一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域。該方法是將丙二酰輔酶A還原酶、丙二酸半醛還原酶、3-羥基丙酰輔酶A合成酶、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶和丙烯酰輔酶A還原酶基因中的一種或多種在生物中表達(dá)，通過固定二氧化碳以生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了改造微生物直接利用二氧化碳合成3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸，不需利用石油資源來進(jìn)行化學(xué)合成，減少了對石油的消耗和環(huán)境的污染，是一種可再生的、低消耗、環(huán)保的技術(shù)，可緩解當(dāng)前的溫室效應(yīng)。通過微生物固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸可直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]生物界中幾乎所有的自養(yǎng)生物都是通過固碳過程得到所需的碳源，大氣中的二氧化碳的固定至關(guān)重要，被認(rèn)為是地球上最重要的生命過程之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的固定二氧化碳的途徑有:卡爾文循環(huán)，還原檸檬酸循環(huán)，還原乙酰輔酶A循環(huán)和3-羥基丙酸循環(huán)，2007年，Georg Fuchs課題組在古生菌sedula中發(fā)現(xiàn)了第五種二氧化碳固定方式:3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)(Berg I A, Kockelkorn D, Buckel ff, et al.A3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilationpathway in Archaea.Science, 2007, 318(5857): 1782-1786.)，其特點(diǎn)是經(jīng)過一個(gè)循環(huán)固定二分子二氧化碳形成一份子乙酰輔酶A，循環(huán)中存在3-羥基丙酸和4-羥基丁酸中間代謝物，故稱為3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)。
[0004]3-羥基丙酸具有羥基和羧基兩個(gè)官能團(tuán)，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的前體，是一種重要的化工平臺(tái)產(chǎn)品。2004年美國能源部將其列為當(dāng)今世界12種最具潛力的化工產(chǎn)品之一。丙烯酸是重要的有機(jī)合成原料及合成樹脂單體，是聚合速度非?？斓囊蚁╊悊误w，其聚合物用于合成樹脂 、膠黏劑、合成橡膠、合成纖維、高吸水性樹脂、制藥、建材、石油開采、涂料等工業(yè)部門。同時(shí)，丙烯酸是水溶性聚合物的重要原料之一，與淀粉共聚可制得超強(qiáng)性吸水劑。丙酸主要用途為:用作酯化劑、硝酸纖維素的溶劑、增塑劑、化學(xué)試劑盒配制食品原料等。丙酸的防真菌和霉菌效果在PH值6以下時(shí)優(yōu)于苯甲酸，價(jià)格低于山梨酸，是理想的食品防腐劑之一，因而作為食品防腐劑在我國具有巨大的潛在市場。丙酸可以用于生產(chǎn)丙酰胺，進(jìn)而生產(chǎn)部分除草劑品種。在醫(yī)藥行業(yè)，丙酸的主要衍生物有維生素B6、萘普生、腦脈寧等。丙酸還可以制作成香料，用于食品、化妝品、肥皂的香料。另外，還在可以用丙酸來制取可生物降解塑料等。目前，3-羥基丙酸，丙烯酸和丙酸主要是通過化學(xué)法合成，但是，目前的化學(xué)合成法不但成本高，還會(huì)造成環(huán)境污染，消耗珍貴的石油資源。
[0005]目前工業(yè)上已經(jīng)有許多利用微生物生產(chǎn)發(fā)酵獲得產(chǎn)品的成功實(shí)例。通過微生物固定二氧化碳來生產(chǎn)3-羥基丙酸，丙烯酸和丙酸具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供一種生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的的微生物。[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，包括如下步驟:將編碼如下功能蛋白的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi):丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體，使微生物能夠表達(dá)相應(yīng)的功能蛋白。所述的丙二酰輔酶A還原酶可將丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)楸岚肴?，丙二酸半醛還原酶可將丙二酸半醛轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基丙酸，3-羥基丙酰輔酶A合成酶可將3-羥基丙酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基丙酰輔酶A，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶可將3-羥基丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A，丙烯酰輔酶A還原酶可將丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A。
[0009]優(yōu)選的，將編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體和丙二酸半醛還原酶或其功能等同體的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)3-羥基丙酸；
將編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體以及3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)丙烯酸；
將編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)丙酸。
[0010]優(yōu)選的，所述的丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體為:1)SEQ ID N0.1所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID N0.1所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與其具有同 等功能的蛋白；丙二酸半醛還原酶或其功能等同體為:1)SEQ ID N0.2所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID N0.2所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與其具有同等功能的蛋白；3_羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體為:1)SEQ ID N0.3所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2)SEQ ID N0.3所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與其具有同等功能的蛋白；3_羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體為:1)SEQ ID N0.4所示氨基酸序列組成的蛋白；*,2)SEQ ID N0.4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與其具有同等功能的蛋白；丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體為:1)SEQ ID N0.5所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQID N0.5所示氨基酸插入、取代和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸組成的與其具有同等功能的蛋白。
[0011]更優(yōu)選的，所述的丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的編碼基因?yàn)镸etallosphaera sedulaMsed_0709、Msed_1993、Msed_1456、Msed_2001 以及 Msed_1426 基因。
[0012]所述的微生物包括為原核微生物或真核微生物中的至少一種(可以是自養(yǎng)微生物也可以是異養(yǎng)微生物)；優(yōu)選的，所述的微生物為選自細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種；更優(yōu)選的，所述的微生物為酵母或大腸桿菌。
[0013]所述的基因的表達(dá)方式為通過誘導(dǎo)或自主表達(dá)。
[0014]所述的二氧化碳包括環(huán)境中的或者微生物代謝產(chǎn)生的。[0015]此外，所述的方法還包括通過:根據(jù)微生物密碼子的偏愛性對編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因中至少一種進(jìn)行優(yōu)化以提高3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的的產(chǎn)量；或改造微生物的代謝途徑使以提高乙酰輔酶A和/或丙二酰輔酶A的量以提高3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的產(chǎn)量，如:敲除消耗乙酰輔酶A的其他途徑以提高乙酰輔酶A的量，過量表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶以提高丙二酰輔酶A的量。
[0016]一種生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，包含有編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因中的至少一種。
[0017]所述的基因通過克隆于載體上，再轉(zhuǎn)化到微生物內(nèi)表達(dá)。
[0018]所述的微生物可過量表達(dá)乙酰輔酶A和/或丙二酰輔酶A。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在微生物中引入外源基因以實(shí)現(xiàn)固定二氧化碳來生產(chǎn)3-羥基丙酸，丙烯酸和丙酸的目的，不需利用石油資源來進(jìn)行化學(xué)合成，減少了對珍貴石油資源的消耗，減少了對環(huán)境的污染，更重要的是利用二氧化碳來生產(chǎn)化學(xué)品，真正實(shí)現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展，另一方面可以大大緩解溫室效益，對人類生活質(zhì)量具有重要的意義。同時(shí)，由于絕大數(shù)微生物生長速度快，易于改造，不受天氣季節(jié)等影響，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)。本發(fā)明表面改造微生物固定二氧化碳來進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)是切實(shí)可行的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為質(zhì)粒pYWl的示意圖，Msed_0709基因通過其兩端的和&oRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆于pER28a質(zhì)`粒上。
[0021]圖2為質(zhì)粒pYW2的示意圖，Msed_1456基因通過其兩端的和&oRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆于pER28a質(zhì)粒上。
[0022]圖3為質(zhì)粒pYW3的示意圖，Msed_2001基因通過其兩端的和&oRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆于pER28a質(zhì)粒上。
[0023]圖4為質(zhì)粒pYW4的示意圖，Msed_1993基因通過其兩端的和歷限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆于pER28a質(zhì)粒上。
[0024]圖5為質(zhì)粒pYW5的示意圖，Msed_1426基因通過其兩端的和&oRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆于pER28a質(zhì)粒上。
[0025]圖6為質(zhì)粒pYW6的示意圖，將質(zhì)粒pYW2上的Msed_1456基因片段酶切下來后連接在pYWl上Msed_0709基因后端，同時(shí)表達(dá)Msed_1456和Msed_0709基因。
[0026]圖7為質(zhì)粒pYW7的示意圖，將質(zhì)粒pYW3上的Msed_2001基因片段酶切下來后連接在 pYW2 上 Msed_1456 基因后端，同時(shí)表達(dá) Msed_1456、Msed_0709 和 Msed_2001 基因。
[0027]圖8為質(zhì)粒pZL31的示意圖，將質(zhì)粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下來后連接在pYWl上Msed_0709基因后端，同時(shí)表達(dá)Msed_1993和Msed_0709基因。
[0028]圖9為質(zhì)粒pZL32的示意圖，將質(zhì)粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下來后連接在 PYW7 上 Msed_2001 基因后端，同時(shí)表達(dá) Msed_1993、Msed_1456、Msed_0709 和Msed_2001 基因。
[0029]圖10為質(zhì)粒pZL33的示意圖，將質(zhì)粒pYW5上的Msed_1426基因片段酶切下來后連接在 PYW7 上 Msed_2001 基因后端，同時(shí)表達(dá) Msed_1426、Msed_1456、Msed_0709 和Msed_2001 基因。
[0030]圖11為質(zhì)粒pZL34的示意圖，將質(zhì)粒pYW4上的Msed_1993基因片段酶切下來后連接在PZL33 上Msed_1426 基因后端，同時(shí)表達(dá)Msed_1993、Msed_1426、Msed_1456、Msed_0709和 Msed_2001 基因。
[0031]圖12為質(zhì)粒pDGOOl的示意圖，將釀酒酵母雙基因共表達(dá)載體pESC_URA上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GALl和GALlO分別替換成組成型啟動(dòng)子TEFl和HXT7。
[0032]圖13為質(zhì)粒pZL35的示意圖，將Msed_1993基因克隆于pDGOOl質(zhì)粒上。
[0033]圖14為質(zhì)粒pZL36的示意圖，將Msed_0709基因克隆在pZL35質(zhì)粒上，同時(shí)表達(dá)Msed_1993 和 Msed_0709 基因。
[0034]圖15為在大腸桿菌中共表達(dá)PZL31和pMSD8質(zhì)粒，發(fā)酵提取產(chǎn)物后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定有3-羥基丙酸產(chǎn)生的圖。
[0035]圖16為在大腸桿菌中共表達(dá)PZL32和pMSD8質(zhì)粒，發(fā)酵提取產(chǎn)物后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定有丙烯酸產(chǎn)生的圖。
[0036]圖17為在大腸桿菌中共表達(dá)PZL34和pMSD8質(zhì)粒，發(fā)酵提取產(chǎn)物后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定有丙酸產(chǎn)生的圖。
[0037]圖18為在釀酒酵母中表達(dá)PZL36質(zhì)粒，發(fā)酵提取產(chǎn)物后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定有3-羥基丙酸產(chǎn)生的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]本發(fā)明的目的通過以下措施來達(dá)到:
在微生物體內(nèi)引入外源基因一丙二酰輔酶A還原酶基因和丙二酸半醛還原酶基因，從而催化自身的丙二酰輔酶A得到3-羥基丙酸。
[0039]在微生物體內(nèi)引入外源基因一丙二酰輔酶A還原酶基因，丙二酸半醛還原酶基因，3-羥基丙酰輔酶A合成酶基因和3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因，從而催化自身的丙二酰輔酶A得到丙烯酸。
[0040]在微生物體內(nèi)引入外源基因一丙二酰輔酶A還原酶基因，丙二酸半醛還原酶基因，3-羥基丙酰輔酶A合成酶基因，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙烯酰輔酶A還原酶基因，從而催化自身的丙二酰輔酶A得到丙酸。
[0041]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0042]實(shí)施例中選用一種大腸桿菌BL21 (DE3)作為生產(chǎn)菌株，選取其表達(dá)載體pET28a。同時(shí)，選用一種尿嘧啶缺陷型釀酒酵母CEN.PK2-1C，同時(shí)選取其表達(dá)雙基因共表達(dá)載體pESC-URA,并將其兩個(gè)啟動(dòng)子均改造成組成型。
[0043]將編碼M?ta』JospAaera seWa丙二酰輔酶A還原酶、3_羥基丙酰輔酶A合成酶、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶、丙二酸半醛還原酶和丙烯酰輔酶A還原酶的基因Msed_0709、Msed_1456、Msed_2001、Msed_1993 和 Msed_1426 (GenBank: CP000682.1)分別構(gòu)建到表達(dá)載體pET28a上得到質(zhì)粒pYWl、pYW2、pYW3、pYW4和pYW5，質(zhì)粒示意圖見附圖1_5。[0044]認(rèn)Metallosphaera的基因組為模板,通過使用如下引物PCR擴(kuò)增各基因片段，加下劃線的是酶切位點(diǎn):
【權(quán)利要求】
1.一種在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于包括如下步驟:將編碼如下功能蛋白的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi):丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體，使微生物能夠表達(dá)相應(yīng)的功能蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于: 將編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體和丙二酸半醛還原酶或其功能等同體的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)3-羥基丙酸； 或?qū)⒕幋a丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體以及3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體的基因中的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)丙烯酸； 或?qū)⒕幋a丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因的至少一種轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)可生產(chǎn)丙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因?yàn)閟edulaMsed_0709、Msed_1993、Msed_1456、Msed_2001 以及 Msed_1426 基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的 微生物為原核微生物或真核微生物中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的基因的表達(dá)方式為通過誘導(dǎo)或自主表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于:所述的二氧化碳包括環(huán)境中的或者微生物代謝產(chǎn)生的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在微生物體內(nèi)固定二氧化碳生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法，其特征在于: 通過提高微生物體內(nèi)乙酰輔酶A和/丙二酰輔酶A的量以提高3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的產(chǎn)量； 或根據(jù)微生物密碼子的偏愛性對編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因中至少一種進(jìn)行優(yōu)化以提高3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的的產(chǎn)量。
8.—種生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:包含有編碼丙二酰輔酶A還原酶或其功能等同體、丙二酸半醛還原酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A合成酶或其功能等同體、3-羥基丙酰輔酶A脫水酶或其功能等同體以及丙烯酰輔酶A還原酶或其功能等同體的基因中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述 的生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:所述的基因通過克隆于載體上，再轉(zhuǎn)化到微生物內(nèi)表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)3-羥基丙酸、丙烯酸和丙酸的微生物，其特征在于:所述的微生物可過量表達(dá)乙酰輔酶A和/或丙二酰輔酶A。
【文檔編號】C12N1/19GK103805641SQ201410035584
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】劉天罡, 柳志杰, 王藝璇, 鄧子新 申請人:武漢大學(xué)