中華大蟾蜍抗菌肽bg-lw18及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其編碼基因和應(yīng)用，所述抗菌肽具有選自序列表SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有顯著的抗腫瘤作用，且具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便特點。它可以應(yīng)用于抗腫瘤的藥物的制備，用于人和動物的治療。
【專利說明】中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中華大蟾蜍為無尾兩棲類蟾蜍屬動物，廣泛分布于我國大部分地區(qū)，是傳統(tǒng)中藥蟾酥和蟾皮的主要基源動物，有具有解毒散結(jié)、消積利水、殺蟲消疳的功效。從中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制劑-華蟾素，目前廣泛應(yīng)用于多種中晚期腫瘤，如原發(fā)性肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等。
[0003]國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)兩棲動物皮及其分泌物含有豐富的抗菌肽，這類多肽通常含有10~50個氨基酸殘基，成熟的多肽來源于前體蛋白的水解，大多數(shù)抗菌肽由于富含堿性氨基酸而帶凈正電荷?？咕木哂泻芏鄡?yōu)點:消炎、抗感染、抗真菌、抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合等作用，這些功能使抗菌肽可能成為良好應(yīng)用前景的臨床候選藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供了中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18及其編碼基因和應(yīng)用，所述抗菌肽BG-LW18具有顯著的抗腫瘤作用，其具有結(jié)構(gòu)簡單、合成成本低和抗菌譜系廣等優(yōu)點。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
[0006]中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
[0007]含有所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體，其具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0008]所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體的編碼基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0009]所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體的編碼基因，使用T7啟動子序列和SP6啟動子序列篩選獲得所述編碼基因，
[0010]所述T7 啟動子序列為 5’ -TAATACGACTCTATAGGGA-3’ ；
[0011 ]所述 SP6 啟動子序列 5，-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3，。
[0012]本發(fā)明還提供了所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0013]所述抗菌肽BG-LW18在6.25ug/ml時，對肝癌腫瘤細(xì)胞的抑制效果顯著。
[0014]所述抗菌肽BG-LW18在3.125 μ g/ml時，對乳腺癌細(xì)胞的抑制效果顯著。
[0015]所述抗菌肽BG-LW18在25 μ g/ml時，對腦神經(jīng)瘤細(xì)胞的抑制效果顯著。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù) 相比，本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是:本發(fā)明在中華大蟾蜍毒液腺cDNA文庫中獲得了具有廣譜抗菌活性的抗菌肽BG-LW18，并將本發(fā)明的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18全序列氨基酸序列經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同成熟肽，所述抗菌肽BG-LW18具有創(chuàng)新性。[0017]本發(fā)明通過實驗證明兩棲動物來源的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18具有顯著的抗腫瘤的作用，尤其是對臨床耐藥腫瘤細(xì)胞有很好的抑制作用，且應(yīng)用范圍廣泛，與其它來源的抗菌多肽相比，該組抗菌肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣等有益特點?？梢詰?yīng)用于抗微生物感染和抗腫瘤的藥物的制備，用于人和動物的治療。具有良好的市場應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的cDNA及其蛋白質(zhì)序列，其中斜體加框序列為推導(dǎo)的中華大蟾蜍抗菌肽的成熟序列。
[0019]圖2表明本發(fā)明抗菌肽BG-LW18對肝癌細(xì)胞H印G2的作用。
[0020]圖3表明本發(fā)明抗菌肽BG-LW18對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用。
[0021]圖4表明本發(fā)明抗菌肽BG-LW18對腦神經(jīng)瘤細(xì)胞Neuro_2a的作用。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0023]實施例1
[0024]一、中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的基因克隆
[0025]1、總RNA的提取
[0026]將中華大蟾蜍放于玻璃燒杯中，加入幾滴乙醚，收集毒液腺分泌物(也可以直接使用收集好的毒液腺分泌物)，立即放入液氮中。稱重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末狀。加入IOml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBC0/BRL產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。然后加入等體積的酚/氯仿溶液，劇烈混勻。室溫放置10分鐘后，4°C，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清液加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘。40C，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為總RNA。
[0027]2、mRNA 的分離
[0028]采用美國Promega公司的mRNA分離純化試劑盒。取中華大蟾蜍毒腺總RNA500 μ g溶于500 μ I經(jīng)DEPC處理然后高壓滅菌的水中，放入65°C水浴10分鐘。加入3 μ I的Oligo(dT)探針和13 μ 120 X SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌:將磁珠(隨mRNA分離純化試劑盒)輕輕混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5 X SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5 X SSC懸浮，稱為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1 X SSC洗滌4次。然后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮,至磁力架吸附30秒，將上清移至新的試管中，加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，將上清移至上述試管，則上清中為純化的mRNA。加入1/10體積的3M乙酸鈉，PH5.2，等體積異戊醇，于-70°C放置30分鐘，然后于4°C，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶于10 μ I DEPC水中。
[0029]3、cDNA 文庫構(gòu)建。
[0030]采用美國GIBC0/BRL公司SuperScriptTM質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。
[0031]3.1、cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):于1.5ml試管中加入2.0μ I NotI引物和7μ I mRNA, 3 μ I DEPC水，70°C保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4 μ 15 X第一鏈合成緩沖液，2 μ 10.1M DTT, I μ IlOmM dNTP混合物，再加入I μ I SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶，于42°C保溫I小時后放入冰浴。
[0032]3.2、cDNA第二鏈合成:在第一鏈合成試管中加入:95μ I DEPC水，30 μ 15 X第二鏈合成緩沖液，3 μ IlOmM dNTP混合物，I μ I大腸桿菌DNA連接酶，4 μ I大腸桿菌DNA多聚酶I，I μ I大腸桿菌RNA酶，反應(yīng)總體積150μ 1，混勻后于16°C保溫2小時；加入2μ I T4DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。
[0033]3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀:加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取180 μ I上層溶液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，加入70 μ 17.5Μ乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干。
[0034]3.4,Sal I adapter 的連接:上述沉淀溶于 25 μ I DEPC水中，加入 10 μ 15 X T4DNA連接酶緩沖液，10 μ I Sail adapter, 5 μ I T4DNA連接酶，反應(yīng)總體積50 μ 1，于16°C保溫16小時。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41 μ I DEPC水中。
[0035]3.5、Not I酶水解:于cDNA溶液中加入5 μ I React3緩沖液，4 μ I NotI酶，反應(yīng)體積50 μ 1，于37°C保溫2小時。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100 μ ITEN緩沖液中。
[0036]3.6、DNA分級分離:將cDNA樣品過柱(試劑盒中含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA，cDNA大于300bp的組分合并，體積為200 μ 1，加入5 μ I酵母tRNA，100 μ 17.5Μ乙醇胺，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20 μ I TEN緩沖液中。
[0037]3.7、合成的cDNA連接到pSPORTl質(zhì)粒:取10 μ I溶解于TEN緩沖液中的cDNA，加入4μ 15XT4DNA連接酶緩沖液，1μ I pSPORTl質(zhì)粒(Not 1-Sal I酶水解，50ng)，4μ I DEPC水，I μ I T4DNA連接酶，反應(yīng)體積20 μ 1，室溫3小時。
[0038]3.8、大腸桿菌HBlOl感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取單個HBlOl菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩2小時，待菌液在540nm的OD值為0.4時，4°C，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2重懸，再以2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用。
[0039]3.9、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:取上述連接產(chǎn)物5 μ I加入100 μ I感受態(tài)細(xì)胞，冰浴60分鐘，42°C熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.9ml，37°C振蕩培養(yǎng)I小時，取200 μ I涂布于含氨芐青霉素的LB平皿上(15cm直徑)。37°C培養(yǎng)16小時，每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10%的甘油于液氮保存的所構(gòu)建中華大蟾蜍毒腺cDNA文庫大約含1.8 X IO5個克隆。
[0040]4、中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的基因克隆。
[0041]采用cDNA文庫構(gòu)建質(zhì)粒pSPORTl的通用引物T7啟動子序列(5，-TAATACGACTCTATAGGGA-3’)(SEQ ID No:4)以及 SP6 啟動子序列(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3，)(SEQ ID No:5)鑒定每個克隆的插入片段大小。通過對2000多個插入片段MOObp的克隆的測序，結(jié)合核酸及蛋白質(zhì)的序列比較，得到了中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18編碼基因，如圖1所示，其cDNA由434個核苷酸組成，自5’端至3 ‘端序列為(SEQ ID NO:1):
【權(quán)利要求】
1.中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18，其具有SEQID NO: 3所示的氨基酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體，其具有SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體的編碼基因，其具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18的蛋白前體的編碼基因，其特征在于:使用T7啟動子序列和SP6啟動子序列篩選獲得所述編碼基因， 所述 17 啟動子序列為 5’ -TAATACGACTCTATAGGGA-3’ ； 所述 SP6 啟動子序列 5’ -CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。
5.權(quán)利要求1所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述抗菌肽BG-LW18在6.25 ug/ml時，對肝癌腫瘤細(xì)胞的抑制效果顯著。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述抗菌肽BG- LW18在3.125 μ g/ml時，對乳腺癌細(xì)胞的抑制效果顯著。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中華大蟾蜍抗菌肽BG-LW18在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述抗菌肽BG- LW18在25 μ g/ml時，對腦神經(jīng)瘤細(xì)胞的抑制效果顯著。
【文檔編號】C12N15/12GK103788180SQ201410035535
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】孫同毅 申請人:濰坊醫(yī)學(xué)院