水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其首先通過(guò)成熟胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織并繼代2～3次，挑選呈淡黃色且松散的顆粒狀愈傷組織進(jìn)行饑餓處理一定時(shí)間；然后，用含有一定濃度鈣離子的侵染液侵染一定時(shí)間，并在侵染后吸干侵染液；接著轉(zhuǎn)置共培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)置恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)，最后再轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，緊接著挑選呈淡黃色且松散的愈傷組織轉(zhuǎn)置分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)一定天數(shù)后可長(zhǎng)出不定芽，即為轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，操作方便，相比傳統(tǒng)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化周期更短，轉(zhuǎn)化效率更高，使得遺傳轉(zhuǎn)化更加方便、容易，可廣泛應(yīng)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，適于推廣與應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)研究領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種也受到了各國(guó)科學(xué)家的重視。改進(jìn)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)其操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)，在水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中將會(huì)受到廣泛的應(yīng)用。目前，傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過(guò)成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，直接進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，誘導(dǎo)胚狀體獲得轉(zhuǎn)基因植株，該方法耗時(shí)長(zhǎng)，最重要的是轉(zhuǎn)化效率極低。利用幼胚作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，該法受時(shí)間限制，往往轉(zhuǎn)化周期會(huì)更長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率低，往往給科研工作帶來(lái)很多不變。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)且轉(zhuǎn)化效率低，給科研工作帶來(lái)諸多不便的問(wèn)題而提出一種操作簡(jiǎn)單、方便且轉(zhuǎn)化周期短、效率高，能方便實(shí)際應(yīng)用的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0004]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]上述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括以下步驟:
[0006](1.0)愈傷組織誘導(dǎo)，即選取飽滿的水稻種子剝?nèi)シf殼，用乙醇浸泡，隨后用升汞溶液浸泡，再用無(wú)菌水漂洗，之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；愈傷組織經(jīng)過(guò)2~3次繼代后，挑選生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織繼代備用；
[0007](2.0)饑餓處理，即挑選上述步驟(1.0)繼代后生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織置于瓶中，在合適溫度下饑餓處理，備用；
[0008](3.0)侵染
[0009](3.1)在無(wú)菌條件下，從固體細(xì)菌培養(yǎng)基上挑取一株農(nóng)桿菌單菌落接于含有抗生素的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；(3.2)將上述步驟(3.1)中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至離心管中離心，收集菌體；(3.3)將上述步驟(3.2)離心后的菌液棄去離心管中的上清液，再向收集的菌體中加入適量新鮮的液體細(xì)菌培養(yǎng)基，接著從離心管中取出適量的菌液加入到液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，直至農(nóng)桿菌的濃度適當(dāng)即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染農(nóng)桿菌；(3.4)將上述步驟(2.0)中饑餓處理后的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染一定時(shí)間后，再置于濾紙上吸干備用；
[0010](4.0)培養(yǎng)
[0011](4.1)共培養(yǎng)，即將上述步驟(3.4)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在合適溫度條件暗培養(yǎng)；(4.2)恢復(fù)培養(yǎng)，即將上述步驟(4.1)中獲得的愈傷組織用無(wú)菌水清洗，然后用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)置恢復(fù)培養(yǎng)基中，在合適溫度條件下光照培養(yǎng)；(4.3)篩選培養(yǎng)，即將上述步驟(4.2)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中，在合適溫度條件光照培養(yǎng)，并根據(jù)情況適時(shí)更換培養(yǎng)基；(4.4)分化培養(yǎng)，即將上述步驟(4.3)獲得新鮮、疏散且呈淡黃色的愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在合適溫度條件光照培養(yǎng)，并根據(jù)情況適時(shí)更換培養(yǎng)基；待分化出的不定芽長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度時(shí)，將其小心移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
[0012]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(1.0)中將剝?nèi)シf殼的種子用70%~75%乙醇浸泡4~5min，隨后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用無(wú)菌水漂洗3~5次，之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脫落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。
[0013]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(2.0)中是將挑選好的愈傷組織置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的溫度條件下饑餓處理2~5天，備用。
[0014]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(3.1)中是將挑取的農(nóng)桿菌單菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，在25~28°C，150~200r/min的恒溫?fù)u床上振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；所述步驟(3.2)是將所述步驟(3.1)中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至離心管中，在4~6°C下,4000~6000rpm/min,離心8~15min,收集菌體；所述步驟(3.3)中是將從離心管中取出適量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，直至農(nóng)桿菌的濃度適當(dāng)即可，再加入80~100μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮,用于侵染農(nóng)桿菌；所述步驟(3.4)中是將所述步驟(1.0)中繼代好的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染30~60min。
[0015]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(4.1)中是將第三步獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件暗培養(yǎng)2~4天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的瓊脂粉組成。
[0016]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(4.2)中是將所述步驟(4.1)中獲得的愈傷組織用無(wú)菌水清洗2~4次，用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)置恢復(fù)培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)7~10天；所述恢復(fù)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的瓊脂粉組成。
[0017]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(4.3)中是將所述步驟(4.2)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)30~40天，每隔10~15天換一次培養(yǎng)基；所述篩選培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的瓊脂粉以及一定濃度的篩選抗生素組成。
[0018]所述水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其中:所述步驟(4.4)中是將所述步驟(4.3)獲得的愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25~28°C，10~15h光照培養(yǎng)，15~20天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4~6周；待分化出的不定芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，將其小心移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；所述分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤組成；所述生根培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤組成。
[0019]有益效果:[0020]本發(fā)明水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法步驟簡(jiǎn)單，操作方便，相比傳統(tǒng)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化周期更短，轉(zhuǎn)化效率更高，使得遺傳轉(zhuǎn)化更加方便、容易。其中，本發(fā)明通過(guò)對(duì)愈傷組織進(jìn)行饑餓處理，增加細(xì)胞吸收外界養(yǎng)分的能力，同時(shí)增加細(xì)胞的穿透性；同時(shí)，在侵染液中加入一定量的外源鈣，可以增加細(xì)胞膜的穿透性，利于外源基因片段進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可廣泛應(yīng)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，適于推廣與應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括以下步驟:
[0022]SO10、愈傷組織誘導(dǎo)
[0023]即選取飽滿的水稻種子，用70%~75%乙醇浸泡4~5min，隨后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用無(wú)菌水漂洗3~5次，之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；愈傷組織經(jīng)過(guò)2~3次繼代后，挑選生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織繼代備用；其中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脫落酸、
0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成；
[0024]S020、饑餓處理
[0025]即挑選步驟SOlO繼代后生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的溫度條件下饑餓處理2~5天，備用；
[0026]S030、侵染
[0027]S031、在無(wú)菌條件下，從固體細(xì)菌培養(yǎng)基上挑取一株農(nóng)桿菌單菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，在25~28°C，150~200r/min的恒溫?fù)u床上振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；
[0028]S032、將步驟S031中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至離心管中，在4~6°C下，4000~6000rpm/min,離心8~15min，收集菌體；
[0029]S033、棄去離心管中的上清液，再向收集菌體的中加入適量新鮮的液體細(xì)菌培養(yǎng)基，從離心管中取出適量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，直至農(nóng)桿菌的濃度適當(dāng)即可，再加入80~100 μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮(AS)，用于侵染農(nóng)桿菌；
[0030]S034、將上述步驟SOlO中繼代好的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染30~60min之后，置于濾紙上吸干備用；
[0031]S040、培養(yǎng)
[0032]S041、共培養(yǎng)，即將上述步驟S034獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在22~280C的溫度條件暗培養(yǎng)2~4天；其中，該共培養(yǎng)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的瓊脂粉組成；
[0033]S042、恢復(fù)培養(yǎng)，即將上述步驟S041中獲得的愈傷組織用無(wú)菌水清洗2~4次，用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)置中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)7~10天；其中，該恢復(fù)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的瓊脂粉組成；
[0034]S043、篩選培養(yǎng)，即將上述步驟S042獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)30~40天，每隔10~15天換一次培養(yǎng)基；其中，該篩選培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的瓊脂粉以及一定濃度的篩選抗生素組成；
[0035]S044、分化培養(yǎng)，即將上述步驟S043獲得新鮮、疏散，呈淡黃色的愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25~28°C，10~15h光照培養(yǎng)，15~20天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4~6周；待分化出 的不定芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，將其小心移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；其中，該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤組成；該生根培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤組成。
[0036]本發(fā)明操作步驟簡(jiǎn)單、方便，相比傳統(tǒng)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法耗時(shí)更短，轉(zhuǎn)化效率更高，使得遺傳轉(zhuǎn)化變得相對(duì)簡(jiǎn)單、容易，可廣泛應(yīng)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中。
[0037]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作任何其他形式的限制，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)所作的任何修改或等同變化，仍屬于發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1.0)愈傷組織誘導(dǎo) 即選取飽滿的水稻種子剝?nèi)シf殼，用乙醇浸泡，隨后用升汞溶液浸泡，再用無(wú)菌水漂洗，之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；愈傷組織經(jīng)過(guò)2~3次繼代后，挑選生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織繼代備用； (2.0)饑餓處理 即挑選上述步驟(1.0)繼代后生長(zhǎng)狀況較好、組織松散、淡黃色顆粒狀的愈傷組織置于瓶中，在合適溫度下饑餓處理，備用； (3.0)侵染 (3.1)在無(wú)菌條件下，從固體細(xì)菌培養(yǎng)基上挑取一株農(nóng)桿菌單菌落接于含有抗生素的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上振蕩過(guò)夜培養(yǎng)； (3.2)將上述步驟(3.1)中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至離心管中離心，收集菌體； (3.3)將上述步驟(3.2)離心后的菌液棄去離心管中的上清液，再向收集的菌體中加入適量新鮮的液體細(xì)菌培養(yǎng)基，接著從離心管中取出適量的菌液加入到液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，直至農(nóng)桿菌的濃度適當(dāng)即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染農(nóng)桿菌； (3.4)將上述步驟(2.0)中饑餓處理后的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染一定時(shí)間后，再置于濾紙上吸干備用； (4.0)培養(yǎng) (4.1)共培養(yǎng)，即將上述步驟(3.4)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在合適溫度條件暗培養(yǎng)； (4.2)恢復(fù)培養(yǎng)，即將上述步驟(4.1)中獲得的愈傷組織用無(wú)菌水清洗，然后用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)置恢復(fù)培養(yǎng)基中，在合適溫度條件下光照培養(yǎng)； (4.3)篩選培養(yǎng)，即將上述步驟(4.2)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中，在合適溫度條件光照培養(yǎng)，并根據(jù)情況適時(shí)更換培養(yǎng)基； (4.4)分化培養(yǎng)，即將上述步驟(4.3)獲得新鮮、疏散且呈淡黃色的愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在合適溫度條件光照培養(yǎng)，并根據(jù)情況適時(shí)更換培養(yǎng)基；待分化出的不定芽長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度時(shí)，將其小心移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
2.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(1.0)中將剝?nèi)シf殼的種子用70%~75%乙醇浸泡4~5min，隨后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用無(wú)菌水漂洗3~5次，之后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脫落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。
3.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(2.0)中是將挑選好的愈傷組織置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的溫度條件下饑餓處理2~5天，備用。
4.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(3.1)中是將挑取的農(nóng)桿菌單菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，在25~28°C，150~200r/min的恒溫?fù)u床上振蕩過(guò)夜培養(yǎng)； 所述步驟(3.2)是將所述步驟(3.1)中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至離心管中，在4~6°C下，4000~6000rpm/min,離心8~15min,收集菌體； 所述步驟(3.3)中是將從離心管中取出適量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，直至農(nóng)桿菌的濃度適當(dāng)即可，再加入80~100 μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮，用于侵染農(nóng)桿菌； 所述步驟(3.4)中是將所述步驟(1.0)中繼代好的胚性愈傷組織置于一定濃度的鈣離子侵染液中侵染30~60min。
5.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(4.1)中是將第三步獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件暗培養(yǎng)2~4天； 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。
6.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(4.2)中是將所述步驟(4.1)中獲得的愈傷組織用無(wú)菌水清洗2~4次，用無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)置恢復(fù)培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)7~10天； 所述恢復(fù)培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、 0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的瓊脂粉組成。
7.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(4.3)中是將所述步驟(4.2)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置篩選培養(yǎng)基中，在22~28°C的溫度條件光照培養(yǎng)30~40天，每隔10~15天換一次培養(yǎng)基； 所述篩選培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的瓊脂粉以及一定濃度的篩選抗生素組成。
8.如權(quán)利要求1所述的水稻轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(4.4)中是將所述步驟(4.3)獲得的愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25~28°C，10~15h光照培養(yǎng)，15~20天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4~6周；待分化出的不定芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，將其小心移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根； 所述分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-節(jié)氨基嘌呤組成； 所述生根培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤組成。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103740752SQ201310731487
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】朱永興, 許興, 李樹(shù)華, 白海波, 呂學(xué)蓮, 董建力, 關(guān)雅靜, 張巖, 麻冬梅 申請(qǐng)人:寧夏農(nóng)林科學(xué)院