導(dǎo)入了二氧化碳的固定途徑的微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明要解決的問題在于提供利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA的乙酰CoA生產(chǎn)微生物及使用其的物質(zhì)生產(chǎn)方法。本發(fā)明的乙酰CoA生產(chǎn)微生物具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)微生物是通過賦予選自蘋果酸硫激酶、蘋果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2－羥基－3－氧代丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種酶活性而得到的。
【專利說明】導(dǎo)入了二氧化碳的固定途徑的微生物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乙酰CoA生產(chǎn)微生物及使用其的物質(zhì)生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙酰CoA是微生物的代謝途徑中的極其重要的中間體之一。各種代謝產(chǎn)物經(jīng)由乙酰CoA被生產(chǎn)。作為這樣的經(jīng)由乙酰CoA被生成的物質(zhì)的例子，例如已知L 一谷氨酸、L -谷氨酰胺、L 一脯氨酸、L 一精氨酸、L 一亮氨酸、L 一異亮氨酸等氨基酸類；乙酸、丙酸、丁酸、己酸、檸檬酸、3 —羥基丁酸、3 —羥基異丁酸、3 —氨基異丁酸、2 —羥基異丁酸、甲基丙烯酸及聚一 3 —羥基丁酸等有機(jī)酸類；異丙醇、乙醇、丁醇等醇類；其他如丙酮、聚谷氨酸等。
[0003]在多數(shù)微生物的情況下，乙酰CoA以葡萄糖等糖為碳源進(jìn)行生產(chǎn)。糖首先經(jīng)過埃姆登.邁耶霍夫途徑(Embden — Meyerhof pathwa y)、恩特納?杜多羅夫途徑(Entner —Doudoroff pathway)、戍糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway)等被稱為糖酵解系統(tǒng)的代謝途徑而被轉(zhuǎn)化為丙酮酸。然后，在丙酮酸脫羧酶、丙酮酸一甲酸裂解酶等的作用下，被轉(zhuǎn)化為乙酰CoA。此時(shí)，二氧化碳、甲酸作為副產(chǎn)物而被生產(chǎn)，損失一部分來自糖的碳。因此，為了將二氧化碳再固定來增加乙酰CoA的產(chǎn)量，進(jìn)行了一些研究。
[0004]已知一些在微生物的體內(nèi)固定二氧化碳而作為碳源的途徑(Ap p1.Environ.Microbiol.77 (6),1925 — 1936 (2011))。具體而言，可舉出卡爾文?本森循環(huán)(Calvin —Benson cycle)、還原性 TCA循環(huán)(reductive TCA cycle)、Wood — Ljungdahl 途徑(Wood —Ljung dahl pathway) 、3 —羥基丙酸循環(huán)(3 — hydroxypropionate cycle)、4 —羥基丁酸循環(huán)(4 一 hydroxybutyrate cycle)等?？栁?本森循環(huán)是存在于植物、光養(yǎng)細(xì)菌的包括約12種酶的CO2固定途徑，通過核酮糖一 1，5 —雙磷酸羧化酶(RubisCO)固定CO2，最終生產(chǎn)甘油醒3—磷酸。還原性TCA循環(huán)是在以綠硫細(xì)菌(green sulfur bacter ia)為代表的厭氧菌、微需氧菌中可見的循環(huán)，包括11種酶，特征在于以鐵氧還原蛋白(ferredoxin)為輔酶的CO2固定酶(乙酰CoA羧化酶、2 —酮戍二酸合酶(2 — oxoglutarate synthase)),通過與通常的TCA循環(huán)方向相反的反應(yīng)，由CO2生產(chǎn)丙酮酸。Wood - Lju ngdahl途徑是在乙酸產(chǎn)生菌等厭氧性微生物中可見的途徑，包括9種酶，通過甲酸脫氫酶、CO脫氫酶等將C02、輔酶上的甲酸還原，最終轉(zhuǎn)化為乙酰CoA。3 一羥基丙酸循環(huán)是在綠屈撓菌屬(ChlOToflexus)菌等中可見的循環(huán)，包括13種酶，通過乙酰CoA (丙酰CoA)羧化酶的作用將CO2固定，經(jīng)由丙二酸單酰CoA等，生產(chǎn)乙酰CoA。4 一羥基丁酸循環(huán)是存在于古細(xì)菌等中的途徑，通過丙酮酸合酶、乙酰CoA(丙酰CoA)羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反應(yīng)而將CO2固定，經(jīng)由4 一羥基丁酰CoA等，生產(chǎn)乙酰CoA。
[0005]另一方面，作為構(gòu)想，也報(bào)道了一些將固定二氧化碳的途徑導(dǎo)入到生產(chǎn)有用化合物的微生物中來生產(chǎn)有用物質(zhì)的嘗試。例如國際公開第2009/094485號小冊子、國際公開第2010/071697號小冊子中，公開了使用導(dǎo)入了與乙酸菌的Wood — Ljungdahl途徑類似的途徑的微生物由二氧化碳生產(chǎn)乙酰CoA的提案。另外，作為固定CO2而生產(chǎn)有用化合物的例子，國際公開第2009/046929號小冊子中，公開了使用導(dǎo)入了氫化酶和四氫葉酸裂解酶(tetrahydrofolate lyase)的微生物由二氧化碳生產(chǎn)乳酸的嘗試。另外，國際公開第2011/099006號小冊子中，提出了經(jīng)由向乙酰CoA上的二氧化碳固定反應(yīng)、丙二酸單酰CoA的還原反應(yīng)而固定CO2的循環(huán)。德國專利申請公開第102007059248號說明書中，提出了利用與4 一羥基丁酸循環(huán)類似的途徑進(jìn)行的乙酰CoA的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]然而，從固定CO2而生產(chǎn)來自乙酰CoA的有用化學(xué)品這樣的觀點(diǎn)考慮，公知的二氧化碳固定循環(huán)不能說效率一定高。例如，卡爾文?本森循環(huán)作為自然界的二氧化碳固定循環(huán)最為有名，但擔(dān)負(fù)二氧化碳固定的RubisCO的反應(yīng)速度慢，而且還可見氧化分解這樣的副反應(yīng)，不能說是效率高的酶(Journal of Bioscience and Bioengin eering94 (6) 497 —505，2002)。另外，Wood — Ljungdahl途徑、國際公開第2009/094485號小冊子、國際公開第2010/071697號小冊子、國際公開第2009/046929號小冊子等中記載的途徑中，包括將CO2還原為CO、 甲酸的途徑，但這樣的還原反應(yīng)在通常的條件下是困難的，而且，催化這樣強(qiáng)還原反應(yīng)的酶只在還原性的環(huán)境下起作用的情況很多，不容易導(dǎo)入到絕對厭氧性的微生物以外的微生物中。在還原性TCA循環(huán)中，在中途的由丙酮酸合酶、2 —酮戊二酸合酶進(jìn)行的還原反應(yīng)中，需要以鐵氧還原蛋白作為電子受體的強(qiáng)還原力，不易進(jìn)行反應(yīng)。另外，4 一羥基丁酸循環(huán)、3 —羥基丙酸循環(huán)、國際公開第2011/099006號小冊子、國際公開第2009/046929號小冊子等中記載的途徑等中，利用琥珀酰CoA的還原、丙二酸單酰CoA的還原這樣的羧酸或其(硫代)酯的還原反應(yīng)，但這樣的反應(yīng)作為酶反應(yīng)通常是困難的，認(rèn)為作為發(fā)酵途徑期望盡可能地避免(Atsumi 等.，Nature, 451, (3), 86 — 89, 2008 ;Yim 等.，Nat.Chem.Biol.，7,445 - 452,2011).4 一羥基丁酸循環(huán)經(jīng)由4 一羥基丁酰CoA的脫水、3 —羥基丙酸的脫水這樣的脫水反應(yīng)，但存在這樣的反應(yīng)在水中經(jīng)常與逆反應(yīng)(水和)進(jìn)行競爭這樣的問題。另外，在4 一羥基丁酸循環(huán)、3—羥基丙酸循環(huán)、還原性TCA循環(huán)中，在丙二酸單酰Co A合成酶、丙酮酸合酶的作用下，生產(chǎn)出的乙酰CoA在循環(huán)內(nèi)被轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，因而從乙酰CoA的生廣的觀點(diǎn)考慮，不能說一定是有效率的。
[0007]進(jìn)而，當(dāng)將這樣的循環(huán)導(dǎo)入到微生物中而嘗試進(jìn)行某些物質(zhì)生產(chǎn)時(shí)，需要考慮構(gòu)成循環(huán)的酶的數(shù)目、應(yīng)重新賦予的酶活性的數(shù)目。即，構(gòu)筑循環(huán)的酶、賦予的酶的數(shù)目越多，除了控制越發(fā)變難以外，對微生物的負(fù)擔(dān)也越發(fā)增加。例如，如果要將Wood — Ljungdahl途徑導(dǎo)入至大腸桿菌，則至少需要導(dǎo)入9種基因，除了構(gòu)筑物質(zhì)生產(chǎn)的途徑之外，進(jìn)一步進(jìn)行這樣程度的導(dǎo)入基因并控制，可以說在現(xiàn)實(shí)中是極其困難的操作。通過賦予數(shù)目少的酶來構(gòu)筑由數(shù)目少的酶構(gòu)成的循環(huán)不僅在構(gòu)筑循環(huán)方面有利，而且在組合物質(zhì)生產(chǎn)途徑方面也是有利的，這是顯然的。
[0008]因此，對于固定CO2并轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，如下方面可以說是理想的:A.構(gòu)成途徑的各酶的活性足夠高，B.循環(huán)中不含消耗乙酰Co A的酶，C.新賦予的酶的數(shù)目少，循環(huán)簡單。然而，在迄今為止報(bào)道的由CO2生產(chǎn)乙酰CoA的循環(huán)中，還不存在滿足全部的A~C的條件的循環(huán)，均缺乏可操作性。其證據(jù)是，在現(xiàn)存的二氧化碳固定循環(huán)的提案中，迄今完全沒有實(shí)際將酶活性賦予工業(yè)上利用的微生物從而將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰CoA及來自乙酰CoA的物質(zhì)而用于發(fā)酵的例子。
[0009]本發(fā)明提供為了利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA有用的微生物、及使用該微生物制造乙酰CoA及來自乙酰CoA的有用的代謝產(chǎn)物的方法。
[0010]本發(fā)明如下所述。
[0011][I]乙酰CoA生產(chǎn)微生物，具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)微生物是通過如下方式得到的:向不具有下述(a)、(b)、(C)、(d)及(e)中任一種的微生物中，不賦予
(a)、(b)、(C)及(d)中任一種,或即使賦予也不發(fā)揮其功能,賦予選自蘋果酸硫激酶(malatethiokinase)、蘋果酰 CoA 裂解酶(malyl — Co A lyase)、乙醒酸醒連接酶(glyoxylatecarboligase)>2 —羥基一3 —氧代丙酸還原酶(2 — hydroxy — 3 — oxopropionatereductase)及羥基丙酮酸還原酶(hydroxypyruvate reductase)中的至少一種酶活性；
[0012](a)具有由丙二酸單酸CoA (malonyl — CoA)向丙二酸半醒(m alonatesemialdehyde)或3 —羥基丙酸(3 — hydroxypropionate)的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0013](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0014](c)具有由巴豆酰CoA (crotonyl CoA)和CO2向乙基丙二酸單酰CoA(ethylmalonyl 一 CoA)或戍烯二酸單酰CoA (glutaconyl CoA)的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0015](d)具有由CO2向甲酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0016]Ce)選自蘋果酸硫激酶和蘋果酰CoA裂解酶中的至少一種。
[0017][2] [I]所述 的乙酰Cok生產(chǎn)微生物，具有如下的乙酰Cok生產(chǎn)循環(huán):磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸經(jīng)由草酰乙酸、進(jìn)而通過蘋果酸硫激酶、蘋果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛連接酶而得到的2 —羥基一 3 —氧代丙酸進(jìn)一步經(jīng)由2 —磷酸甘油酸再次轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。
[0018][3] [I]或[2]所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)包括如下酶:
[0019](f)選自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一種，
[0020](g)蘋果酸脫氫酶，
[0021](h)蘋果酸硫激酶，
[0022](i)蘋果酰CoA裂解酶，
[0023](j)乙醛酸醛連接酶，
[0024](k)選自2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶、或羥基丙酮酸異構(gòu)酶及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種，
[0025](I)選自甘油酸2 —激酶、或磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一種，
[0026](m)烯醇化酶。
[0027][4] [I]~[3]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的微生物或?qū)儆诎魻罴?xì)菌(coryneform bacteria)的微生物。
[0028][5] [I]~[4]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為屬于腸桿菌科的微生物，為埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌或泛菌屬(Pantoea)細(xì)菌；或?qū)儆诎魻罴?xì)菌的微生物，為棒狀桿菌屬(C orynebacterium)細(xì)菌。
[0029][6] [I]~[5]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌具有的乳酸脫氫酶的活性被失活或降低。[0030][7] [I]~[6]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌具有的選自異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase)及蘋果酸合酶(malate synthase)中的至少一種酶的活性被失活或降低。
[0031][8] [I]~[7]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌中硫解酶(thiolase)活性、C oA轉(zhuǎn)移酶(CoA transferase)活性及乙酰乙酸脫羧酶(acetoacetate decarboxylase)活性被賦予或強(qiáng)化。
[0032][9] [I]~[8]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌中硫解酶活性、CoA轉(zhuǎn)移酶活性、乙酰乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性被賦予或強(qiáng)化。
[0033][10] [I]~[5]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為泛菌屬細(xì)菌，泛菌屬細(xì)菌具有的富馬酸水合酶(fumarate hyd ratase) A及富馬酸水合酶C的活性被失活或降低。
[0034][11] [I]~[5]及[10]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為泛菌屬細(xì)菌，泛菌屬細(xì)菌具有的蘋果酸合酶的活性被失活或降低。
[0035][12] [I]~[11]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其特征在于，使用如下的蘋果酸硫激酶，所述蘋果酸硫激酶中，對應(yīng)于來自扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸為異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸為谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸或精氨酸。
[0036][13]乙酰CoA生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用[I]~[12]中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)乙酰CoA。
[0037][14]丙酮生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用[9]或[12]所述的乙酰C oA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)丙酮。
[0038][15]異丙醇生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用[9]或[12]所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)異丙醇。
[0039][16]谷氨酸生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用[5]、[10]、[11]或[12]所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)谷氨酸。
[0040]通過本發(fā)明，可提供為了高效地將二氧化碳轉(zhuǎn)化為乙酰CoA而有用的微生物及使用該微生物制造乙酰CoA及有用的代謝產(chǎn)物的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041][圖1]為說明本發(fā)明涉及的二氧化碳的固定途徑的概要的途徑圖。
[0042][圖2A]為表示各種mtkB的序列同源性的圖。
[0043][圖2B]為表示各種mtkB的序列同源性的圖。
[0044][圖3A]為表示各種mtkA的序列同源性的圖。
[0045][圖3B]為表示各種mtkA的序列同源性的圖。
[0046][圖4]為表示實(shí)施例41涉及的向用各種泛菌屬細(xì)菌生產(chǎn)出的谷氨酸的13C導(dǎo)入圖的圖。
[0047][圖5]為表示實(shí)施例50涉及的向用各種棒狀桿菌屬細(xì)菌生產(chǎn)出的谷氨酸的13C導(dǎo)入圖的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明涉及的乙酰CoA生產(chǎn)微生物具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)微生物是通過如下方式得到的:向不具有下述(&)、(13)、((3)、((1)及(6)中任一種的微生物中，不賦予(a)、(b)、(C)及(d)中任一種，或即使賦予也不發(fā)揮其功能，賦予選自蘋果酸硫激酶、蘋果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種酶活性。
[0049](a)具有由丙二酸單酰CoA向丙二酸半醛或3 —羥基丙酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)。
[0050](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)。
[0051](c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸單酰CoA或戊烯二酸單酰CoA的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)。
[0052](d)具有由CO2向甲酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)。
[0053]Ce)選自蘋果酸硫激酶和蘋果酰CoA裂解酶中的至少一種。
[0054]通過本發(fā)明，可提供具有乙酰Cok生產(chǎn)循環(huán)的乙酰Cok生產(chǎn)微生物，對于所述乙酰CoA生產(chǎn)微生物，通過賦予規(guī)定的酶活性，而將在糖代謝中產(chǎn)生的CO2、從外部供給的CO2固定化，構(gòu)筑二氧化碳的固定循環(huán)，且能夠高效地將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰CoA。
[0055]即，本發(fā)明是這樣完成的:為了將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰CoA而進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):如上所述，向不具有下述(a)、(b)、(C)、(d)及(e)中任一種的微生物中，不賦予(a)、
(b)、(c)及(d)中任一種，或即使賦予也不發(fā)揮其功能，賦予選自蘋果酸硫激酶、蘋果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種酶活性，由此，可將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰CoA。
[0056](a)具有由丙二酸單酰CoA向丙二酸半醛或3 —羥基丙酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0057](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0058](c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸單酰CoA或戊烯二酸單酰CoA的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0059](d)具有由CO2向甲酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)，
[0060]Ce)選自蘋果酸硫激酶和蘋果酰CoA裂解酶中的至少一種。
[0061]另外，通過利用該將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，而且對該微生物進(jìn)一步賦予規(guī)定的酶活性，由此可高效地進(jìn)行如下物質(zhì)的生產(chǎn):乙酰CoA和來自乙酰CoA的有用的代謝產(chǎn)物，例如，異丙醇、乙醇、丙酮、檸檬酸、衣康酸、乙酸、丁酸、(聚一)3 —羥基丁酸、3 —羥基異丁酸、3 —氨基異丁酸、2 —羥基異丁酸、甲基丙烯酸、(聚)谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸等。
[0062]本發(fā)明提出了將CO2固定并轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的最簡單且實(shí)用的乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)(圖1)。
[0063]圖1所記載的乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)表示本發(fā)明中的乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)的優(yōu)選方案之一(以下，有時(shí)稱為“圖1的循環(huán)”。)。[0064]包括選自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、和丙酮酸羧化酶及丙酮酸激酶中的至少一種；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸硫激酶；蘋果酰CoA裂解酶；乙醛酸醛連接酶；選自羥基丙酮酸異構(gòu)酶、羥基丙酮酸還原酶及2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶中的至少一種；選自甘油酸2 —激酶、磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一種；和烯醇化酶這樣的8~10種酶，(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶負(fù)責(zé)二氧化碳固定。該(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶屬于二氧化碳固定酶中活性高的種類。例如，植物等的光合作用中利用的RubisCO的比活性已知為3U~20U/mg左右的活性(J.Biol.Chem.274 (8)5078 — 82(1999)，Anal.Biochem.153(1)97 — 101( 1986))，與此相對，(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶中，報(bào)道了在大腸桿菌中為 30U/mg、甚至高達(dá) 100 ~150U/mg(J.Biol.Chem.247,5785 一 5792(1972)；Biosc1.Biotechnol.Biochem.59,140 — 142 (1995)；Biochim Biophys Acta.1475
(3):191 - 206 (2000))。另外，對于合成蘋果酰CoA的蘋果酸硫激酶(m tk)，在此次的研究中，發(fā)現(xiàn)了與目前為止已知的酶(J.Biol.Che m.248 (21) 7295 — 303 (1973))相比，活性更高的蘋果酸硫激酶。進(jìn)而,構(gòu)成圖1的循環(huán)的酶數(shù)為8~10種，與公知的乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)相比最簡單，并且應(yīng)賦予微生物的酶數(shù)為少量即可。而且，在圖1的循環(huán)中，不含消耗乙酰CoA的酶。因此，圖1的循環(huán)可以說是用于將CO2固定并轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的理想的循環(huán)。
[0065]進(jìn)而，作為圖1的循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)，也可舉出如下優(yōu)點(diǎn):由于循環(huán)與糖酵解系統(tǒng)獨(dú)立，因此可以與各種途徑的糖酵解系統(tǒng)自由地組合。例如，戊糖磷酸途徑的NADPH的生產(chǎn)量高，所以常用于物質(zhì)生產(chǎn)(日本特表2007 - 510411號公報(bào))，但與本循環(huán)獨(dú)立，可以容易地組合
[0066]圖1的循環(huán)的蘋果酸脫氫酶(mdh)、2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶(glxR)或羥基丙酮酸還原酶(ycdW)分別消耗NADH (或NADPH)作為還原力。另外，蘋果酸硫激酶(mtk)、甘油酸3 —激酶(glxK)、甘油酸2 —激酶(garK)、丙酮酸羧化酶(pyc)消耗ATP。丙酮酸激酶(pyk)生產(chǎn)丙酮酸。
[0067]作為圖1的循環(huán)的收支，當(dāng)以磷酸烯醇式丙酮酸為起始物質(zhì)時(shí)，為“磷酸烯醇式丙酮酸+ 2CoA + CO2 + 3NAD (P) H + 3ATP — 2 乙酰 CoA + 3NAD (P) ++ 3ADP”。
[0068]另外，當(dāng)以丙酮酸為起始物質(zhì)時(shí)，變?yōu)椤氨? 2CoA + CO2 + 3NAD (P)H +4ATP — 2 乙酰 CoA + 3NAD (P)++ 4ADP”。
[0069]即，圖1的循環(huán)中，固定CO2并轉(zhuǎn)化為乙酰CoA時(shí)，需要供給磷酸烯醇式丙酮酸(或丙酮酸)、NAD (P)H、ATP。
[0070]在以乙酰Cok為中間體的發(fā)酵途徑中，發(fā)酵中消耗氧的途徑的收支式記載于表1。假定在這些發(fā)酵中產(chǎn)生如下那樣的現(xiàn)象:在發(fā)酵途徑上生成NADH等還原型輔酶，其在氧的作用下恢復(fù)為氧化型。因此，如果能利用圖1的循環(huán)代替氧而消耗生成的還原型輔酶，則可期待能將發(fā)酵中生成的還原力在乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)中有效利用，能固定CO2而轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。
[0071]需要說明的是，此處的還原型輔酶是NADH、NADPH、FADH2、FMNH2、還原型醌輔酶這樣的參與氧化還原的輔酶，而且其是指為還原狀態(tài)的輔酶，優(yōu)選是指NADH或NADPH，更優(yōu)選是指NADH。另一方面，氧化型輔酶是還原型輔酶的氧化型，例如是指NAD +、N ADP+、FAD、FMN、氧化型醌輔酶，優(yōu)選是指NAD +或NADP +，更優(yōu)選是指NAD +。
[0072][表1][0073]
【權(quán)利要求】
1.乙酰CoA生產(chǎn)微生物，具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)微生物是通過如下方式得到的:向不具有下述(a)、(b)、( c)、( d)及(e)中任一種的微生物中，不賦予(a)、(b)、(c)及(d)中任一種，或即使賦予也不發(fā)揮其功能，賦予選自蘋果酸硫激酶、蘋果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種酶活性； Ca)具有由丙二酸單酰CoA向丙二酸半醛或3 —羥基丙酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)， (b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)， (c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸單酰CoA或戊烯二酸單酰CoA的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)， (d)具有由CO2向甲酸的酶反應(yīng)的二氧化碳固定循環(huán)， Ce)選自蘋果酸硫激酶和蘋果酰CoA裂解酶中的至少一種。
2.如權(quán)利要求1所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，具有如下的乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán):磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸經(jīng)由草酰乙酸、進(jìn)而通過蘋果酸硫激酶、蘋果酰Cok裂解酶、乙醛酸醛連接酶而得到的2 —羥基一 3 —氧代丙酸進(jìn)一步經(jīng)由2 —磷酸甘油酸而再次轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，具有乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)，所述乙酰CoA生產(chǎn)循環(huán)包括如下酶: (f)選自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一種， (g)蘋果酸脫氫酶， (h)蘋果酸硫激酶， (i)蘋果酰CoA裂解酶， (j)乙醛酸醛連接酶， (k)選自2 —羥基一 3 —氧代丙酸還原酶、或羥基丙酮酸異構(gòu)酶及羥基丙酮酸還原酶中的至少一種， (I)選自甘油酸2 —激酶、或磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一種，和 Cm)烯醇化酶。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為屬于腸桿菌科的微生物或?qū)儆诎魻罴?xì)菌的微生物。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為屬于腸桿菌科的微生物，為埃希氏菌屬細(xì)菌或泛菌屬細(xì)菌；或?qū)儆诎魻罴?xì)菌的微生物，為棒狀桿菌屬細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物,其中,微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌具有的乳酸脫氫酶的活性被失活或降低。
7.如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌具有的選自異檸檬酸裂解酶及蘋果酸合酶中的至少一種酶的活性被失活或降低。
8.如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌中硫解酶活性、Co A轉(zhuǎn)移酶活性及乙酰乙酸脫羧酶活性被賦予或強(qiáng)化。
9.如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為埃希氏菌屬細(xì)菌，埃希氏菌屬細(xì)菌中硫解酶活性、Co A轉(zhuǎn)移酶活性、乙酰乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性被賦予或強(qiáng)化。
10.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為泛菌屬細(xì)菌，泛菌屬細(xì)菌具有的富馬酸水合酶A及富馬酸水合酶C的活性被失活或降低。
11.如權(quán)利要求1~5及權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其中，微生物為泛菌屬細(xì)菌，泛菌屬細(xì)菌具有的蘋果酸合酶的活性被失活或降低。
12.如權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，其特征在于，使用如下的蘋果酸硫激酶，所述蘋果酸硫激酶中，對應(yīng)于來自扭脫甲基桿菌的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸為異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸為谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸或精氨酸。
13.乙酰CoA生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)乙酰CoA。
14.丙酮生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用權(quán)利要求9或12所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)丙酮。
15.異丙醇生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用權(quán)利要求9或12所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)異丙醇。
16.谷氨酸生產(chǎn)方法，包括如下步驟:使用權(quán)利要求5、10、11或12所述的乙酰CoA生產(chǎn)微生物，由碳源材料生產(chǎn)谷氨酸。
【文檔編號】C12N15/09GK103703122SQ201280036982
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】藤井亮太, 白井智量, 安樂城正, 天野仰, 松本佳子, 館野俊博, 竹林望, 森重敬, 高橋均, 和田光史, 清水浩, 古澤力, 平澤敬, 秀崎友則, 遠(yuǎn)藤絢子, D·L·于爾根-洛曼, A·馬達(dá)范, 張舒善 申請人:三井化學(xué)株式會社