)0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L),滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0。[0059]5、非胚性愈傷組織的增殖[0060]非胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)基如下所示:MS無機(jī)鹽(其中硝酸鉀的量加倍，硝酸銨的量減半)+B5有機(jī)物+2，4-D0.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0。[0061]6、愈傷組織的分化[0062]愈傷組織經(jīng)繼代(一個(gè)月繼代一次)幾次后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)化成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上(配方:MS基本培養(yǎng)基+B5有機(jī)物+激動(dòng)素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L)，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0，使其進(jìn)一步分化成胚狀體。[0063]7、胚性愈傷組織的繼代[0064]胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)基如下所示:[0065]MS無機(jī)鹽(其中硝酸鉀的量加倍，硝酸銨的量減半)+B5有機(jī)物+ΚΤ0.15mg/L+1BA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/L+天冬酰胺(Asn)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0。[0066]8、成苗生根培養(yǎng)[0067]將分化出的小苗繼代到1/2MS培養(yǎng)基中成苗生長培養(yǎng)基上(配方:1/2MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7.0)。[0068]9、煉苗移栽[0069]將生根良好的小苗揭開三角瓶封口膜，煉苗2-3天，然后移栽到小土缽中，遮蔭緩苗一周左右移栽大田。[0070]實(shí)施例3=GbEXPATR轉(zhuǎn)基因株系相關(guān)分析[0071]1、GbEXPATR轉(zhuǎn)基因株系分子鑒定[0072]通過GbEXPATR基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因系得到3個(gè)轉(zhuǎn)基因家系，分別命名為:0E2、0E3和0E4。從所獲得的轉(zhuǎn)基因家系中提取基因組DNA(按常規(guī)方法)，通過Southernblot分析，鑒定其轉(zhuǎn)基因的效果以及拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)基因家系基因組DNA提取方法和Southern實(shí)驗(yàn)參照J(rèn).薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版報(bào)道的方法。結(jié)果見圖4所示。[0073]2、GbEXPATR轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)分析[0074]按單株提取轉(zhuǎn)基因株系總RNA(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)，每個(gè)株系至少三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，通過RealtimePCR進(jìn)行表達(dá)分析，Realtime-PCR方法與實(shí)施例2相同，具體分析方法參考涂禮莉報(bào)道的方法(涂禮莉.海島棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)譜分析及功能基因的發(fā)掘.[博士學(xué)位論文].武漢.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，2007.中國知網(wǎng)網(wǎng)址:http://www.cnk1.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=ll&CurRec=3&dbname=CDFD9908&fiIename=2007209600.nh&urIid=&yx=&uid=WEEvREcwSIJHSIdTTGJhYlRaSXUwTVpZUXF0cnY5WGVoUWR6R25PVTVRYUtudHZHUi8xKzNtbFhqaUJSTGZjeg==)，結(jié)果見圖5。[0075]3、GbEXPATR轉(zhuǎn)基因株系表型分析[0076]在田間取10月中下旬在湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)棉田收獲的棉花進(jìn)行纖維品質(zhì)分析，采用型號(hào)為HFT9000大容量纖維測(cè)試儀進(jìn)行成熟纖維品質(zhì)分析(按常規(guī)方法)，結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因超表達(dá)的三個(gè)株系0E2、0E3和0E4的成熟纖維長度對(duì)比野生型(非轉(zhuǎn)基因)植株顯著增長了1.6-2.1毫米；馬克隆值下降了0.23-0.38，使纖維從C2級(jí)上升到B2級(jí)；斷裂比強(qiáng)度升高了1-1.73cN/tex0詳細(xì)結(jié)果見表1。[0077]表1轉(zhuǎn)基因棉花纖維品質(zhì)參數(shù)[0078]【權(quán)利要求】1.一種分離、克隆自棉花的調(diào)控海島棉纖維伸長期、轉(zhuǎn)換期及次生壁合成初期優(yōu)勢(shì)表達(dá)棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.一種分離、克隆自棉花的調(diào)控海島棉纖維伸長期、轉(zhuǎn)換期及次生壁合成初期優(yōu)勢(shì)表達(dá)棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQIDNO:2所示。3.權(quán)利要求1或2所述的棉花細(xì)胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR在調(diào)控海島棉纖維伸長期、轉(zhuǎn)換期及次生壁合成初期優(yōu)勢(shì)表達(dá)中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C12N15/29GK103789325SQ201410073300【公開日】2014年5月14日申請(qǐng)日期:2014年2月28日優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日【發(fā)明者】張獻(xiàn)龍,李陽,涂禮莉,袁道軍申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)