一株甲萘醌-7（mk-7）高產(chǎn)菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株在培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生大量MK-7的解淀粉芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法。菌種名稱為Y-2，分類名稱Bacillus?amyloliquefaciens，所得菌株遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)量性狀穩(wěn)定，適合工業(yè)推廣，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO.M2013493。本發(fā)明還公開了一種生產(chǎn)MK-7的方法，以5%的種子接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下培養(yǎng)2h，然后靜置培養(yǎng)6天，維生素K2（MK-7）產(chǎn)量最高達到66.62mg/L。本發(fā)明所提供的MK-7高產(chǎn)菌株及生產(chǎn)方法，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)MK-7提供了可行性。
【專利說明】—株甲萘醌-7 (MK-7)高產(chǎn)菌及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種本發(fā)明涉及一株在培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生大量甲萘醌-7 (MK-7)的解淀粉芽孢桿菌，尤其涉及一種可以產(chǎn)生大量MK-7的解淀粉芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]K族維生素是人體必需的四種脂溶性維生素之一，按照來源不同可以分為K1和K2兩種，其中K1主要來源于植物，也稱葉綠醌，K2主要來源于微生物，也稱甲萘醌。從結(jié)構(gòu)上看，維生素K2除了萘醌母環(huán)外，在C-3位置上還有一條由異戊二烯單元組成的側(cè)鏈，根據(jù)異戊二烯單元個數(shù)的差異，維生素K2共分為14種，以MK_n表示，MK-7(甲萘醌-7)即表示側(cè)鏈上含有7個異戊二烯單元的維生素K2，其分子式為C46H64O2, CAS編號為2124-57-4。
[0003]MK-7最初是日本學者從日本傳統(tǒng)食品納豆中發(fā)現(xiàn)的，隨后其結(jié)構(gòu)和生理功能被慢慢地發(fā)掘出來。和其他維生素K2同系物一樣，MK-7是哺乳動物產(chǎn)生凝血因子I1、VI1、IX以及X的一個非常重要的輔因子，是正常血液凝固時不可或缺的營養(yǎng)素。MK-7還能夠活化鈣化抑制基質(zhì)Gla蛋白質(zhì)(matrix Gla protein MGP),從而防止鈣質(zhì)在血管中沉淀而造成的動脈硬化。另外，MK-7能夠?qū)⒐撬柚械墓氢}素活化，從而促進骨頭的形成。在日本，關(guān)東地區(qū)居民的股頸骨折發(fā)病率要比關(guān)西地區(qū)低很多，其原因就在于兩個地區(qū)飲食習慣的不同，造成前者血液中MK-7含量比后者要高很多。最近的流行病學研究表明，納豆中的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質(zhì)密度(BMD)，降低老年人的髖骨骨折風險。由于細胞對MK-7的攝取比其他K族維生素都好，并且MK-7在海產(chǎn)油中具有超常的穩(wěn)定性，而且能夠抵消海產(chǎn)油潛在的動脈鈣化誘導效應和對骨骼和軟骨健康潛在的的負面影響而又不抵消海產(chǎn)油的抗凝效應。因此在挪威，MK-7已經(jīng)作為一種優(yōu)選的維生素K2與海產(chǎn)油的多不飽和脂肪酸組合制成類藥劑營養(yǎng)品，用于治療和預防與骨、軟骨和心血管系統(tǒng)有關(guān)的疾病。因此MK-7作為一種藥品或者營養(yǎng)補充品，其獨特的生理功能已經(jīng)引起越來越多的研究人員的關(guān)注。
[0004]MK-7主要來源于納豆，其在納豆中含量也是所有食物中最高的，而納豆由于其富含具有溶栓功能的納豆激酶而聞名于世。但是納豆本身特有的氨臭味為很多人所不能接受，這就很大程度上限制了它的應用。鑒于這個原因，很多學者開始研究利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)MK-7，其最大的優(yōu)點就是通過發(fā)酵產(chǎn)生的MK-7是有生理活性的，而且有利于工業(yè)放大。但是從目前來看，MK-7還沒能實現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，其主要原因在于發(fā)酵法產(chǎn)量不高、發(fā)酵周期較長，原料成本較高，有鑒于此，有必要對MK-7生產(chǎn)菌株進行篩選優(yōu)化，以解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)MK-7的菌株，所述菌株其分類為Bacillusamyloliquefaciens Y_2野生型(解淀粉芽孢桿菌),該菌株已于2013年10月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢大學，其保藏編號為:CCTCCNO:M2013493。
[0006]所述菌株的16SrRNA序列如Seq ID N0.1所示。
[0007]所述菌株平板單菌落為白色或微黃色，圓形；幼齡菌落半透明，24h后逐漸發(fā)白，菌落粘稠，拉長絲；培養(yǎng)48h，菌落直徑可達到5mm以上，菌落邊緣不光滑呈裂葉狀，中央突起，或呈火山口狀；結(jié)晶紫染色后鏡檢，其個體微小，長2-3 μ m，寬0.6-0.9 μ m，其中有芽孢的短桿菌占多數(shù)，芽孢呈圓形或橢圓狀，不明顯膨大，芽孢中生或次中生，多為兩端均勻染色，靜止液體培養(yǎng)時，在液體表面生長。
[0008]所述菌株從納豆中分離得到。
[0009]所述玉米粉液化液是將工業(yè)玉米粉按照30%的比例(w/v)加水混勻，然后沸水浴進行糊化，再按照0.1%的比例加入高溫淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4層紗布過濾得到上清，再用水補充至原體積，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中還原糖含量為60g/L左右。
[0010]本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供了一種高產(chǎn)MK-7的方法。
[0011]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0012]利用解淀粉芽孢桿菌Y-2液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)MK-7，其制備方法如下:
[0013]1.菌種活化:將接有解淀粉芽孢桿菌Y-2的斜面在37°C恒溫箱里培養(yǎng)2_3h。
[0014]2.種子液制備: 將活化的菌種，用接種環(huán)挑接到50mL種子培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)10h。種子培養(yǎng)基配方為:玉米粉液化液IL (還原糖含量為20g/L左右)，豆柏粉20g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L，NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2,0.1MPa壓力下滅菌20min。
[0015]3.發(fā)酵液制備:將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下培養(yǎng)2h，然后靜置培養(yǎng)6天。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L, pH 為 7.0-7.2，0.07MPa 壓力下滅菌 20min。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌亞種Y-2產(chǎn)MK-7量高，在IOmL三角瓶中MK-7產(chǎn)量最高可達66.62mg/L,為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)MK-7提供了可行性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1菌株Y-2基于16SrRNA的進化樹
[0018]圖2菌株Y-2的代謝規(guī)律圖
【具體實施方式】:
[0019]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0020]實施例1解淀粉芽孢桿菌亞種Y-2的篩選及鑒定
[0021]1.本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌亞種Y-2的篩選方法為:
[0022]取納豆樣品4顆(約0.5g)于IOmL無菌生理鹽水中，80°C震蕩水浴lOmin。取100 μ L提取液，用適量無菌生理鹽水稀釋，最后取200 μ L的稀釋液涂布于LBG固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)，分離單菌落，從中挑選出能拉絲的菌落，轉(zhuǎn)接到LBG液體培養(yǎng)基中，370C培養(yǎng)24h，檢測其中的MK-7含量，從中挑選出MK-7產(chǎn)量最高的菌，命名為Y_2。
[0023]2.本發(fā)明提供的ΜΚ-7提取和檢測方法如下:
[0024]將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液于7000r/min離心5min，將上清和菌體分開，然后按照4:1的體積比分別加入萃取液(正己烷:異丙醇=2:1)，即4體積的發(fā)酵液加入I體積的萃取液，旋渦混勻2min后離心分層，取出上層有機層。需要注意的是要將萃取液分2-3次加入，即離心取出上層有機層后再加入萃取液萃取，這樣少量多次的萃取方式有助于從發(fā)酵液和菌體中完全萃取出MK-7。萃取后，將所有萃取液合并，37°C旋轉(zhuǎn)減壓蒸至近干，用少量正己烷溶解后完全轉(zhuǎn)移至IOmL離心管中，用N2吹干，再用500 μ L上機液(乙腈:二氯甲烷:甲醇=3:1:1)完全溶解后用0.22 μ m微孔濾膜過濾后用HPLC分析，所用色譜柱為Zorbax SB C18column (250X4.6mm, Agilent, USA)，流動相為甲醇:二氯甲燒=9:1 (v/v)，流速為 lmL/min,柱溫為40°C，檢測波長為270nm。
[0025]3.菌株Y-2的鑒定如下:
[0026]1.)形態(tài)學鑒定:
[0027]普通瓊脂營養(yǎng)平板劃線，37°C培養(yǎng)10h，單菌落為白色或微黃色，圓形；幼齡菌落半透明，24h后逐漸發(fā)白，菌落粘稠，拉長絲；培養(yǎng)48h，菌落直徑可達到5mm以上，菌落邊緣不光滑呈裂葉狀，中央突起，或呈火山口狀；結(jié)晶紫染色后鏡檢，其個體微小，長2-3 μ m,寬
0.6-0.9 μ m，其中有芽孢的短桿菌占多數(shù)，芽孢呈圓形或橢圓狀，不明顯膨大，芽孢中生或次中生，多為兩端均勻染色。靜止液體培養(yǎng)時，在液體表面生長，表明其是好氧菌。
[0028]2.) 16SrRNA 測序:
[0029]菌株Y-2基因組DNA的提取:參照Takara基因組抽提試劑盒的說明提取基因組DNA，具體步驟如下:挑取在LB平板上培養(yǎng)的Y-2單菌落，于IOmLLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取2mL菌液，12000r/min離心2min,收集菌體。按3mg/mL量加入溶菌酶，37°C 孵育 lh。取出，加入 180μ L 的 Buffer GL、20 μ L 的 Proteinase K 和 10 μ L 的 RNaseA (10mg/mL)，充分振蕩混勻，于56°C水浴20min。之后加入200 μ L的Buffer GB，充分混勻。溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000r/min離心2min,棄濾液。將500 μ L的Buffer WA加入至Spin Column中，12000r/min離心lmin,棄濾液。再將500 μ L的Buffer WB加入至 Spin Column 中，12000r/min 離心 lmin,棄濾液。重復加入 Buffer WB, 12000r/min 離心 lmin，棄濾液。將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12000r/min 離心 2min。將Spin Column安置于新的1.5mL離心管上,在Spin Column膜的中央處加入50-200 μ L的Elution Buffer,室溫靜置5min。12000r/min離心2min洗脫DNA。以所提的基因組為模板，建立如下PCR反應體系:模板DNA2 μ L，Buffer5 μ L，Mg2+3 μ L，上游引物I μ L，下游引物 I μ L，dNTPl μ L, Taq DNA Polymerasel μ L，用雙蒸水補齊到 50 μ L。其中 Buffer 濃度為 25mmol/L, Mg2+濃度為 10mmol/L, Taq DNA Polymerase 濃度為 5U/mL,上游引物序列為5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列為 5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR 擴增程序為:95°C預變性5min,30個循環(huán)(94°C變性30s，45°C退火90s，72。。延伸1.5min),72°C延伸lOmin。PCR反應結(jié)束后取5 μ L PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀下檢測，結(jié)果表明所提基因組大小約為1500bp。
[0030]菌株Y-2基于16SrRNA的進化樹構(gòu)建如圖1所示:
[0031]實施例2[0032]玉米粉液化液制作方法:將工業(yè)玉米粉按照30%的比例(質(zhì)量體積比w/v)加水混勻，然后沸水浴進行糊化，再按照0.1%的比例加入高溫淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4層紗布過濾得到上清，再用水補充至原體積，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中還原糖含量為60g/L左右。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0034]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量10mL，37°C，靜置培養(yǎng)6天。
[0035]測得MK-7含量為66.62mg/L，在此期間，OD、pH、總糖、還原糖以及MK-7的代謝規(guī)律如圖2所示。
[0036]實施例3
[0037]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0038]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量10mL，37°C，靜置培養(yǎng)5天。
[0039]測得MK-7 含量為 62.26mg/L。
[0040]實施例4
[0041]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0042]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量10mL，37°C，靜置培養(yǎng)4天。
[0043]測得MK-7 含量為 48.88mg/L。
[0044]實施例5
[0045]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0046]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量30mL，37°C，靜置培養(yǎng)4天。
[0047]測得MK-7 含量為 47.23mg/L。
[0048]實施例6
[0049]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為40g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0050]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量10mL，37°C，靜置培養(yǎng)4天。
[0051 ]測得 MK-7 含量為 54.80mg/L。
[0052]實施例7
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉液化液IL (還原糖含量為60g/L左右)，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨 15g/L，酵母膏 15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2。
[0054]接種與培養(yǎng)條件:以5%的接種量，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量10mL，37°C，靜置培養(yǎng)5天。[0055]發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液冷凍干燥，測得MK-7含量為182.88 μ g/g。
[0056]以上所述，僅為發(fā)明的【具體實施方式】。本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應當涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一株甲萘醌-7高產(chǎn)菌株,為解淀粉芽孢桿菌亞種(Bacillus amyloliquefaciens)Y-2，于2013年10月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC NO:Μ2013493。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲萘醌-7高產(chǎn)菌株，其特征在于所述菌株從納豆中分離得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲萘醌-7高產(chǎn)菌株，其特征在于所述菌株平板單菌落為白色或微黃色，圓形；幼齡菌落半透明，24h后逐漸發(fā)白，菌落粘稠，拉長絲；培養(yǎng)48h，菌落直徑可達到5mm以上，菌落邊緣不光滑呈裂葉狀，中央突起，或呈火山口狀；結(jié)晶紫染色后鏡檢，其個體微小，長2-3 μ m，寬0.6-0.9 μ m，其中有芽孢的短桿菌占多數(shù)，芽孢呈圓形或橢圓狀，不明顯膨大，芽孢中生或次中生，多為兩端均勻染色，靜止液體培養(yǎng)時，在液體表面生長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲萘醌-7高產(chǎn)菌株，其特征在于所述菌株的16SrRNA序列如Seq ID N0.1 所示。
5.一種應用權(quán)利要求1所述菌株生產(chǎn)甲萘醌-7的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)將活化的菌種，用接種環(huán)挑接到50mL種子培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)IOh； 2)將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為IOOr/min的條件下培養(yǎng)2h，然后靜置培養(yǎng)6天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)甲萘醌-7的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基為:玉米粉液化液1L，豆柏粉20g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K2HPO40.lg/L，NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2，0.1MPa 壓力下滅菌 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)甲萘`醌-7的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米粉液化液1L，豆柏粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K2HPO40.lg/L, NaC12.5g/L，pH 為 7.0-7.2，0.07MPa 壓力下滅菌 20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的生產(chǎn)甲萘醌-7的方法其特征在于所述玉米粉液化液是將工業(yè)玉米粉按照30%的比例(w/v)加水混勻，然后沸水浴進行糊化，再按照0.1%的比例加入高溫淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4層紗布過濾得到上清，再用水補充至原體積，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中還原糖含量為60g/L左右。
【文檔編號】C12N1/20GK103865835SQ201310694798
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】張偉國, 錢和, 嚴為留 申請人:江南大學