一株異養(yǎng)硝化細菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株異養(yǎng)硝化細菌菌株，該菌株命名為克雷伯氏菌屬細菌(Klebsiella?sp.)HLNR02，其于2013年10月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為：CGMCC?No.8397；其有益效果是，該異養(yǎng)硝化菌株對富營養(yǎng)化水體中氨氮和總氮有較強的降解效果；為進一步利用該菌株對治理被氨氮類廢水污染的水體進行生物法治理提供了良好的微生物材料。
【專利說明】一株異養(yǎng)硝化細菌菌株

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域的一種細菌菌株，具體涉及一株異養(yǎng)硝化細菌菌株。

【背景技術】：
[0002] 氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化與污水污泥脫氮效率、脫氮工藝的改良、水體富營養(yǎng)化的解決等密 切相關。目前解決水體的氮素富營養(yǎng)化的方法有物理、化學和生物方法。隨著氮素污染的 不斷加劇和人們對環(huán)境問題的日益重視，除氮技術，特別是生物脫氮技術已經(jīng)成為控制水 體污染的重要方向和手段。
[0003] 氨氮是造成水體富營養(yǎng)化的污染物之一。目前普遍認為，在生物脫氮過程中，廢水 中的氨氮首先被自養(yǎng)硝化菌在好氧條件下氧化為NCV。然后NCV在缺氧條件下被反硝化細 菌還原為氣態(tài)氮如N 2等從水中逸出。傳統(tǒng)的生物脫氮技術如生物濾池、氧化溝、生物膜處 理系統(tǒng)和流化床等大多采用的硝化菌群，硝化菌多為自養(yǎng)菌。自養(yǎng)菌增殖速度慢且難以維 持較高生物濃度，需先經(jīng)曝氣處理以降低有機物濃度，菌株才能生長并表現(xiàn)生物學活性，抗 沖擊能力弱；高濃度氨氮和亞硝酸鹽又會抑制硝化菌的生長，使硝化作用不完全，導致總氮 去除率很低。
[0004] 異養(yǎng)硝化細菌能夠在利用有機碳源生長的同時將含氮化合物硝化生成羥胺、亞硝 酸鹽、硝酸鹽等產(chǎn)物，多數(shù)還能同時進行好氧反硝化作用，直接將硝化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為含氮氣 體。因此，這類細菌已成為廢水處理中生物脫氮新工藝的重要研究對象。與自養(yǎng)型硝化菌 比較，異養(yǎng)硝化菌的生長速率快，細胞產(chǎn)量高，需要的溶解氧濃度低，能耐受酸性環(huán)境且活 性高，并且能夠代謝各種形態(tài)的氮化合物。由于異養(yǎng)硝化菌的出現(xiàn)，工藝上可以實現(xiàn)在一個 反應器里完成硝化反硝化，不僅可以降低運行成本，減少工藝上繁瑣的操作，還可以擴大自 養(yǎng)硝化菌所不能處理的水質(zhì)范圍。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是，分離篩選出一株異養(yǎng)硝化細菌菌株。
[0006] 本發(fā)明的技術解決方案是，從富營養(yǎng)化水體中分離和篩選出異養(yǎng)硝化菌株，該菌 株命名為克雷伯氏菌屬細菌（Klebsiella sp.)HLNR02,其于2013年10月28日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為：CGMCC No. 8397。
[0007] 該菌株的生物學特性為：革蘭氏陰性，異養(yǎng)生長，最佳碳源葡糖糖，最適宜pH值為 7. 2,最適溫度28 °C。
[0008] 本發(fā)明所涉及的異養(yǎng)硝化細菌菌株是通過以下方法分離篩選得到的：
[0009] (1)于江西省吉安縣將軍湖中采集水樣，取水樣中的水體1L用0. 22 μ m的濾膜過 濾，用10mL無菌水沖洗濾膜，待藻沉淀后取上層清液lmL于99mL滅菌的含氨氮的富集培養(yǎng) 基中，將該培養(yǎng)基置入28°C溫度，振動頻率為200rpm/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。4d后取 lmL菌液于99mL滅菌的含氨氮的富集培養(yǎng)基中，在上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)4d。按同樣的操作重 復3次，進行4個周期的富集培養(yǎng)。
[0010] (2)取步驟（1)中富集至第4周期獲得的菌液lmL，加到氨氮濃度提高50%的馴化 培養(yǎng)基中，進行4個周期的馴化培養(yǎng)，接種量和培養(yǎng)條件同富集培養(yǎng)。獲得馴化培養(yǎng)液。 [0011] ⑶從步驟（2)中獲得的馴化培養(yǎng)液中取菌液5份，每份為lmL，分別進行梯度稀 釋，選用梯度為10_3、10_4、10_5、10_6、10_ 7;從每份中分別取〇. lmL所得的稀釋菌液分別涂布 于含有含氨氮的固體平板培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d。
[0012] (4)用已滅菌的移液槍頭從步驟（3)的平板培養(yǎng)基上挑取較大而且獨立的菌落， 采用劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。通過3次劃線獲得單菌落。單菌落在新 鮮LB培養(yǎng)基中再進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后的菌種，部分置于-80°C冰箱內(nèi)保種，部分置于 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0013] 本發(fā)明的有益效果在于：經(jīng)多次反復試驗，該異養(yǎng)硝化菌株對富營養(yǎng)化水體中氨 氮和總氮有較強的降解效果。為進一步利用該菌株對治理被氨氮類廢水污染的水體進行生 物法治理提供了良好的微生物材料。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0014] 圖1為菌種16S rDNA PCR-RFLP酶切電泳圖；
[0015] 圖2為菌株HLNR02同相近序列采用N-J法構建的系統(tǒng)進化樹；
[0016] 圖3為菌株HLNR02在模擬富營養(yǎng)化廢水中的解氮效果。

【具體實施方式】：
[0017] 1.菌株HLNR02的分離
[0018] (1)于江西省吉安市吉安縣將軍湖中采集水樣，取水樣中的水體1L用0. 22μπι的 濾膜過濾，用10mL無菌水沖洗濾膜，待藻沉淀后取上層清液lmL于99mL滅菌的含氨氮的富 集培養(yǎng)基中，將該培養(yǎng)基置入28°C溫度，振動頻率為200rpm/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。 4d后取lmL菌液于99mL滅菌的含氨氮的富集培養(yǎng)基中，在上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)4d。按同樣 的操作重復3次，進行4個周期的富集培養(yǎng)。
[0019] (2)取步驟（1)中富集至第4周期獲得的菌液lmL，加到氨氮濃度提高50%的馴化 培養(yǎng)基中，進行4個周期的馴化培養(yǎng)，接種量和培養(yǎng)條件同富集培養(yǎng)。獲得馴化培養(yǎng)液。
[0020] (3)從步驟⑵中獲得的馴化培養(yǎng)液中取菌液5份，每份為lmL，分別進行梯度稀 釋，選用梯度為1〇_ 3、1〇_4、1〇_5、1〇_6、1〇_7;從每份中分別取〇. lmL所得的稀釋菌液分別涂布 于含有含氨氮的固體平板培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d。
[0021] (4)用已滅菌的移液槍頭從步驟（3)的平板培養(yǎng)基上挑取40株較大而且獨立的菌 落，采用劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。通過3次劃線獲得單菌落。取該單 菌落在新鮮LB培養(yǎng)基中再進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)后菌種，部分置于-80°C冰箱內(nèi)保種，部 分于4°C保存，為后續(xù)試驗備用。
[0022] 上述富集培養(yǎng)基，是指以氨氮（NH4+-N)為氮源的富集培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含以下 物質(zhì)組份和條件：葡萄糖58，（順 4)2304]^，1(2即040.58，1((]16311^、]\%30 42311^、無水03(]122311^、 NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL，蒸餾水 lOOOmL，ρΗ7· 2。
[0023] 上述LB培養(yǎng)基：包含有蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaC15. 0g，ρΗ7· 2。
[0024] 上述固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基加1. 5 %瓊脂粉。
[0025] 上述微量元素溶液，其配方（g· Γ1)為：ZnS042. 2, CaCl25. 5, MnCl2 · 4H205. 06， FeS04 · 7Η205· 0, CuS04 · 5Η201· 57, C0C12 · 6Η201· 61。
[0026] 2.菌株的 PCR-RFLP 分析
[0027] (1)運用巢式PCR(nested-PCR)對上述40株菌的16S rDNA進行擴增。方法如下：
[0028] 第一輪反應（體積25 μ L)含1 μ L (大約lng) DNA為模板,0. 5 μ L引物 (10μΜ)，2μ? 的 dNTP 混合物（2.5禮)，1.541^，]\%(：12(251111)，2.541^0\?〇?反應 緩沖液和〇. 2yL Taq DNA聚合酶（5U/yL，Takara公司）。第一輪反應的引物為： 27f(5， -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-S')和 1492r(5， -TACCTTGTTACGACTT-3， hPCR 反 應程序為：94°C預變性5min，94°C 30s，55°C 40s，72°C lmin，共10個循環(huán)，最后72°C延伸 10min〇
[0029] 第二輪反應以第一輪反應的PCR產(chǎn)物為模板，引物為：63f (5 ' -CAGGCCTAAC ACATGCAAGTC-3')和 1389r(5' -ACGGGCGGTGTGTACAAG-3')。在這一輪反應中，設置 30 個循環(huán)，反應條件同第一輪反應。PCR結束后，產(chǎn)物用含1%溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳、檢 測（大約1300bp長度的片段為目標片段）。
[0030] (2)將PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切核酸酶Rsal和Hhal消化（37°C，lh)。酶切DNA 片段用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色和凝膠成像系統(tǒng)成像（見附圖1菌種 16S rDNA PCR-RFLP酶切電泳圖）后，所得DNA帶型圖譜在GIS凝膠分析軟件輔助下進行 人工比較分析。以基因片段多態(tài)圖譜為基礎進行聚類，聚合到一起的具有相同圖譜的克隆 視為相同的基因型。每一個基因型作為一個分類操作單位（OTU，Operational Taxonomic Unit)或稱為唯一基因型，獲得11種不同菌株，編號分別為1、2、4、12、16、22、23、27、29、37、 39 〇
[0031] 3.菌株的硝化活性檢測
[0032] (1)從上述菌株的PCR-RFLP分析的步驟（2)中獲得的11株菌菌液，各取lmL，用無 菌水清洗3次后分別接種于100mL新鮮的以氨氮（NH4+-N)為氮源的硝化培養(yǎng)基中，置于 28°C，振動頻率為200rpm/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ld，且每隔4小時檢測培養(yǎng)基中氨氮濃 度（NH/-N)、亞硝酸鹽氮（Ν0 2_-Ν)、硝酸鹽氮（Ν03_-Ν)、總N濃度以及細菌生長的0D值；以此 同時設置空白對照組。其中，NH/-N采用鈉氏試劑分光光度法；NCV-N采用N-(l-萘胺）-乙 二胺光度法；NCV-N采用鹽酸-萘乙二胺分光光度法；ΤΝ采用過硫酸鉀-紫外分光光度法； 細菌0D值采用利用分光光度計測定菌懸液在600nm的吸光值。
[0033] 上述氨氮（NH4+-N)為氮源的硝化培養(yǎng)基：葡萄糖169mg，（NH 4) 2S0437. 7lmg, KC163mg、MgS0423mg、無水 CaCl223mg、NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL(配方同 上），蒸餾水 1000mL，pH7.2。
[0034] (2)檢測結果：11株菌在以葡萄糖為碳源，硫酸銨為唯一氮源的異養(yǎng)培養(yǎng)液中培 養(yǎng)生長時，氨氮初始濃度約為10. lmg/L，經(jīng)檢測比較份折，37號菌為脫氮效果最好的菌株 (見下表1，菌珠硝化活性，mg/L)。
[0035] 表1.菌株硝化活性
[0036]

【權利要求】
1. 一株異養(yǎng)硝化細菌菌株，該菌株命名為克雷伯氏菌屬細菌（Klebsiella sp.) HLNR02,其于2013年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號 為：CGMCC No. 8397。
【文檔編號】C12R1/22GK104152367SQ201310750912
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】賀根和, 張宇燕, 梁亮亮, 李一弘 申請人:井岡山大學