一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組dna與總rna同時提取的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，步驟S1：環(huán)境樣品的預(yù)處理，通過離心的方法收集液體樣品中的微生物或通過過濾的方法剔除固體樣品中的雜質(zhì)；步驟S2：細(xì)胞的破碎，將步驟S1中預(yù)處理好的樣品與石英砂混合后加入液氮研磨三次，再加入pH值為7.0的PIPES抽提緩沖液和十二烷基磺酸鈉溶液在65℃下裂解細(xì)胞1小時；步驟S3：核酸純化與沉淀，裂解細(xì)胞完畢后通過離心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取劑離心萃取蛋白與脂類，待萃取后，上清液用異丙醇沉淀并離心獲取總核酸，總核酸經(jīng)過分離即可得到宏基因組DNA與總RNA。本發(fā)明具有低成本、能夠同時從礦區(qū)環(huán)境樣品中提取高純度、完整性好的宏基因組DNA與總RNA的優(yōu)點。
【專利說明】—種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA和RNA分離【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體的說，特別涉及一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 對環(huán)境中微生物資源的認(rèn)識、開發(fā)和利用的一個很大障礙就是難以獲得純培養(yǎng)。據(jù)報道，目前約99%的環(huán)境微生物因生長所需的理化條件不明確尚未被純培養(yǎng)(Pace, N.R.A molecular view of microbial diversity and the biosphere.Science.276 (5313)，1997:734-740)，所以環(huán)境中存在大量未知的微生物資源亟待研究與開發(fā)利用。而生物冶金的關(guān)鍵技術(shù)之一，就是從礦區(qū)獲得耐受極端環(huán)境的高效浸礦菌種，因此，為了研究、開發(fā)和利用礦區(qū)各類微生物資源，有大量基于分子生物學(xué)的研究，如:限制性片段長度多態(tài)性分析(Yin, H.et al.Molecular diversity of 16S rRNA and gyrB genesin copper mines.Arch Microbiol.189 (2), 2008:101-110)、實時定量 PCR 技術(shù)(Han,J.S.&Kim,C.G.Microbiological monitoring of acid mine drainage treatment systemsand aquatic surroundings using real-time PCR.Water Sci Techno1.59(11),2009:2083-2091)、基因芯片(Guo，X.et al.RubisCO gene clusters found in a metagenomemicroarray from acid mine drainage.Appl Environ Microbiol.79(6)，2013:2019-2026和 Xie，J.et al.GeoChip-based analysis of the functional gene diversity andmetabolic potential of microbial communities in acid mine drainage.Appl EnvironMicrobiol.77 (3)，2011:991-999)和宏基因組測序技術(shù)(Auld，R.R.，Myre，M., Mykytczuk,N.C.，Leduc，L.G.&Merritt，T.J.Characterization ofthe microbial acid minedrainage microbial community using culturing and direct sequencing techniques.J Microbiol Methods.93(2) ,2013:108-115)等，近年相繼展開，這些研究主要集中在研究有關(guān)微生物的代謝方式、基因或酶的功能、微生物群落組成及動態(tài)變化及其對環(huán)境因子的響應(yīng)等方面，這些研究對認(rèn)識生物冶金過程和加速其工業(yè)化起到了非常大的作用。由于這些研究手段均基于基因組DNA或mRNA的分析，且核酸質(zhì)量和數(shù)量會影響數(shù)據(jù)分析的可靠性(Demeke, T.&Jenkins, G.R.1nfluence of DNA extraction methods，PCR inhibitors andquantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits.Anal Bioanal Chem.396 (6)，2010:1977-1990)，傳統(tǒng) DNA 與 mRNA 分步提取的方法會造成“時間差”，從而導(dǎo)致分析結(jié)果難以“同步”，而且，由于不同的研究釆用了不同的核酸提取方法，而不同的提取方法又會對研究結(jié)果有影響而產(chǎn)生差異(Inceoglu，0.，Hoogwout, E.F.，Hi11,P.&van Elsas,J.D.Effect of DNA Extraction Method on the Apparent MicrobialDiversity of Soil.Appl Environ Microb.76 (10)，2010:3378-3382)，導(dǎo)致在不同的研究之間也難以比較，因此，制定適用于礦區(qū)樣品基因組DNA與總RNA同時提取的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)十分有必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種低成本、能夠同時從礦區(qū)環(huán)境樣品中提取高純度、完整性好的微生物基因組DNA與總RNA的方法。
[0004]為了解決以上提出的問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，包括以下步驟，
[0006]步驟S1:環(huán)境樣品的預(yù)處理，通過離心的方法收集液體樣品中的微生物或通過過濾的方法剔除固體樣品中的雜質(zhì)；
[0007]步驟S2:細(xì)胞的破碎，將步驟SI中預(yù)處理好的樣品與滅菌的石英砂混合后加入液氮研磨三次，再加入PH值為7.0的PIPES抽提緩沖液和十二烷基磺酸鈉溶液在65°C下裂解細(xì)胞I小時；
[0008]步驟S3:核酸純化與沉淀，裂解細(xì)胞完畢后通過離心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取劑離心萃取蛋白與脂類，待萃取后，上清液用冰凍的異丙醇或乙醇沉淀并離心獲取總核酸，總核酸經(jīng)過分離即可得到宏基因組DNA與總RNA。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:在所述步驟S3中還包括向經(jīng)過異丙醇沉淀并離心獲取的總核酸中加入2mL濃度為70%的乙醇充分洗滌，并在離心力為12000Xg的條件下室溫離心15min，再收集沉淀的總核酸，棄去上清液，在室溫下干燥20-30min，待乙醇揮發(fā)完后，加入50-200 μ L的TE緩沖液溶解，即獲得總核酸溶液。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:若步驟S3中所得總核酸的A26tl, 230比值低于1.8，則可向總核酸中加入I / 10體積的3Μ NaOAc和2.5體積無水乙醇后混勻，靜置于_20°C冰箱中30min后，再在尚心力為12000Xg的條件下室溫尚心30min后收集總核酸。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S2中的PIPES抽提緩沖液的配方為，0.1MPIPES鈉鹽，0.1M EDTA, 1.5M NaCl和I % CTAB，并且PIPES抽提緩沖液的加入量為16.5mL。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S2中的石英砂的加入量為2_5g，并且在加入后須與樣品混勻混合。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S2中的十二烷基磺酸鈉溶液的濃度為(質(zhì)量體積比)20%，其加入量為:1.83mL。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S3中的萃取劑為氯仿和異戊醇的混合液，該氯仿和異戊醇的體積比為24: I ;并且萃取劑的加入量為與所萃取上清液的體積相等。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S3中用于沉淀上清液的異丙醇或乙醇為100%純度，并且異丙醇或乙醇的加入量與所沉淀上清液的體積比為0.6: I。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S3中離心萃取蛋白與脂類的條件為在離心力為6000 Xg的條件下室溫離心lOmin。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例:所述步驟S3中離心獲取總核酸的條件為在離心力為12000 Xg的條件下室溫離心30min。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明較現(xiàn)有單獨提取DNA與RNA的方法以及從其他樣品中同時提取DNA與RNA的方法相比有以下的優(yōu)點:
[0019]1、本發(fā)明能夠從低pH、高重金屬濃度的極端環(huán)境樣品中同時提取得到高純度、大片段的基因組DNA與總RNA ；[0020]2、本發(fā)明的樣品需求量較少，當(dāng)總細(xì)胞數(shù)目達(dá)到IO9可有效提取微克級的核酸，對于珍貴或難以取樣的環(huán)境樣品的核酸提取，該方法具有較大優(yōu)勢；
[0021]3、本發(fā)明具有廣泛適用性，適用于生物反應(yīng)器、不同礦區(qū)以及土壤樣品中微生物基因組DNA與總RNA的同時提??；該方法能夠更加廣泛應(yīng)用于其他環(huán)境樣品的核酸同步提取，為研究、開發(fā)和利用微生物資源，提供了強有力的工具，將為微生物濕法冶金、微生物修復(fù)環(huán)境污染、微生物能源等熱門研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法的流程圖。
[0023]圖2為本發(fā)明中不同浸礦純菌的核酸同時提取結(jié)果示意圖。
[0024]圖3為本發(fā)明中不同礦區(qū)樣品中核酸同時提取結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0026]實施例一:
[0027]本實施所提供的方法成功的用于了浸礦純菌、大冶銅礦礦坑水樣、阿希金礦水樣和反應(yīng)器水樣的基因組DNA與總RNA的同時提取。其中，所采用的純菌樣品均來自中南大學(xué)資源生物學(xué)院生物冶金教育部重點實驗室菌種庫中保藏的純菌，這些細(xì)菌均分離自酸性礦坑水(PH1-3左右)，能夠在較低的pH下生長，具有氧化亞鐵和硫的能力，一般用于微生物濕法冶金生產(chǎn)中，其中，Acidithiobacillus.ferrooxidans (A.f)為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，最適生長溫度25-30°C，最適pHl.5-2，以氧化亞鐵離子獲取能源；Acidithilbacilluscaldus (A.c)為嗜酸喜溫硫桿菌,最適生長溫度40_45°C,最適pH2_2.5,以還原型硫化物，單質(zhì)硫為能源物質(zhì)；At.albertlensis (A.t)為嗜酸中溫硫桿菌，最適生長溫度30°C,最適pHl.8,利用單質(zhì)硫和還原型硫化物生長；Leptospirillum.ferriphilium(L.f)為嗜鐵鉤端螺旋菌，最適生長溫度40 °C,最適pHl.6,僅利用亞鐵為能源物質(zhì)；Ferroplasma.thermophilum(F.t)嗜熱鐵質(zhì)古菌,最適生長溫度為45°C,最適pH為1.0,該菌為化能有機營養(yǎng)型或化能混營養(yǎng)型，可以利用酵母浸出物。進行核酸提取時，所用純菌菌液體積為200mL，菌濃約107個/ mL，取自湖北大冶銅錄山銅礦酸性礦坑水樣5L，微生物濃度約為1.67~4.75X106個/ mL ;取自新疆阿希金礦的水樣量約為IOOmL,其中，微生物濃度約I X 108個/ mL，取自金紅石脫硅生物反應(yīng)器水樣量約1001^，微生物濃度約5.84父107，上述三個環(huán)境樣品經(jīng)離心收集微生物后用于核酸提取。核酸同時提取實驗具體操作步驟如下(結(jié)合圖1):
[0028]第一步、浸礦純菌、酸性礦坑水樣、浸礦反應(yīng)器液體采集后4°C離心收菌，并于-20°C以下保存；
[0029]第二步、樣品與2g石英砂混勻，加入液氮冷凍樣品，等液氮快揮發(fā)完時研磨樣品直至樣品開始融解，并重復(fù)三次；
[0030]第三步、在以上混合物中加入16.5mL抽提緩沖液(0.1M PIPES鈉鹽，0.1M EDTA,1.5M NaCl和I % CTAB, ρΗ7.0)，20%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液1.83mL,輕混均勻，并于65°C水浴中溫浴I小時，每隔15min混勻一次，并離心，再將上清液轉(zhuǎn)移入新的管中；
[0031]第四步、重新加入6mL PIPES抽提緩沖液到石英砂與菌的混合物中，混勻后，加入
0.67mL20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，混勻后65°C水浴15min，在離心力為3600Xg的條件下室溫離心lOmin，上清液與第三步中上清液的合并，從而提高總核酸的提取率；
[0032]第五步、向第四步中獲得的上清液中加入I倍體積的氯仿和異戊醇混合液(其體積比為24: I),充分混勻IOmin,在離心力為3600 Xg的條件下室溫離心IOmin,吸取上清液轉(zhuǎn)移入新管；并重復(fù)該步驟直至上清液中無雜蛋白存在；
[0033]第六步、向上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，輕混勻后，-20°C靜置30min，在離心力為12000 Xg的條件下室溫離心30min,丟棄上清液；
[0034]第七步、在沉淀物中加入2mL濃度為70%的乙醇，輕輕沖洗沉淀物，在離心力為12000 Xg的條件下室溫離心15min,晾干乙醇,用一定體積的RNase-free水或TE緩沖液溶解混合核酸，獲取總核酸，總核 酸經(jīng)過分離即可得到宏基因組DNA與總RNA。
[0035]在本實施例的步驟中，所有的容器經(jīng)RNase噴霧清除劑處理后，在121°C，0.1MPa高溫高壓蒸汽滅菌30min后，用105°C烘4-8h。
[0036]以下表1分別列出了不同浸礦純菌核酸提取質(zhì)量與紫外吸收比值，表中結(jié)果顯示，所提取到的核酸A26tl / 280的比值在1.8-2.0之間，A260 / 230的比值在1.8-2.2之間，說明核酸質(zhì)量較高，適用于后續(xù)的分子生物學(xué)操作。
[0037]表1不同浸礦純菌核 酸提取質(zhì)量與紫外吸收比值
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟， 步驟S1.環(huán)境樣品的預(yù)處理，通過離心的方法收集液體樣品中的微生物或通過過濾的方法剔除固體樣品中的雜質(zhì)； 步驟S2.細(xì)胞的破碎，將步驟SI中預(yù)處理好的樣品與滅菌的石英砂混合后加入液氮研磨三次，再加入pH值為7.0的PIPES抽提緩沖液和十二烷基磺酸鈉溶液在65°C下裂解細(xì)胞I小時； 步驟S3.核酸純化與沉淀，裂解細(xì)胞完畢后通過離心的方法收集上清液，并向上清液中加入萃取劑離心萃取蛋白與脂類，待萃取后，上清液用冰凍的異丙醇或乙醇沉淀并離心獲取總核酸，總核酸經(jīng)過分離即可得到宏基因組DNA與總RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:在所述步驟S3中還包括向經(jīng)過異丙醇沉淀并離心獲取的總核酸中加入2mL濃度為70%的乙醇充分洗滌，并在離心力為12000 Xg的條件下室溫離心15min，再收集沉淀的總核酸，棄去上清液，在室溫下干燥20-30min，待乙醇揮發(fā)完后，加入50-200 μ L的TE緩沖液溶解，即獲得總核酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:若步驟S3中所得總核酸的A26tl丨230比值低于1.8，則可向總核酸中加入I / 10體積的3Μ NaOAc和2.5體積無水乙醇后混勻，靜置于_20°C冰箱中30min后，再在離心力為12000 Xg的條件下室溫離心30min后收集總核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S2中的PIPES抽提緩沖液的配方為，0.1M PIPES鈉鹽，0.1M EDTA,1.5M NaCl和1% CTAB,并且PIPES抽提緩沖液的加入量為16.5mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S2中的石英砂的加入量為2-5g，并且在加入后須與樣品混勻混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S2中的十二烷基磺酸鈉溶液的濃度為(質(zhì)量體積比)20%，其加入量為:1.83mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S3中的萃取劑為氯仿和異戊醇的混合液，該氯仿和異戊醇的體積比為24:1 ;并且萃取劑的加入量為與所萃取上清液的體積相等。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S3中用于沉淀上清液的異丙醇或乙醇為100%純度，并且異丙醇或乙醇的加入量與所沉淀上清液的體積比為0.6: I。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S3中離心萃取蛋白與脂類的條件為在離心力為6000 X g的條件下室溫離心lOmin。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦區(qū)環(huán)境樣品微生物基因組DNA與總RNA同時提取的方法，其特征在于:所述步驟S3中離心獲取總核酸的條件為在離心力為12000Xg的條件下室溫離心30min。
【文檔編號】C12N15/10GK103642798SQ201310732553
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】謝建平, 劉新星, 云慧, 邱冠周 申請人:中南大學(xué)