采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物多糖的制備，特別是指一種采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法。采用熱沖擊方法對膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013進行菌種馴化，在含有碳源、氮源和生長因子的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)通氣培養(yǎng)步驟A中馴化后的膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013，獲得含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液，采用大孔吸附樹脂對步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行分離，制成微生物絮凝劑。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的成本高、絮凝劑的純度低等問題，具有制備過程工藝成本低、收率高、產(chǎn)品純度及活性高等優(yōu)點。
【專利說明】采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物多糖的制備，特別是指一種采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法。
【背景技術(shù)】[0002]微生物絮凝劑是利用現(xiàn)代生物技術(shù)，經(jīng)過微生物的發(fā)酵提取精制等工藝從微生物或其分泌物中制備具有凝聚性的代謝產(chǎn)物，是一種無毒的生物高分子化合物，主要有糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA以及有絮凝活性的菌體等。微生物絮凝劑具有絮凝范圍廣，絮凝活性高安全無害無污染等特點，且絮凝劑產(chǎn)生菌的種類多，生長快，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前絮凝劑一般可分為無機絮凝劑、有機合成高分子絮凝劑和天然有機高分子絮凝劑。無機絮凝劑和有機合成高分子絮凝劑由于其良好的絮凝效果和較低的使用成本而被廣泛應用。然而，這些絮凝劑存在著較大的不安全性和潛在的二次污染問題。如無機絮凝劑中的鋁離子容易引起老年癡呆癥，鐵鹽絮凝劑對設備有腐蝕作用及易形成某些難絮凝沉淀的化合物；某些有機合成絮凝劑如聚丙烯酰胺等，不易降解，單體致癌，在某些領(lǐng)域已限制或禁止使用。因此，開發(fā)一種安全無毒、絮凝活性高、無二次污染的新型絮凝劑對產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝改進、人類的健康和環(huán)境保護都具有很重要的現(xiàn)實意義。利用微生物絮凝劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的絮凝劑是水處理發(fā)展的一個必然趨勢。
[0003]膠質(zhì)類芽抱桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCC10013在生長過程中產(chǎn)生大量莢膜，莢膜的主要成分為多糖，通過實驗證明，此發(fā)酵液中多糖可以作為絮凝劑很好地應用于工業(yè)水處理、食品等行業(yè)。且此絮凝劑的絮凝效果好，成本低。
[0004]目前，傳統(tǒng)的微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法為篩選絮凝劑產(chǎn)生菌，優(yōu)化發(fā)酵條件，利用醇沉的方法來提純，傳統(tǒng)的醇沉的方法需設立酒精回收裝置，進行酒精蒸餾流回收，成本較高，且存在污染，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]利用大孔吸附樹脂對多糖粗提物進行脫色和脫蛋白是近年來新發(fā)展起來的一種方法。大孔吸附樹脂是一類新型的高分子聚合物，它具有物理、化學穩(wěn)定性高、吸附選擇性高、不受無機鹽類存在的影響、解吸條件溫和、使用周期長、再生簡便、成本低等諸多優(yōu)點。利用大孔樹脂的選擇性吸附特點將多糖分離出來。利用大孔吸附樹脂脫色脫蛋白的最大優(yōu)點是:其操作條件溫和，不會破壞多糖的結(jié)構(gòu)和活性，且能同時去除多糖粗提物中的色素和蛋白等雜質(zhì)，滿足試驗要求。采用大孔吸附樹脂對微生物絮凝劑進行后處理未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，該方法的成本較低且收率高，所制備的微生物絮凝劑純度及活性高。
[0007]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0008]采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，包括如下工藝步驟:
[0009]A、采用熱沖擊方法對膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCCIOO13進行菌種馴化；
[0010]B、在含有碳源、氮源和生長因子的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)通氣培養(yǎng)步驟A中馴化后的膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013，獲得含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液；
[0011]C、采用大孔吸附樹脂對步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行分離，制成微生物絮凝劑。
[0012]本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容還有:
[0013]為便于微生物絮凝劑的生產(chǎn)，提高產(chǎn)品的收率并提高產(chǎn)品的純度及活性，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟A包括如下 工藝步驟:
[0014]Al、在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液；
[0015]A2、將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，1-10分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻。
[0016]所述的步驟Al中的試管斜面采用高產(chǎn)孢子斜面。
[0017]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0018]淀粉5%_20%，蔗糖5%_10%，硫酸銨0.5%_2%，磷酸氫二鉀1%_2%，三氯化鐵
0.01%-0.5%,吐溫-800.001%-0.01%，酵母膏 0.1%_3%，余量為自來水，pH=7.5。
[0019]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0020]
0-12小時通風量1:0.2vvm 溫度30-32-C;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19-26小時通風量l:0.6vvm 溫度30-32°C;
27_42小時通風量1:0.4vvm 溫度30-32°C，流加吐溫-80;
43-60小時通風量1:0.3vvm 溫度28_30°C;
[0021]接種量為菌種:無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比=4%_8%。
[0022]所述的步驟B中的反復變溫培養(yǎng)I小時是指在培養(yǎng)進行至15-16小時，升溫至350C _37°C培養(yǎng)10分鐘，再降溫至30°C _32°C培養(yǎng)10分鐘，變溫培養(yǎng)過程往復循環(huán)I小時。
[0023]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0024]采用大孔吸附樹脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:
[0025]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0026]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0027]C3、樹脂的吸附
[0028]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為5-7、濃度為0.005-0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液以2BV/h_5BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；[0029]C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3_l中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0030]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以lBV/h_4BV/h的流速通過步驟C3-1中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0031]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0032]C4-1:用 pH=5-7、濃度為 0.005-0.02mol/L 的磷酸鹽緩沖液 IBV 以 lBV/h_4BV/h 的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；
[0033]C4-2:用pH=5-7的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以lBV/h_4BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0034]為便于工業(yè)化生產(chǎn)，優(yōu)選且較為常見的技術(shù)方案是，所述的步驟A、B之間還包括種子液的制備，其中種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0035]淀粉0.5-5g,磷酸氫二鉀0.5-5g,蛋白胨0.5_5g，酵母膏0.5_5g，硫酸銨
0.05-0.5g，硫酸鎂 0.05-0.5g，蒸餾水 1000ml，瓊脂 18g ；
[0036]種子液的制備過程如下:將種子培養(yǎng)基配制完畢后分裝克式瓶進行滅菌；將馴化后的菌種進行活化后接種至滅菌后的種子培養(yǎng)基，在溫度28-32°C下培養(yǎng)36-60小時。
[0037]所述的種子液的制備中馴化后的菌種活化是在常溫下進行，時間為4小時。
[0038]本發(fā)明所取得的實質(zhì)性特點和顯著的技術(shù)進步在于:
[0039]1、本發(fā)明所述的方法中采用發(fā)酵工藝得到的絮凝劑成分較單一，主要成分為弱酸性多糖，活性基主要為羥基，選擇合適的大孔吸附樹脂，進行選擇性吸附，可達到較好地分離純化及濃縮效果，工藝收率高，大大縮短了工藝時間，降低了工藝成本，減少了對環(huán)境的污染，所得的絮凝劑純度高，可以用于食品業(yè)。
[0040]2、所制備的絮凝劑純度及活性高，絮凝劑產(chǎn)量最高可達8.lg/ml,絮凝劑的收率可以達到90%以上，絮凝活性可達到95%以上，絮凝劑的純度至少達到97% (最高可達到99%)。
【具體實施方式】
[0041]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準，任何依據(jù)說明書作出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護范圍。
[0042]實施例1
[0043]采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，包括如下工藝步驟:
[0044]A、采用熱沖擊方法對膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)ACCC10013進行菌種馴化；
[0045]B、在含有碳源、氮源和生長因子的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)通氣培養(yǎng)步驟A中馴化后的膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013，獲得含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液；
[0046]C、采用大孔吸附樹脂對步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行分離，制成微生物絮凝劑。
[0047]所述的步驟A包括如下工藝步驟:[0048]Al、在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液；
[0049]A2、將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，1-10分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻。
[0050]所述的步驟Al中的試管斜面采用高產(chǎn)孢子斜面。
[0051]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0052]淀粉5%，蔗糖5%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀1%，三氯化鐵0.01%,吐溫-800.001%,酵母膏0.1%，余量為自來水，pH=7.5。
[0053]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0054]
0-12小時通風量1: 0.2vvm 溫度3(TC;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19_26小時通風量1:0.6vvm 溫度301:;
27_42小時通風量1:0.4vvm 溫度3(TC,流加吐溫-80;
43-60小時通風量1:0.3vvm 溫度WC;
[0055]接種量為菌種:無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比=4%_8%。
[0056]所述的步驟B中的反復變溫培養(yǎng)I小時是指在培養(yǎng)進行至15-16小時，升溫至350C _37°C培養(yǎng)10分鐘，再降溫至30°C _32°C培養(yǎng)10分鐘，變溫培養(yǎng)過程往復循環(huán)I小時。
[0057]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0058]采用大孔吸附樹脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:
[0059]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0060]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0061]C3、樹脂的吸附
[0062]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為5、濃度為0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液以2BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；
[0063]C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3_l中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0064]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以lBV/h的流速通過步驟C3-1中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0065]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0066]C4-1:用pH=5、 濃度為0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以lBV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；[0067]C4-2:用pH=5的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以lBV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0068]所述的步驟A、B之間還包括種子液的制備，其中種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0069]淀粉0.5g,磷酸氫二鉀0.5g,蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,硫酸銨0.05g，硫酸鎂
0.05g,蒸懼水 1000ml,瓊脂 18g。
[0070]種子液的制備過程如下:將種子培養(yǎng)基配制完畢后分裝克式瓶進行滅菌；將馴化后的菌種進行活化后接種至滅菌后的種子培養(yǎng)基，在溫度28°C下培養(yǎng)36小時。
[0071]所述的種子液的制備中馴化后的菌種活化是在常溫下進行，時間為4小時。
[0072]采用如下方法對絮凝劑的活性進行測定:
[0073]在100ml量筒中加入0.5g高嶺土懸濁液，5mll% (wt%) CaCl2溶液和2ml待測液，先快速攪拌I分鐘，再慢攪5分鐘，后靜置10分鐘，用721分光光度計測定其吸光度，波長選用550nm。以作CaCl2溶液作為對照，通過下面的公式確定絮凝率。
[0074]絮凝率(％)= (A-B ) /A X 100%
[0075]A為對照上清液550nm處的光密度值；B為樣品上清液550nm處的光密度值。
[0076]實施例1中絮凝劑產(chǎn)量為8.lg/ml,絮凝劑的收率為92%，絮凝活性為95%，絮凝劑的純度為97%。
[0077]實施例2
[0078]本實施例與實施例1的區(qū)別是:
[0079]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0080]淀粉20%，蔗糖10%，硫酸銨2%，磷酸氫二鉀2%，三氯化鐵0.5%，吐溫-800.01%,酵母膏3%，余量為自來水，pH=7.5。
[0081]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0082]
0-12小時通風量1:0.2VVm 溫度32°C;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19-26小時通風量1:0.6vvm 溫度32°C;
27_42小時通風量1:0.4vvm 溫度32°C,流加吐溫-80;
43-60小時通風量l:0.3vvm 溫度30。0，
[0083]接種量為菌種:無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比=4%_8%。
[0084]所述的步驟A、B之間還包括種子液的制備，其中種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0085]淀粉5g,磷酸氫二鉀5g,蛋白胨5g,酵母膏5g,硫酸銨0.5g,硫酸鎂0.5g,蒸懼水 1000ml,瓊脂 18g。
[0086]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0087]采用大孔吸附樹 脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:[0088]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0089]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；[0090]C3、樹脂的吸附
[0091]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為7、濃度為0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液以5BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；
[0092]C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3_l中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0093]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以4BV/h的流速通過步驟C3_l中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0094]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0095]C4-1:用pH=5-7、濃度為0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以4BV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；
[0096]C4-2:用pH=7的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以4BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0097]本實施例中絮凝劑產(chǎn)量為7.9g/ml,絮凝劑的收率為90%，絮凝活性為96%，絮凝劑的純度為98%。
[0098]其余技術(shù)內(nèi)容同實施例1。
[0099]實施例3
[0100]本實施例與實施例1的區(qū)別在于:
[0101]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0102]淀粉10%，蔗糖8%，硫酸銨1%，磷酸氫二鉀1.5%，三氯化鐵0.2%，吐溫-800.005%,酵母膏1%，余量為自來水，pH=7.5。
[0103]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0104]
O-12小時通風量1:0.2VVm 溫度30°C;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19-26小時通風量1:0.6vvm 溫度32°C;
27-42小時通風量l:0.4vvm 溫度32°C,流加吐溫-80;
43-60小時通風量l:0.3vvm 溫度30°C;
[0105]所述的步驟A、B之間還包括種子液的制備，其中種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0106]淀粉3g,磷酸氫二鉀2g,蛋白胨3g,酵母膏3g,硫酸銨0.3g,硫酸鎂0.3g,蒸懼水 1000ml,瓊脂 18g。[0107]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0108]采用大孔吸附樹脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:
[0109]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0110]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0111]C3、樹脂的吸 附
[0112]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為5.5、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液以3BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；
[0113]C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3-1中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0114]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以2BV/h的流速通過步驟C3-1中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0115]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0116]C4-1:用pH=5.5、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以2BV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；
[0117]C4-2:用pH=5.5的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以2BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0118]本實施例中絮凝劑產(chǎn)量為8.0g/ml,絮凝劑的收率為93%，絮凝活性為98%，絮凝劑的純度為99%。
[0119]其余技術(shù)內(nèi)容同實施例1。
[0120]實施例4
[0121]本實施例與實施例1的區(qū)別在于:
[0122]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0123]淀粉18%，蔗糖6%，硫酸銨1.5%，磷酸氫二鉀1.8%，三氯化鐵0.05%,吐溫-800.003%，酵母膏0.8%，余量為自來水，pH=7.5。
[0124]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0125]
O-12小時通風量1: O-2VVm 溫度3rc;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19-26小時通風量1: 0.6vvm 溫度3(TC;
27-42小時通風量1:0.4vvm 溫度32V,流加吐溫-80;
43-60小時通風量1: 0.3vvm 溫度28°C;
[0126]種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:[0127]淀粉0.8g,磷酸氫二鉀0.8g,蛋白胨lg，酵母膏l(xiāng)g，硫酸銨0.lg，硫酸鎂0.1g,蒸懼水1000ml,瓊脂18g。
[0128]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0129]采用大孔吸附樹脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:
[0130]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0131]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%Na0H溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0132]C3、樹脂的吸附
[0133]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為6.5、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液以3BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；
[0134]C3-2:調(diào)節(jié)步驟 Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3-1中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0135]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以3BV/h的流速通過步驟C3_l中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0136]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0137]C4-1:用pH=6.5、濃度為0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以3BV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；
[0138]C4-2:用pH=6.5的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以3BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0139]本實施例中絮凝劑產(chǎn)量為7.8g/ml,絮凝劑的收率為92%，絮凝活性為95%，絮凝劑的純度為99%。
[0140]其余技術(shù)內(nèi)容同實施例1。
[0141]實施例5
[0142]本實施例同實施例1的區(qū)別在于:
[0143]所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0144]淀粉7%，蔗糖8%，硫酸銨0.8%，磷酸氫二鉀1.4%，三氯化鐵0.4%，吐溫-800.008%,酵母膏2%，余量為自來水，pH=7.5。
[0145]所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是:
[0146]O-12小時通風量1:0.2VVm 溫度31°C;
13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時；
19_26小時通風量1:0.6vvm 溫度31°C;
27-42小時通風量l:0.4vvm 溫度32°C,流加吐溫-80;
43-60小時通風量1:0.3vvm 溫度3(TC;
[0147]種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成:
[0148]淀粉4g,磷酸氫二鉀4g,蛋白胨3g,酵母膏4g,硫酸銨0.4g,硫酸鎂0.4g,蒸懼水 1000ml,瓊脂 18g。
[0149]所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
[0150]采用大孔吸附樹脂對含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行后處理優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟C包括如下工藝步驟:
[0151]Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離；
[0152]C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸懼水沖洗至pH為中性,再用質(zhì)量百分比為5%NaOH溶液浸泡后后用蒸懼水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分 比 為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗洗掉乙醇溶液；
[0153]C3、樹脂的吸附
[0154]C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為6.0、濃度為0.015mol/L的磷酸鹽緩沖液以4BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)；
[0155]C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3-1中的磷酸鹽緩沖液相等；
[0156]C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以4BV/h的流速通過步驟C3_l中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液；
[0157]C4、微生物絮凝劑的洗脫收集
[0158]C4-1:用pH=6.0、濃度為0.015mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以4BV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱；
[0159]C4-2:用pH=6.0的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以4BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
[0160]本實施例中絮凝劑產(chǎn)量為7.6g/ml,絮凝劑的收率為93%，絮凝活性為96%，絮凝劑的純度為99%。
[0161]其余技術(shù)內(nèi)容同實施例1。
【權(quán)利要求】
1.采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于包括如下工藝步驟: A、采用熱沖擊方法對膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013進行菌種馴化； B、在含有碳源、氮源和生長因子的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)通氣培養(yǎng)步驟A中馴化后的膠質(zhì)類芽孢桿菌ACCC10013，獲得含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液； C、采用大孔吸附樹脂對步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行分離，制成微生物絮凝劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟: Al、在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液； A2、將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，1-10分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟Al中的試管斜面采用高產(chǎn)孢子斜面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟B中的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成: 淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸銨0.5%-2%，磷酸氫二鉀1%_2%，三氯化鐵0.01%-0.5%，吐溫-800.001%-0.01%，酵母膏0.1%_3%，余量為自來水，pH=7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟B中的培養(yǎng)條件是: 0-12小時通風量1:0.2vvm 溫度30-32°C; 13-18小時通風量1: 0.2vvm 30-37°C反復變溫培養(yǎng)I小時； 19-26小時通風量1:0.6vvm 溫度30-32°C; 27-42小時通風量1:0.4vvm 溫度30-32°C,流加吐溫-80; 43-60小時通風量1:0.3vvm 溫度28-30°C; 接種量為菌種:無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量比=4%-8%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟B中的反復變溫培養(yǎng)I小時是指在培養(yǎng)進行至15-16小時，升溫至35V -37V培養(yǎng)10分鐘，再降溫至30°C _32°C培養(yǎng)10分鐘，變溫培養(yǎng)過程往復循環(huán)I小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟C中的大孔樹脂選用S-8大孔吸附樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟C包括如下工藝步驟: Cl、發(fā)酵液的固液分離:將步驟B中制備的含有微生物絮凝劑的發(fā)酵液進行固液分離； C2、樹脂的預處理:選用大孔吸附樹脂，先用質(zhì)量百分比為5%HC1溶液浸泡4小時后用蒸餾水沖洗至PH為中性，再用質(zhì)量百分比為5%NaOH溶液浸泡后后用蒸餾水沖洗至pH為中性，而后用質(zhì)量百分比為95%的乙醇溶液浸滿樹脂，最后用蒸餾水充分淋洗，洗掉乙醇溶液； C3、樹脂的吸附 C3-1:將經(jīng)預處理的樹脂以濕法裝入樹脂柱中，用去離子水充分淋洗，然后用pH為5-7、濃度為0.005-0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液以2BV/h_5BV/h的流速進行淋洗，使樹脂層析柱達到平衡狀態(tài)； C3-2:調(diào)節(jié)步驟Cl中制備的濾液的pH，使其與步驟C3-1中的磷酸鹽緩沖液相等； C3-3:將步驟C3-2中調(diào)好pH的濾液以lBV/h-4BV/h的流速通過步驟C3-1中達到平衡狀態(tài)的樹脂層析柱，當樹脂層析柱吸附IOBV濾液后停止加液； C4、微生物絮凝劑的洗脫收集 C4-1:用pH=5-7、濃度為0.005-0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液IBV以lBV/h_4BV/h的流速淋洗步驟C3-3中吸附濾液后的樹脂層析柱； C4-2:用pH=5-7的磷酸鹽+氯化鈉緩沖液以lBV/h-4BV/h的流速洗脫樹脂層析柱上的絮凝劑，待流出液有絮凝劑出現(xiàn)時開始收集洗脫液，直到絮凝劑經(jīng)檢測被全部洗脫。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的步驟A、B之間還包括種子液的制備，其中種子培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分含量的組分組成: 淀粉0.5-5g，磷酸氫二鉀0.5-5g，蛋白胨0.5-5g，酵母膏0.5_5g，硫酸銨0.05_0.5g，硫酸鎂0.05-0.5g，蒸餾水1000ml，瓊脂18g ； 種子液的制備過程如下:將種子培養(yǎng)基配制完畢后分裝克式瓶進行滅菌；將馴化后的菌種進行活化后接種至滅菌后的種子培養(yǎng)基，在溫度28-32°C下培養(yǎng)36-60小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的種子液的制備中馴化后的菌種活化是在常溫下進行，時間為4小時。
【文檔編號】C12P19/04GK103642873SQ201310651488
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】章淑艷, 王云鵬, 趙從波, 秦艷梅, 李賓, 李軍, 韓韜, 羅同陽, 鄭翔, 劉麗娜 申請人:河北省微生物研究所