一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的試劑及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的試劑及方法，屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。通過(guò)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測(cè)定受試者的C2基因SNP位點(diǎn)的基因型，預(yù)測(cè)受試者對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎的易感性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：首次闡述了C2基因多態(tài)性位點(diǎn)與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的方法，該方法可用于強(qiáng)直性脊柱炎的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的試劑及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的試劑及方法，更具體的說(shuō)是通過(guò)測(cè)定與AS相關(guān)基因C2的多態(tài)性預(yù)測(cè)受試者對(duì)于強(qiáng)直性脊柱炎的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開(kāi)發(fā)，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一種自身免疫性疾病，多發(fā)于16-40歲的青壯年，男女患病比例約為4~10:1。病變常首先發(fā)生于骶髂關(guān)節(jié)，少數(shù)重癥患者表現(xiàn)為整個(gè)脊柱強(qiáng)直。此外，部分患者伴有不同程度的髖關(guān)節(jié)、眼、肺、心血管、腎等脊柱外病變。AS在白種人群中的發(fā)病率約為1%~3%，我國(guó)AS患病率約為0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髖關(guān)節(jié)受累，致使20%以上AS患者殘疾，炎癥主要累及關(guān)節(jié)囊、肌腱和韌帶的骨附著點(diǎn)，導(dǎo)致局部關(guān)節(jié)粘連強(qiáng)直，活動(dòng)受限。臨床上至今尚缺乏可明顯緩解和控制疾病發(fā)展的藥物。AS屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認(rèn)為遺傳與免疫因素在AS發(fā)病中起主導(dǎo)作用，但確切的病因與發(fā)病機(jī)制仍不清楚。
[0003]目前進(jìn)行AS遺傳病因研究，多采用SNP作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法，是有效的，已得到證明。SNP是指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有70.1%為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換:如G/A或T/C，29.1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶)是人類(lèi)基因組中最易發(fā)生變化的位點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(mén) (胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多態(tài)性的80-90%，是最常見(jiàn)的遺傳變異。 [0004]由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個(gè)基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬(wàn)個(gè)。SNP以其密度高(平均每Ikb就有I個(gè))、代表性強(qiáng)(位于基因內(nèi)部的SNP可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平)、遺傳穩(wěn)定性好(同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言)、易于自動(dòng)化分析(因SNP在人群中多為雙等位基因標(biāo)記，可簡(jiǎn)單以“+ / 一或1/0”直接分型)等特點(diǎn)成為很好的遺傳標(biāo)志。
[0005]1973年，Brewerton等首先發(fā)現(xiàn)了與AS強(qiáng)相關(guān)的人類(lèi)白細(xì)胞抗原_B27(HLA_B27 )。隨著研究的進(jìn)展，與AS相關(guān)的其他易感基因如腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、白介素-1(IL-1)陸續(xù)被識(shí)別。
[0006]C2 (Complex2，補(bǔ)體2)基因位于6q21.3，全長(zhǎng)18198bp，含有14個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)，該基因定位于人類(lèi)白細(xì)胞抗原III區(qū)域，與免疫反應(yīng)及自身性免疫疾病發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。
[0007]目前尚無(wú)任何關(guān)于C2基因與AS相關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的主要目的是提供一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的方法。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的試劑盒，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0011]檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的核酸序列，為序列表SEQ ID N0.1所示堿基序列。其+268位即是SNP變異位點(diǎn)，以字母”K”標(biāo)示出。該核酸序列為C2基因第一內(nèi)含子序列的一部分。圖1為C2基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性變異位點(diǎn)的示意圖，附圖中包含有3個(gè)外顯子，Chr6:g31890198T>G位點(diǎn)標(biāo)在C2基因圖中第I內(nèi)含子區(qū)的相應(yīng)位置。
[0012]一種檢測(cè)強(qiáng)制性脊柱炎易感性的方法，檢測(cè)受試者C2基因第I內(nèi)含子區(qū)Chr6: g31890198T>G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，基因型為T(mén)T時(shí)，受試者的易感性最低；攜帶G等位基因時(shí)，受試者的易感性升高。
[0013]一組檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的引物，能擴(kuò)增得到所述的檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的核苷酸序列SEQ ID N0.1，引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQID N0.3 所示。
[0014]本發(fā)明提供了一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴(kuò)增C2基因+268位點(diǎn)的引物對(duì)和用于PCR擴(kuò)增檢測(cè)的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量如下:
[0015]一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感基因的試劑盒，由以下試劑組成:
[0016](I) 10 μ LlOXPCR 緩沖液；
[0017](2 ) 2 μ LlOmMdNTP 混合液；
[0018](3) 2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019](4) IyL Fl弓丨物，為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/μ L ;
[0020](5) IyL Rl引物，為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/μ L ；
[0021](6) 8 μ LlOXLC-Green Plus 飽和熒光染料；
[0022](7)2μ L寡核苷酸內(nèi)參，由4種內(nèi)參引物各0.5μ L組成，濃度為lOpmol/μ L，其中低溫寡核苷酸內(nèi)參上游引物F為SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內(nèi)參下游引物R為SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內(nèi)參上游引物F為SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內(nèi)參下游引物R為SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
[0023](8) 64 μ L 純水。
[0024]使用方法如下:
[0025](I) PCR擴(kuò)增:通過(guò)PCR擴(kuò)增ΒΑΤ5基因的第6內(nèi)含子區(qū)部分片段，制備混合液:10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pM/L 上游引物0.1“1^，10?厘/1下游引物0.1 μ L，I X LC-Green Plus飽和熒光染料0.8 μ L，寡核苷酸內(nèi)參0.2yL (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0.05 μ L)(序列見(jiàn)表1)，基因組DNAl μ L，加純水至10 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸5s,總共45個(gè)循環(huán)，72°C總延伸2min。在進(jìn)行高分辨熔解曲線(xiàn)分析之前，進(jìn)行變性和復(fù)性處理:95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s, 24°C 4min。PCR 前于每一體系中加入 20 μ L 的石蠟油，以防止液體揮發(fā)。
[0026](2)基因型判定:將PCR產(chǎn)物移入HRM專(zhuān)用96孔板內(nèi)，在Light Scanner TMHR-196上進(jìn)行HRM分析,用Light Scanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線(xiàn)進(jìn)行分析,根據(jù)熔解曲線(xiàn)的差異判定基因型。
[0027]C2基因第I內(nèi)含子區(qū)Chr6:g31890198T>G多態(tài)性位點(diǎn)在制備診斷或治療強(qiáng)直性脊柱炎的試劑或藥物中的用途。
[0028]本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定了來(lái)源于人的基因組DNA，樣品來(lái)源無(wú)限制，如:體液(血液、腹水及尿液等)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過(guò)提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。調(diào)整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴(kuò)增出含C2基因突變位點(diǎn)的核酸片段，以獲取測(cè)定的大量樣本。這種通過(guò)擴(kuò)增含C2基因變異點(diǎn)的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測(cè)定材料。
[0029]在進(jìn)行基因輔助診斷時(shí)，本發(fā)明優(yōu)先適用于測(cè)定根據(jù)C2基因的突變類(lèi)型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對(duì)應(yīng)于用于測(cè)定C2基因突變類(lèi)型的方法。按采用的測(cè)定方法來(lái)選擇適當(dāng)?shù)奶囟ㄔ噭?，如DNA片段和/或用于PCR擴(kuò)增步驟的引物。
[0030]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明首次闡明了 C2基因多態(tài)性位點(diǎn)與AS的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測(cè)AS易感性的方法，該方法可用于AS的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
[0031]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以便公眾對(duì)
【發(fā)明內(nèi)容】
有更深入的了解，并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為C2基因結(jié)構(gòu)及Chr6:g31890198T>G位點(diǎn)示意圖
[0033]圖2為C2基因變異位點(diǎn)經(jīng)HRM方法的基因分型圖
[0034]圖3為C2基因變異位點(diǎn)的測(cè)`序圖
【具體實(shí)施方式】
[0035]用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫(xiě)如下:
[0036]10XPCR 緩沖液:10mM Tris-HCI (pH=8.3), 500mM 氯化鉀(KCl)，IOmM 氯化鎂(MgCl2)70.01%(W/V)白明膠
[0037]dNTP:脫氧核苷三磷酸
[0038]EDTA:乙二胺四乙酸二鈉
[0039]TE: IOmM Tris-HCl (pH=7.5)，ImM EDTA (pH=8.0)
[0040]實(shí)施例1:血液樣本收集和基因組DNA的提取:
[0041]一.病例入選:
[0042]按紐約1984年的修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)入選病例,共選取來(lái)自吉林地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的AS患者136例(年齡:14-44歲，平均24歲)，同地區(qū)的健康對(duì)照志愿者148例(年齡:39-72歲，平均46歲)。所有受檢者均為漢族且簽署書(shū)面知情同意書(shū)，這項(xiàng)研究得到衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所倫理審核委員會(huì)的認(rèn)可，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》:人體醫(yī)學(xué)研究的倫理原則。
[0043]二.根據(jù)下列方法，制備人基因組DNA。
[0044]1.在已標(biāo)號(hào)的1.5mLEP管中加1000 μ L紅細(xì)胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3-5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；
[0045]2.13000rpm離心30秒后，除去上清液；
[0046]3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時(shí)上下混勻，確保無(wú)凝塊);
[0047]4.拿出后降至室溫，加300μ L蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；
[0048]5.將上清液移至新EP管中，加入670 μ L預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見(jiàn)線(xiàn)狀DNA逐漸形成小團(tuán)塊，13000rpm離心2分鐘；
[0049]6.棄上清液并確保沉淀留在EP管中，加入670 μ L70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；
[0050]7.棄上清，使管內(nèi)乙醇揮發(fā)干凈；
[0051]8.加入TE溶液(400 μ L)，充分溶解，對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/ μ L，置于4°C備用，剩余基因組DNA置_20°C冰箱保存。
[0052]實(shí)施例2SNP的識(shí)別鑒定
[0053]本發(fā)明采用PCR -高分辨率熔解曲線(xiàn)(HRM)分析法和PCR測(cè)序技術(shù)同時(shí)對(duì)C2基因的第3外顯子區(qū)的+268位點(diǎn)(其等位位點(diǎn)為C/T)的基因型進(jìn)行檢測(cè)。
[0054]一.PCR-HRM弓丨物的確定
[0055]從Genebank 中查取 Chr6: g31890198T>G 附近的 DNA 堿基序列(SEQ ID N0.1)，引物設(shè)計(jì)在01igo7.0軟件下完成。目的片段定位在C2基因第I內(nèi)含子區(qū)，全長(zhǎng)53bp，
[0056]確定了正義鏈Fl與反義鏈Rl特異性引物序列如下:
[0057]Fl:5，-GACTGGATAAGGAGTAGACTGACCAC-3，(Seq ID N0.2)
[0058]Rl:5，-CATATAGCAGAGGCCGACCCCAC-3，(Seq ID N0.3)
[0059]二.PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
[0060]通過(guò)PCR擴(kuò)增C2基因第2內(nèi)含子區(qū)部分片段，PCR反應(yīng)體系為=IOXPCR反應(yīng)緩沖液 I μ L，10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L, 10pM/L 上游引物 0.1 μ L, 10pM/L 下游引物0.1 μ L，IOXLC-Green Plus飽和熒光染料0.8 μ L，寡核苷酸內(nèi)參0.2 μ L (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0.05 μ L)(序列見(jiàn)表1)，基因組DNAl μ L，加去離子水至10 μ L。PCR時(shí)于每一體系中加入20 μ L石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，65。。退火30s，72。。延伸5s，總共45個(gè)循環(huán)，72°C總延伸2min。在進(jìn)行高分辨熔解曲線(xiàn)分析之前，進(jìn)行變性和復(fù)性處理:95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s,24°C 4min。
[0061]表1:高、低溫寡核苷酸內(nèi)參引物序列、退火溫度及產(chǎn)物片段長(zhǎng)度
[0062]
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的核酸序列，其特征在于:為序列表SEQID N0.1所示堿基序列。
2.一種檢測(cè)強(qiáng)制性脊柱炎易感性的方法，其特征在于:檢測(cè)受試者C2基因第I內(nèi)含子區(qū)Chr6: g31890198T>G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，基因型為T(mén)T時(shí)，受試者的易感性最低；攜帶G等位基因時(shí)，受試者的易感性升高。
3.—組檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于:能擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的核苷酸序列，引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
4.一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感基因的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成: (1)10 μ LlOXPCR 緩沖液；
(2)2 μ LlOmMdNTP 混合液；
(3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ; (4)IyL Fl引物，為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/yL; (5)IyL Rl引物，為SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/yL; (6)8 μ LlOXLC-Green Plus 飽和熒光染料； (7)2 μ L寡核苷酸內(nèi)參，由4種內(nèi)參引物各0.5 μ L組成，濃度為IOpmol/μ L，其中低溫寡核苷酸內(nèi)參上游 引物F為SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內(nèi)參下游引物R為SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內(nèi)參上游引物F為SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內(nèi)參下游引物R為SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
(8)64 μ L 純水。
5.C2基因第I內(nèi)含子區(qū)Chr6:g31890198T>G多態(tài)性位點(diǎn)在制備診斷或治療強(qiáng)直性脊柱炎的試劑或藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103882112SQ201310712808
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】楊澤, 朱小泉, 楊帆, 孫亮, 史曉紅, 唐雷, 原慧萍, 張玉榮, 趙承孝, 趙帆, 王娜娜, 惠娟, 張政 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院