一種新的強(qiáng)直性脊柱炎易感性檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，特別是涉及一種利用 基因型檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的新方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 強(qiáng)直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏（VonBechterev)病或馬-施二氏 (Maritstrumpell)病，是一種慢性、進(jìn)行性，中軸關(guān)節(jié)受累的慢性炎癥性疾病。主要影響 骨盆的骶髂關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運(yùn)動(dòng)范圍受限、 X線顯示兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎（sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關(guān)節(jié)，并重 點(diǎn)累及脊柱，最終導(dǎo)致脊柱骨性強(qiáng)直，故目前國(guó)內(nèi)外多稱(chēng)之為強(qiáng)直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis, AS)〇
[0003] 強(qiáng)直性脊柱炎有明顯的種族性，在不同民族中發(fā)病率的差異很大。印第安人發(fā)病 率最高，北美印第安人發(fā)病率為2. 7%~6. 3%。其次為白種人，白種人中發(fā)病率為0. 1%~ 1.4%。黃種人低于白種人，我國(guó)約為0.3%。而黑人發(fā)病率最低，約為白人的1/4,在非洲 僅為0. 2%。
[0004] 強(qiáng)直性脊柱炎好發(fā)于20至40歲的成年人，尤其是20~30歲的青年男性。
[0005] 強(qiáng)直性脊柱炎呈常染色體顯性遺傳，有明顯的家族遺傳傾向，遺傳因素>90%。 據(jù)調(diào)查，強(qiáng)直性脊柱炎病人親屬發(fā)病率比一般人高一倍左右，同胞復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比為82. 90%以 上的AS病人具有HLA-B27陽(yáng)性，在正常人群中陽(yáng)性率為8%;子女HLA-B27陽(yáng)性占50%，發(fā) 生強(qiáng)直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定論，HLA-B27作為獨(dú)立的致病基因在AS的發(fā) 病中起作用。因?yàn)樵贖LA-B27陽(yáng)性個(gè)體中只有1 %~5%發(fā)展成為AS，提示還有其他基因參 與AS的發(fā)病。
[0006] MIR146A基因編碼的產(chǎn)物屬于一種microRNA，可以在信使RNA水平調(diào)節(jié)其下游目 的基因的表達(dá)和翻譯。已有的大量研究證明，MIR146A參與了人體炎癥通路的調(diào)控，是多個(gè) 前炎癥反應(yīng)的調(diào)控關(guān)鍵基因。MIR146A基因的多態(tài)性位點(diǎn)也被發(fā)現(xiàn)與多種自身免疫性疾病， 包括銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，硬化癥等相關(guān)。本發(fā)明所述的rs57095329位點(diǎn)與強(qiáng)直性脊 柱炎發(fā)病的相關(guān)性尚未有人提及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的強(qiáng)直性脊柱炎易感性檢測(cè)方法和試劑 盒，為輔助診斷（尤其是早期診斷）強(qiáng)直性脊柱炎和治療強(qiáng)直性脊柱炎提供基礎(chǔ)。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的利用基因型檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性 的方法，包括步驟：
[0009] 檢測(cè)該個(gè)體的MIR146A基因和/或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的MIR146A基因和/或轉(zhuǎn)錄 本相比較，存在差異就表明該個(gè)體患強(qiáng)直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測(cè)的是MIR146A的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常 MIR146A核苷酸序列比較差異。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性（SNP):
[0012] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. 1。
[0013] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在MIR146A基因的單核苷酸多 態(tài)性的方法，包括步驟：
[0014] 1)用MIR146A基因特異性引物擴(kuò)增樣品的MIR146A基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下的單核苷酸多態(tài)性：
[0016] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. 1。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述MIR146A基因特異性引物具有SEQ ID NO. 2和3的序列。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100_2000bp，且含有SEQ ID NO. 1中第 659 位。
[0019] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用基因型檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎（強(qiáng)直性脊柱炎 易感性）的試劑盒，其包括：特異性擴(kuò)增MIR146A基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物 擴(kuò)增出長(zhǎng)度為100-2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第659位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑：
[0021] 1)與SEQ ID NO. 1中第659位的突變結(jié)合的探針；
[0022] 2)識(shí)別SEQ ID NO. 1中第659位的突變限制性?xún)?nèi)切酶。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下的單核苷酸多態(tài)性：
[0024] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. 1。
[0025] 所述引物的序列，可如SEQ ID NO. 2和3所示。
[0026] 所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-2000bp且含有SEQ ID Ν(λ 1中第659位。
[0027] 所述試劑盒還包括：Taq酶、dNTPs、鎂離子、常規(guī)的PCR反應(yīng)緩沖液。
[0028] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測(cè)定和分析。發(fā) 現(xiàn)和證明了 MIR146A的基因組序列與強(qiáng)直性脊柱炎密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在 MIR146A 基因的 SEQ ID NO. 1 中第 659 位的 SNP (第 659 位 A - G)(記為 rs57095329)在對(duì) 照組和病例組中的分布存在顯著性差異（P < 0. 05)，因此，可作為輔助性檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱 炎（或其易感性）的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0029] 具體而言，本發(fā)明揭示了 MIR146A基因一種單核苷酸多態(tài)性（SNP)以及該多態(tài)性 與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO. 1所示序列的第659位的G/A多態(tài)， 基因型GG在強(qiáng)直性脊柱炎病人群中的頻率，要低于在正常對(duì)照人群中的頻率。
[0030] 最方便的檢測(cè)本發(fā)明SNP的方法，是通過(guò)用MIR146A基因特異性引物擴(kuò)增樣品的 MIR146A基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：第659 位A -G，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. 1。
[0031] 應(yīng)理解，在本發(fā)明揭示了 MIR146A基因的SNP與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性之后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過(guò)測(cè)序等 方法確定是否存在第659位A -G。通常，引物的長(zhǎng)度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖 然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定 的不互補(bǔ)（尤其是引物的5'端）的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增（即僅擴(kuò)增出所需的片 段）。
[0032] 含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物 擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQ ID N0. 2和3 的序列。
[0033] 雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100_2000bp，較 佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO. 1中第659 位。
[0034] 由于本發(fā)明的SNP與強(qiáng)直性脊柱炎具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因而可用于早期輔助性 診斷強(qiáng)直性脊柱炎，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措 施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此，具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 一、研究對(duì)象
[0038] 病例樣本全部采集自門(mén)診病人，患者的診斷由仁濟(jì)醫(yī)院富有臨床經(jīng)驗(yàn)的風(fēng)濕病科 醫(yī)師根據(jù)1984年提出修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)作出，并通過(guò)多次隨訪確診。對(duì)照樣本選自南方中心 樣本庫(kù)中病例組年齡、性別匹配、無(wú)關(guān)節(jié)炎病史的個(gè)體。
[0039] 在知情同意的基礎(chǔ)上，隨機(jī)收集了 96例AS病人和95例健康的正常對(duì)照個(gè)體的外 周血樣本。
[0040] 二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
[0041] 1、DNA 提取
[0042] 用常規(guī)酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA(也可采用商業(yè)化的試劑盒，提取 DNA)，濃度校正至20ng/ μ 1后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。
[0043] 2、用于PCR和測(cè)序中的引物設(shè)計(jì)
[0044] 根據(jù)GenBank中MIR146A的基因組序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物：
[0045] 有義引物 PI :5 ' -accgcagaaccaaattaacg-3 ' （SEQ ID N0. 2 所不）
[0046] 反義引物 P2 :5' -aatgaatcctcccaccatca-3 ' （SEQ ID Ν0· 3 所不）。
[0047] 3、MIR146A 基因的 PCR 擴(kuò)增
[0048] 以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性30秒，63°C退火40秒，72°C延伸40 秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0. 5°C;以后94°C變性30秒，58°C退火40秒，72°C 延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。
[0049] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果，獲得MIR146A基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050] 4、SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)
[0051] PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹(shù)脂純化后，用ABI-3730DNA測(cè)序儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 appl