專利名稱：一個水稻卷葉基因及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水稻遺傳育種研究領(lǐng)域，具體涉及一個高育種價值水稻卷葉基因rAy 的克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉片的適度卷曲是水稻株型育種中的重要組成部分，在高產(chǎn)水稻品種的培育中具 有重要的價值，當(dāng)前推廣的絕大多數(shù)超級稻品種的葉片均具有一定程度的卷曲。迄今已定 位的卷葉基因有近 20 個，如..rll、rl2、rl3、rl4、rl5、rl6(t)、rl(t)、rl7、rl8、rl9(t)、R110M、 rllO(t)、rlllM、urllM、sd-sl、nal3、SLLl、NRLl 和7。但是，克隆的卷葉基因只有 3 個，即SLLl、NRL1和0sAG07。SLLl和是功能喪失性突變，為隱性遺傳?；蚴?功能增強(qiáng)性突變，由一段外源可轉(zhuǎn)移的DNA片段(簡稱T-DNA)插入到基因的5’非 翻譯區(qū)(5’ UTR)，從而造成基因的過量表達(dá)，并導(dǎo)致葉片卷曲?？傮w而言，這些卷葉 基因造成的葉片卷曲度多超過50% (葉片過分卷會減少受光面積，不利于高產(chǎn))，甚至近筒狀 卷曲，有的還帶來葉片變窄、植株矮小等負(fù)面效應(yīng)；另外，以上多數(shù)卷葉基因為隱性遺傳、少 數(shù)為顯性遺傳，它們在純合狀態(tài)下造成葉片過卷、雜合狀態(tài)下造成葉片過卷或不卷。因此， 上述絕大多數(shù)卷葉基因的育種利用價值較低。研究表明具有較高的育種利用價值，該基因來自水稻品種日本流崗卷葉粳。 通過連續(xù)多代的回交，本實驗室將r/y導(dǎo)入我國著名的雜交水稻保持系“珍汕97B”中，獲 得“珍汕97B”的近等基因系“卷葉珍汕97B”(簡稱JZB，葉片卷曲度約70%)”(圖1_A3、B2)。 利用JZB與平展葉秈稻品種奇妙香(簡稱QMX)雜交，F(xiàn)l雜合體的葉片表現(xiàn)為微卷(卷曲度 約25%)(圖1-A2)，證明為不完全隱性遺傳，雖然在純合狀態(tài)下可致葉片卷曲度高達(dá) 70%，但是在雜合狀態(tài)下表現(xiàn)微卷，且未發(fā)現(xiàn)任何負(fù)面效應(yīng)(陳宗祥等，2002，2004，2005)。利 用“珍汕97B”及其近等基因系“卷葉珍汕97B”分別與“明恢63”、“鹽恢559”配制雜交組 合(雜交稻)，獲得2個葉片微卷的雜交稻(卷葉汕優(yōu)63和卷葉汕優(yōu)559)和2個平展葉雜交 稻(汕優(yōu)63和汕優(yōu)559)，對這4個雜交稻設(shè)置兩種施肥水平，研究rAy卷葉基因?qū)﹄s交稻 產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響(陳宗祥等，2002，2004，2005)。結(jié)果表明，正常肥力水平下，卷 葉組合秧苗期的葉齡、莖蘗數(shù)、假莖粗、苗高等指標(biāo)均低于對應(yīng)組合，本田前期莖蘗數(shù)上升 較緩，高峰苗較少，而最終有效穗數(shù)顯著或極顯著多于對應(yīng)組合，平均穗粒數(shù)和千粒重稍低 于對應(yīng)組合，最終結(jié)實率和單株產(chǎn)量顯著或極顯著高于對應(yīng)組合，增產(chǎn)效應(yīng)約5%。增施穗肥 處理中，各組合倒數(shù)3張葉片均顯著或極顯著拉長，平展葉組合的葉基角和披垂度有較明 顯的增加；各組合穗粒數(shù)顯著或極顯著增加，千粒重降低或顯著降低，平展葉組合結(jié)實率顯 著或極顯著降低而卷葉組合結(jié)實率變化不明顯，卷葉組合極顯著增產(chǎn)而平展葉組合增產(chǎn)不 顯著。說明基因在高肥水平下更有利于其豐產(chǎn)潛力的發(fā)揮，增產(chǎn)效應(yīng)高達(dá)11%。邵元健等(2005)采用WinQTLCart2. 5軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法以及圖位定位法 將rAy定位在水稻第2染色體上的一個134kb區(qū)域。但是，至今未見該基因被更精細(xì)定位 和克隆的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離并克隆一個高育種利用價值水稻卷葉基因rAy，用于改良水 稻株型，提高水稻產(chǎn)量。利用奇妙香為輪回親本，與卷葉珍汕97B雜交并回交的BC4F2和BC4F3兩群體為研 究材料對卷葉性狀進(jìn)行了遺傳分析。精細(xì)定位群體來自BC4F2代中度卷曲植株自交后代，共 3650個單株，進(jìn)一步定位群體來自BC4F3代中度卷曲植株自交后代，共5040個單株。利用 圖位克隆法對行了精細(xì)定位，精細(xì)區(qū)間內(nèi)只包含一個候選基因(圖2)，通過RNA干涉 實驗和功能互補(bǔ)驗證實驗驗證了候選基因正確性(圖4、6、7)。該基因編碼一個HD-GL2類轉(zhuǎn) 錄因子，屬于homeobox基因家族，控制水稻葉片的極性發(fā)育，其表達(dá)量強(qiáng)弱決定葉片的卷 曲度大小(圖5、8)。rl(t)基因正常表達(dá)時，表現(xiàn)為平展葉(親本奇妙香卷曲度約3. 4%);表達(dá) 量增強(qiáng)時，葉片表現(xiàn)不同程度的卷曲，如F1植株(表達(dá)量微量增加)的葉片卷曲度約25%，親 本卷葉珍汕97B (表達(dá)量增加較多)的葉片卷曲度約70% (圖7);而干涉該基因讓其極弱或 不表達(dá)時，葉片表現(xiàn)為反向卷曲(圖4)。所說水稻卷葉基因它在序列的3’ UTR中存在一個點突變，與公開的水稻基 因序列不同，如SEQ ID N0:1所示。該點突變(公開序列中為G，但基因在此位置處為T)可增強(qiáng)基因的 表達(dá)水平，導(dǎo)致葉片卷曲?；谠撏蛔凕c，我們開發(fā)了 基因的特異分子標(biāo)記，標(biāo)記 名為 RltdCAPs-2 (前引物 5，-TTTACAGTGGATTTATGTCCG-3，，后引物 5，-GCCAGAGTCAATA CCgGtAC-3’)。該分子標(biāo)記特異性擴(kuò)增基因3’ UTR中的一個165bp序列(如圖10和SEQ ID NO :2)，包含上述的突變堿基位點，在平展葉品種中，其擴(kuò)增產(chǎn)物可被限制性內(nèi)切酶 切割為147和18bp的兩個片段，但在攜帶基因的卷葉品種中則不能被切割。在瓊脂 糖凝膠電泳中，由于18bp過小而顯示不出，最終顯示的卷葉和平展葉親本的擴(kuò)增產(chǎn)物大小 分別為165和147bp，大小存在明顯差異。本發(fā)明還公開了該基因在水稻育種中的應(yīng)用。該基因在水稻高產(chǎn)育種中增產(chǎn)效應(yīng) 約5%-11%，其利用途徑有二。第一，應(yīng)用于卷葉雜交水稻的培育即利用帶有基因的卷葉珍汕97B (秈稻) 或卷葉日本晴(粳稻)與水稻不育系或恢復(fù)系雜交并回交；在各回交世代，采用基于r/y基 因中的特征位點開發(fā)的分子標(biāo)記(RltdCAPs-2) Mrlω基因進(jìn)行輔助選擇，在苗期淘汰未 帶Wrt,基因的植株；通過連續(xù)多代的回交、自交和標(biāo)記輔助選擇，并可獲得遺傳穩(wěn)定、綜合 性狀優(yōu)良的新型卷葉不育系或新型卷葉恢復(fù)系；利用新型卷葉不育系與平展葉恢復(fù)系，或 新型卷葉恢復(fù)系與平展葉不育系配制雜交組合(雜交水稻)，即可獲得rAy基因為雜合狀態(tài) 的葉片微卷的雜交水稻。第二，通過轉(zhuǎn)基因策略，采用RNA干擾或超表達(dá)技術(shù)，降低或增加推廣的平展葉水 稻品種中與基因等位的基因的表達(dá)水平，可獲得葉片適度反卷或正卷的水稻新材料； 考察新的卷葉材料的株葉形態(tài)和產(chǎn)量結(jié)構(gòu)，淘汰因轉(zhuǎn)基因過程中可能存在的因組培變異而 綜合性狀不佳的材料，可獲得綜合性狀與原推廣品種相同且遺傳穩(wěn)定的卷葉水稻新品系。


圖1 rl(t)基因定位研究中的平展葉親本、卷葉親本及雜合體的葉片表型注A1 平展葉親本的葉片表型；A2 -.rlω基因雜合狀態(tài)下的植株葉片表型(微卷，卷曲 度25%);A3 -.rlM基因純合狀態(tài)下的植株葉片表型(卷曲，卷曲度70%);B1 平展葉親本整株 表型；B2 卷葉親本整株表型。圖2卷葉基因的精細(xì)定位區(qū)間及區(qū)間內(nèi)的基因釋義。圖3卷葉基因在3’ UTR處的1個單核苷酸差異。圖4 RNAi轉(zhuǎn)基因植株及對照日本晴的植株形態(tài)；
注A =RNAi植株與日本晴對照的整株形態(tài)；B =RNAi植株葉片形態(tài)(反向近筒狀卷曲)。圖5 RNA干擾試驗中各轉(zhuǎn)基因植株的W&基因的表達(dá)量分析；
注A、B分別為卷葉日本晴和平展葉日本晴，1—12為不同的RNAi轉(zhuǎn)基因植株。圖6 BAC質(zhì)粒AP005885的雙酶切(方框內(nèi)為目標(biāo)序列)。圖7互補(bǔ)載體的構(gòu)建過程。圖8 平展葉日本晴對照及互補(bǔ)片段導(dǎo)入平展葉日本晴的轉(zhuǎn)基因植株的株葉形 態(tài)；
注圖A中左邊植株為平展葉日本晴對照，右邊為互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株；圖B為互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因 植株，其葉片呈現(xiàn)微卷。圖9互補(bǔ)試驗中各轉(zhuǎn)基因植株的基因的表達(dá)量分析；
注A、B分別為平展葉日本晴和卷葉日本晴，1 一 12為不同的互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株。圖10是分子標(biāo)記RltdCAPs-2的擴(kuò)增產(chǎn)物序列。其中括號內(nèi)的堿基為平展葉品種 和r/y基因卷葉品種之間存在的單堿基差異，平展葉中為G ；下劃線的6個堿基序列為限制 性內(nèi)切酶式的識別基序)。圖11 利用攜帶r/y基因的卷葉A配制的卷葉雜交水稻。圖12 分子標(biāo)記RltdCAPs-2在群體中的擴(kuò)增效果
注M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；P1、P2分別為卷葉和平展葉親本；1-10分別為F3群體中的不同植 株；第3、8泳道為雙帶，表示這兩個個體中的r/y基因為雜合型。
具體實施例方式實施例1
因的精細(xì)定位
精細(xì)定位群體為平展葉秈稻品種“奇妙香”(輪回親本)與“卷葉珍汕97B”的雜交和 回交的BC4F2群體，其中卷葉珍汕97B攜帶卷葉基因，其劍葉的平均卷曲度為70% (圖 1-A3、B2)；兩個品種間的雜合體Fl的劍葉表現(xiàn)微卷，平均卷曲度為20% (圖1-A2)。BC4F2群體共包含3650個單株，進(jìn)一步定位群體來自BC4F3代中度卷曲植株自交后 代，共5040個單株(中選中度卷曲單株也經(jīng)標(biāo)記輔助選擇，卷葉基因定位區(qū)段兩側(cè)標(biāo)記為 雜合帶型)。選擇初級定位區(qū)間兩側(cè)的分子標(biāo)記INDEL112. 6和INDEL121組成雙引物分析BC4F2 群體中的3650個單株的標(biāo)記基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)181個交換株，再逐步用新發(fā)展的分子標(biāo)記 對這些交換株進(jìn)行檢測，分析這些交換株的標(biāo)記基因型和表型，最終將卷葉基因位于 標(biāo)記P113. 2和D120935之間，物理間距為60kb (圖2-A)。更精細(xì)定位群體來自BC4F2代中微卷植株的自交后代群體(BC4F3),共5040個單株。利用雙側(cè)標(biāo)記Pl 13. 2和D120935分析這5040個單株的標(biāo)記基因型，同時考察各單株 葉片卷曲表型，共發(fā)現(xiàn)120個交換株。利用這些交換株并發(fā)展新的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)卷葉基因 與分子標(biāo)記P98255和P102241共分離，與分子標(biāo)記P95053和P113. 6之間各存在1個交換 個體，表明Hw位于分子標(biāo)記P95053和P113. 6之間，物理間距為Ilkb (圖2-A)。2、候選基因分析及序列測定
以水稻品種日本晴全基因組測序序列為參考序列，在水稻基因組釋義數(shù)據(jù)庫(Rice GAAS :http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/rgadb/)和水稻釋義計劃數(shù)據(jù)庫(RAP-DB)中， 發(fā)現(xiàn)上述11 kb的定位區(qū)間內(nèi)只存在1個預(yù)測基因(圖2-C)，位于BAC克隆P0657H12的反 向互補(bǔ)鏈上的第98647bp至104674bp之間，基因全長為6028bp，有9個外顯子，編碼區(qū)全長 2415bp?；蚬δ転轭A(yù)測編碼 GL2 類 homeodomain 蛋白，包含 START (The steroidogenic acute regulatory protein (StAR)-related lipid transfer domain)、homeobox禾口HALZ (Homeobox associated leucine zipper)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域 homeobox 禾口 START 分另lj位于該 基因的第99-156氨基酸之間和第308-547氨基酸之間?；蚓幋a產(chǎn)物主要在分生組織的 Ll層、葉原基、葉片、花等側(cè)生器官的表層表達(dá)。利用該基因預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息，設(shè)計了 19對測序引物(表1)，各引物對之間的擴(kuò)增 DNA片段相互重疊并覆蓋了整個預(yù)測基因的啟動子區(qū)域、編碼區(qū)和5’非翻譯區(qū)(UTR)。利 用這19對測序引物擴(kuò)增獲得平展葉親本QMX和卷葉親本JZB中的相應(yīng)DNA片段，整合后獲 得2個親本中的目標(biāo)基因全序列。對這2個親本中的目標(biāo)基因全序列以及測序品種日本晴 和9311中該基因的全序列進(jìn)行比較分析，認(rèn)為平展葉品種中該基因的3’ UTR處的堿基“T” 突變?yōu)閴A基“G”是造成卷葉的關(guān)鍵原因(圖3)，表明堿基突變后的基因序列就是卷葉基因 rl(t)的序列(SEQ ID N0:1)。表1 19對測序引物序列
權(quán)利要求
一個水稻卷葉基因rl(t)，它的堿基序列如 SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的水稻卷葉基因rAy在水稻育種中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，具體是利用帶有因的卷葉珍汕97B或 卷葉日本晴與秈型或粳型不育系或者與秈型或粳型恢復(fù)系雜交并回交；在各回交世代，采 用分子標(biāo)記對r/y基因進(jìn)行輔助選擇，在苗期淘汰未帶r/y基因的植株；通過連續(xù)多代 的回交、自交和標(biāo)記輔助選擇，并可獲得遺傳穩(wěn)定、綜合性狀優(yōu)良的新型卷葉不育系或新型 卷葉恢復(fù)系；利用新型卷葉不育系與平展葉恢復(fù)系，或新型卷葉恢復(fù)系與平展葉不育系配 制雜交組合，即可獲得rAy基因為雜合狀態(tài)的葉片微卷的雜交水稻。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所說的采用分子標(biāo)記對基因進(jìn)行輔 助選擇，具體是利用前引物 5，-TTTACAGTGGATTTATGTCCG-3，，后引物 5，-GCCAGAGTCAATA CCgGtAC-3’，特異性擴(kuò)增基因3’ UTR中的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶幻ml酶切 后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為165bp的是攜帶r/y基因的品種；顯示 147bp的是不攜帶r/w基因的品種。
5.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，具體是通過轉(zhuǎn)基因策略，采用RNA干擾或超 表達(dá)技術(shù)，降低或增加平展葉水稻品種中與r/y基因等位的基因的表達(dá)水平，可獲得葉片 適度反卷或正卷的水稻新材料；考察新的卷葉材料的株葉形態(tài)和產(chǎn)量結(jié)構(gòu)，淘汰因轉(zhuǎn)基因 過程中可能存在的因組培變異而綜合性狀不佳的材料，可獲得綜合性狀與原品種相同且遺 傳穩(wěn)定的卷葉水稻新品系。
全文摘要
本發(fā)明屬于水稻遺傳育種研究領(lǐng)域，具體涉及一個高育種價值水稻卷葉基因rl(t)及其應(yīng)用。所說水稻卷葉基因rl(t)的堿基序列如SEQIDNO1所示。該水稻卷葉基因rl(t)在水稻育種中應(yīng)用可獲得遺傳穩(wěn)定的卷葉水稻新品系；用于改良水稻株型，提高水稻產(chǎn)量。
文檔編號A01H5/00GK101979580SQ201010542708
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者左示敏, 張亞芳, 李磊, 潘存紅, 潘學(xué)彪, 陳宗祥, 馬玉銀 申請人:揚(yáng)州大學(xué)