一株產(chǎn)耐高溫角蛋白酶的地衣芽孢桿菌utm107 及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株產(chǎn)耐高溫角蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)UTM107及其應(yīng)用。該菌生物保藏編號(hào)為CGMCC No.9678。UTM107菌株可在下水污泥、生活垃圾、餐廚垃圾、動(dòng)物尸體及畜禽糞便等廢棄物中進(jìn)行好氧堆肥發(fā)酵，在發(fā)酵過程中溫度可達(dá)80～90℃，最高可達(dá)100℃以上，并長(zhǎng)時(shí)間維持高溫，能有效分解廢棄物中的有機(jī)物。采用本發(fā)明的菌株制備的生物肥料綠色環(huán)保、性能優(yōu)良，用其處理有機(jī)固體廢棄物可做到無害化、減量化、資源化。應(yīng)用本發(fā)明所制備的生物肥料綠色環(huán)保、性能優(yōu)良。
CGMCC No. 9678
20140918
【專利說明】一株產(chǎn)耐高溫角蛋白酶的地衣芽孢桿菌UTM107及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及城鄉(xiāng)有機(jī)固體廢棄物治理領(lǐng)域，涉及一種含角蛋白酶基因的地衣芽孢 桿菌UTM107菌株及其在城鄉(xiāng)有機(jī)固體廢棄物處理中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)每年城鎮(zhèn)產(chǎn)生的生活污泥約8000萬噸，并以5%的速度增長(zhǎng)。城鎮(zhèn)生活廢水 經(jīng)處理后產(chǎn)生大量的污泥，其處理方式目前以脫水后填埋為主。在大量耗能污染空氣的同 時(shí)，占用大量的土地，還可能造成周邊環(huán)境與地下水資源的污染。另外目前我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè) 生產(chǎn)能力已居世界第一，畜禽養(yǎng)殖和加工過程中所產(chǎn)生大量的有機(jī)廢棄物，在某些地區(qū)已 成為大于工業(yè)污染的污染源。因此，采用更有效的方法對(duì)城鄉(xiāng)生活污泥、餐廚垃圾、畜禽養(yǎng) 殖與加工產(chǎn)生的廢棄物以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生廢棄物進(jìn)行更合理的處理，真正做到無害化、減 量化和資源化很有必要。
[0003] 微生物發(fā)酵法是微生物利用有機(jī)廢棄物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在適宜的溫度水分等條件 下利用有機(jī)物大量生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)產(chǎn)生的多種酶將有機(jī)大分子變成更小更簡(jiǎn)單分子，使各 種復(fù)雜的有機(jī)態(tài)養(yǎng)分，轉(zhuǎn)化為可溶性易吸收的養(yǎng)分和腐殖質(zhì)。接種外源微生物能夠在堆肥 中形成優(yōu)勢(shì)菌群，有明顯的促進(jìn)堆肥腐熟的功能。堆肥好氧發(fā)酵技術(shù)是目前處理有機(jī)固體 廢棄物的有效方法，其占地少、技術(shù)簡(jiǎn)單、易操作、易推廣、處理成本低。
[0004] 地衣芽孢桿菌（Bacillus Iicheniformis)是一種常見的土壤微生物類群，能分泌 多種酶，能快速分解和利用多種有機(jī)物。將地衣芽孢桿菌應(yīng)用于有機(jī)固體廢棄物的處理，具 有良好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)耐高溫角蛋白酶的地衣芽孢桿菌UTM107菌株及其 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明從采自云南騰沖溫泉的底泥，利用馴化培養(yǎng)基（牛肉膏5g、酵母提取物5g、 蛋白胨l〇g、氯化鈉5g、可溶性淀粉15g、蒸餾水1000ml)在50°C經(jīng)多代富集馴化，定向篩選 出UTM107菌株。
[0007] 本發(fā)明提供的UTM107菌株為G+、細(xì)胞0. 8X (2. 5?3. 5) μ m、直桿狀、單生、產(chǎn)生 近中生橢圓芽孢，孢囊稍膨大；在含葡萄糖蛋白胨瓊脂的培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、 酵母膏5g、氯化鈉5、瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0)上菌落光滑正園、微突、蛋殼黃色、生 長(zhǎng)迅速，30?50°C培養(yǎng)24小時(shí)后菌落直徑約2?3mm，最適生長(zhǎng)溫度40?70°C。
[0008] 利用引物為（27f) :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因，測(cè)序后的基因序列見序 列表SEQ ID No: 1，將獲得序列提交到EzTaxon數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示UTM107菌株的該 基因與Bacillus Iicheniformis的相似性最高，為99. 7%，此序列是鑒定該菌株的主要特 征依據(jù)。
[0009] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的gyrB基因，測(cè)序后的基因序列見序 列表SEQ ID N〇:2。獲得的序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比 對(duì)，結(jié)果顯示UTM107菌株的gyrB基因序列與Bacillus Iicheniformis相似性最高，結(jié)合 所述菌株的生理生化特性為鑒別該菌株的次要特征。確定該菌株為地衣芽孢桿菌BaciIlus Iicheniformis 0
[0010] 菌株UTM107已于2014年9月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研 宄所，郵編100101)保藏，分類命名為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，保藏號(hào)為 CGMCC No. 9678。
[0011] 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌菌株UTM107,其能夠產(chǎn)生耐高溫角蛋白酶，尿囊素酶，纖維 二糖酶和β -葡聚糖內(nèi)切酶，因此具有耐高溫角蛋白酶、尿囊素酶、纖維二糖酶、β -葡聚糖 內(nèi)切酶活性，其編碼基因分別如序列表SEQ ID Ν〇:3?6所示。
[0012] 本發(fā)明提供了含有地衣芽孢桿菌UTM107的菌劑。
[0013] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌UTM107或其菌劑在有機(jī)固體廢棄物的生物降解過程 中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供一種制備含地衣芽孢桿菌UTM107的堆肥接種劑的方法，包括以下 步驟：
[0015] (1)制備發(fā)酵液：將地衣芽孢桿菌菌株UTM107接種于LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā) 酵；
[0016] (2)發(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到粉末狀菌劑。
[0017] 上述方法中，步驟（1)是將地衣芽孢桿菌UTM107接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 培養(yǎng)溫度35?50°C，搖床轉(zhuǎn)速100?250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24?48小時(shí)，得搖瓶種子 液；
[0018] 將搖瓶種子液接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的種子罐中，培養(yǎng)溫度35?50°C、攪拌轉(zhuǎn)速 200轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量1:0. 4 (v/v)、培養(yǎng)時(shí)間30?40小時(shí)，得到種子罐種子液；
[0019] 將種子罐種子液接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35?50°C、攪拌速度 60?200轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量1:0. 5 (v/v)、接種量0. 05 %?5 %、培養(yǎng)時(shí)間24?40小時(shí)，當(dāng) 0D6QQ》1. 8時(shí)停止培養(yǎng)，得到UTM107的發(fā)酵液。
[0020] 優(yōu)選地，制備搖瓶種子液的條件為：培養(yǎng)溫度40°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng) 時(shí)間36小時(shí)。
[0021] 制備種子罐種子液的條件為：培養(yǎng)溫度35?50°C、攪拌轉(zhuǎn)速100?400轉(zhuǎn)/分鐘、 通氣量1:0. 4(v/v)、培養(yǎng)時(shí)間36小時(shí)。
[0022] 優(yōu)選地，將種子罐種子液接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度40°C、攪拌 速度100轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量1:0. 5(v/v)、接種量2%、培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。
[0023] 本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌菌株UTM107或含有其的菌劑在有機(jī)固體廢棄物堆肥 發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0024] 所述有機(jī)固體廢棄物為下水污泥、生活垃圾、作物秸桿、動(dòng)物尸體或畜禽糞便中的 一種或多種。
[0025] 用地衣芽孢桿菌菌株UTM107或含有其的菌劑對(duì)有機(jī)固體廢棄物進(jìn)行堆肥的方 法，包括以下步驟：
[0026] (1)將相當(dāng)于總物料濕重0. 1%?1%的UTM107或其菌劑接種于有機(jī)固體廢棄物 中，混合拌勻，進(jìn)行堆肥好氧發(fā)酵；所述有機(jī)固體廢棄物物按碳氮比為10?50 :1，含水率為 45%?65%，保持氧氣含量為8%?15%進(jìn)行堆肥發(fā)酵，間隔3?5天翻拋1次；
[0027] (2)堆肥12-20天，待物料水分降至28?33%，發(fā)酵終止。
[0028] 上述堆肥方法中，步驟（2)堆肥好氧發(fā)酵過程中，發(fā)酵3?4天時(shí)堆體溫度達(dá)70? 80°C，6?15天溫度保持在80?90°C，最高溫度可達(dá)105°C。約經(jīng)12-20天的好氧發(fā)酵物 料水分降至28?35%，廢棄物中的大部分有機(jī)物被分解，終止發(fā)酵。剩余物或被填埋或被 焚燒或過篩分裝得生物肥料。
[0029] 本發(fā)明是從溫泉的底泥中分離到一株具有高溫角蛋白酶、尿囊素酶、纖維二糖酶、 葡聚糖內(nèi)切酶等活性的菌株，為處理有機(jī)固體廢棄物提供了一種高效降解的手段。本發(fā) 明菌株UTM107可以用于城市生活污水廠的下水污泥、生活垃圾、餐廚垃圾、動(dòng)物尸體及畜 禽糞便等廢棄物的堆肥好氧發(fā)酵中，以治理廢棄物造成的污染，并可以制備生物肥料，具有 較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1菌株UTM107系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0031] 圖2菌株UTM107的顯微鏡照片。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0033] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0034] 實(shí)施例1地衣芽孢桿菌UTM107的分離與鑒定
[0035] 取約Ig云南騰沖溫泉底泥樣品置于裝有多粒小玻璃珠的250ml三角瓶中，其內(nèi) 裝IOOml無菌水。50°C恒溫?fù)u床上震蕩1小時(shí)后靜置30分鐘。在無菌條件下取上清液 lml，接至裝有IOOml已滅菌的富集培養(yǎng)基（蛋白胨1. 0%、牛肉膏1. 0%、酪素 I. 0%、NaCl 0. 5%、K2HPO4O. 07%)中，50°C振蕩培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘。取培養(yǎng)3天后的菌懸 液lml，加入到裝9ml無菌水的試管中，以梯度稀釋法配制成ΚΓ 1，1(Γ2,1(Γ3,1〇Λ 1(Γ5,1〇Λ 1〇_7的稀釋度。每個(gè)稀釋度分別取〇. Iml涂布在酪素選擇培養(yǎng)基平板上（葡萄糖I. 5%、天 冬酰胺0.09%、牛肉膏0.07%、干酪素2.0%、K2HPO4O. 07%、瓊脂1.5% )，50°C培養(yǎng)3天。 在菌落分散較好的平板上選擇有水解圈的菌落，測(cè)量菌落直徑及透明圈直徑，計(jì)算透明圈 與菌落直徑比值作為初篩指標(biāo)，挑取具有最大比值的的單菌落進(jìn)行純化。將純化好菌落均 勻點(diǎn)種在固體羊毛培養(yǎng)基（葡萄糖1.5%、牛肉膏0. 1%、羊毛粉0.2%、天冬酰胺0. 11%、 K2HPO4O. 12%、瓊脂1. 5%，pH 6. 4)上。50°C恒溫培養(yǎng)24h以上，觀察菌落生長(zhǎng)狀況與酪素 水解情況，然后挑取水解圈在Icm以上的單菌落。
[0036] 以本發(fā)明分離的上述菌株DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因序列，引物為 (27f) :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，53°C退火45秒，72°C延 伸90秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)其純度后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見 序列表SEQID No:l所示。獲得的16S rRNA基因序列通過EzTaxon數(shù)據(jù)庫（http://www. ezbiocloud.net/)進(jìn)行比對(duì)，與菌株Bacillus Iicheniformis的相似性最高，同源性為 99. 7%。圖1為基于UTM107菌株16S rRNA基因序列，利用Mega5. 0系統(tǒng)進(jìn)化軟件構(gòu)建的 系統(tǒng)進(jìn)化樹（最大似然法），說明其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與地衣芽孢桿菌最近。
[0037] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'經(jīng)PCR擴(kuò)增該菌株的gyrB基因，測(cè)序結(jié)果見序列表SEQ ID No:2獲得的序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示 UTM107菌株的gyrB基因序列與Bacillus Iicheniformis相似性最高，結(jié)合菌株的形態(tài)結(jié) 構(gòu)特征（圖2)和生理生化特征，把該菌株鑒定為Bacillus licheniformis，命名為UTM107。 并于2014年9月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名 為地衣芽抱桿菌 Bacillus licheniformis，保藏號(hào)為 CGMCC No. 9678。
[0038] 實(shí)施例2菌株UTM107耐高溫角蛋白酶活性檢測(cè)及其基因序列
[0039] 將實(shí)施例1得到的UTM107菌株接種于含固體羊毛培養(yǎng)基（葡萄糖1.5%、牛肉 膏〇· 1 %、羊毛粉0.2%、天冬酰胺0· 11%、K2HPO4O. 12%、瓊脂1.5%，pH 6.4)平板及酪蛋 白培養(yǎng)基（葡萄糖1. 5%、牛肉膏0. 07%、干酪素2. 0%、天冬酰胺0. 09%、K2HPO4O. 07%、 瓊脂1.5% )平板上，于50°C培養(yǎng)3天。觀察到其在上述兩種培養(yǎng)基上均具有透明的水解 圈，證實(shí)UTM107菌株能分解角蛋白酶，其具有角蛋白酶活性將UTM107菌株接種至液體培養(yǎng) 基（1%羽毛粉，〇. 1%磷酸氫二鉀，0.01% MgCl2;用自來水配制，并在配制好后將pH值調(diào)至 7. 0?8. 0)中，50°C培養(yǎng)48小時(shí)后，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上清液取I. Oml上清液，在其中 加入2. Oml 0· 05mol/L Tris · HCl緩沖液（pH值7. 5)，再加入IOmg羽毛粉作為反應(yīng)底物， 于60°C恒溫水浴鍋中保溫，定時(shí)取出并用力振蕩。1小時(shí)后取出并加入2. Oml 10% TCA以 終止反應(yīng)。在10000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C條件下過濾離心10分鐘，取上清液于280nm處測(cè)定吸光 度。以反應(yīng)前添加 TCA處理的反應(yīng)管作對(duì)照。酶活性單位定義：在上述反應(yīng)條件下，測(cè)得 的0D280nm值每升高0. 01所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U)。重復(fù)3次，取平均值。 測(cè)得UTM107菌株的角蛋白酶在60°C酶活力為103個(gè)單位。
[0040] 根據(jù)角蛋白酶基因設(shè)計(jì)的引物kera-f:5'-ATG ATG AGG AM MG AGT TTT TGG-3' 和 kera-r:5' -TTA TTG AGC GGC AGC TTC G-3'，并以本發(fā)明菌株 UTM107DNA 為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，55°C退火60秒，72°C延 伸60秒，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到約I. Ikb大小的核苷酸片段，測(cè)序 并將在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該序列片段編碼角蛋白酶 基因，其基因序列見序列表SEQ ID No:3。
[0041] 實(shí)施例3菌株UTM107尿囊素酶活性檢測(cè)及其相關(guān)基因序列
[0042] UTM107在發(fā)酵培養(yǎng)基（蛋白胨1. 0%、牛肉膏1. 0%、酪素1. 0%、NaCl 0. 5%、 K2HPO4O. 07% )中40°C發(fā)酵培養(yǎng)2天，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心取上清液作為粗酶液，并迅速測(cè)定 其酶活性。尿囊素酶活性測(cè)定方法為：加100 μ I UTM107粗酶液（發(fā)酵離心后的上清液） 于2ml含15mmol/L尿囊素的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7. 5)中，30°C下反應(yīng)15 分鐘，然后加一滴濃鹽酸終止反應(yīng)。取0. 5ml反應(yīng)液測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物尿囊酸的含量即可測(cè) 得尿囊素酶活性大小。尿囊酸的測(cè)定采用高效液相色譜檢測(cè)方法，采用C18柱為固定相，以 0. Olmol/L的KH2POjl沖液為流動(dòng)相，流速0. 9ml/分鐘，在210nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下檢測(cè)尿囊 酸的含量，反應(yīng)重復(fù)3次，取平均值。規(guī)定每分鐘每毫克蛋白質(zhì)水解1 μ mol/L尿囊素作為 1個(gè)活力單位，測(cè)定結(jié)果：本發(fā)明UTM107菌株所產(chǎn)生的尿囊素酶活性約為23個(gè)活性單位。
[0043] 根據(jù)芽孢桿菌尿囊素酶基因設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物niao-f:5'-AAT CGC AGC AAT CGG T-3' 和 nia〇-r:5' -TTG CGG CCA ATA TAC G-3'，并以本發(fā)明菌株 UTM107DNA 為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，55°C退火45秒，72°C延 伸60秒，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到I. Ikb大小的核苷酸片段，測(cè)序并 將在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得該序列片段編碼尿囊素酶基 因，其基因序列見序列表SEQ ID No:4。
[0044] 實(shí)施例4菌株UTM107纖維素酶活性檢測(cè)及其相關(guān)基因序列
[0045] 將芽胞桿菌UTM107菌株用點(diǎn)種法點(diǎn)種在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（羧甲基纖維素 鈉 5g、KH2P04lg、NaN033g、KCL 0· 5g、MgSO4O. 5g、FeSO4O. 01g、瓊脂 17g，蒸餾水 1000ml，pH 5. 5?6.0)上，40°C培養(yǎng)48小時(shí)。采用0.2%剛果紅染色30分鐘，然后先用蒸餾水洗去 染液，再用濃度為lmol/L的NaCl浸泡1小時(shí)，最后用5 %的醋酸液固定顏色。在菌落周 圍形成無色透明圈證明此菌分泌纖維素酶，具有降解纖維素酶的活性。纖維素酶為多酶混 合物，其由纖維二糖酶、葡聚糖內(nèi)切酶等組成。根據(jù)纖維二糖酶基因設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物 Cellobiase-f:5' -CGA CAT CTG AAG CGT ACA GC-3' 和 Cellobiase-r:5' -CGG TCA TAC TCA GCA TAA GC-3'，并以本發(fā)明菌株UTM107DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序 為：95 °C預(yù)變性5分鐘，95 °C變性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒，35個(gè)循環(huán)，72 °C延 伸10分鐘，通過電泳檢測(cè)得到約2kb大小的核苷酸片段，測(cè)序并將在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫 運(yùn)用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，該序列片段編碼纖維二糖酶基因，其基因序列見序列表SEQ ID No. 5。根據(jù)β-葡聚糖內(nèi)切酶基因設(shè)計(jì)引物betaglu-f:5'-AAC GGT CCG CAT CAT C-3' 與 betaglu-r:5' -CGA GGA AGA TGC CGA T-3'，以本發(fā)明菌株 UTM107DNA 為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性5分鐘，95 °C變性30秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸120秒， 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，獲得約2. 7kb的片段，測(cè)序并將在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫運(yùn)用 Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，該基因片段編碼β-葡聚糖內(nèi)切酶，其基因序列見序列表SEQ ID No. 6 〇
[0046] 實(shí)施例5菌株UTM107菌劑的制備（1)
[0047] 將4°C保存的本發(fā)明實(shí)施例1獲得的菌株UTM107斜面轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基平板上，在 35°C下培養(yǎng)至豐厚，然后刮菌苔接種于至裝有50ml LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，培養(yǎng)溫 度35°C，搖床轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)48小時(shí)。此為搖瓶種子液。
[0048] 將上述種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的種子罐中。培養(yǎng)溫度35°C，通氣量1 : 0. 3 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。此為種子罐種子液。
[0049] 將種子罐種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。接種量約 5 %、培養(yǎng)溫度35°C、通氣量I :0. 5 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。當(dāng) 0D_多1.8,停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵菌液。
[0050] 發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，發(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到粉末狀菌劑。
[0051] 實(shí)施例6菌株UTM107菌劑的制備（2)
[0052] 將4°C保存的本發(fā)明實(shí)施例1獲得的菌株UTM107斜面轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基平板上，在 50°C下培養(yǎng)至豐厚，然后刮菌苔接種于至裝有50ml LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，培養(yǎng)溫 度50°C，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)24小時(shí)。此為搖瓶種子液。
[0053] 將上述種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的種子罐中。培養(yǎng)溫度50°C，通氣量1 : 0. 6 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間40小時(shí)。此為種子罐種子液。
[0054] 將種子罐種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。接種量約 0. 1 %、培養(yǎng)溫度50°C、通氣量I :0. 6 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速60轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。當(dāng) OD_多1.8,停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵菌液。
[0055] 發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，發(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到粉末狀菌劑。
[0056] 實(shí)施例7菌株UTM107菌劑的制備⑶
[0057] 將4°C保存的本發(fā)明實(shí)施例1獲得的菌株UTM107斜面轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基平板上，在 40°C下培養(yǎng)至豐厚，然后刮菌苔接種于至裝有50ml LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，培養(yǎng)溫 度40°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)36小時(shí)。此為搖瓶種子液。
[0058] 將上述種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的種子罐中。培養(yǎng)溫度40°C，通氣量1 : 〇. 4 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間36小時(shí)。此為種子罐種子液。
[0059] 將種子罐種子液接種至含有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。接種量約 2 %、培養(yǎng)溫度38°C、通氣量I :0. 5 (v/v)、攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。當(dāng) OD_多1.8,停止培養(yǎng)，此為發(fā)酵菌液。
[0060] 發(fā)酵液直接分裝成為液體菌劑，發(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到粉末狀菌劑。
[0061] 實(shí)施例8菌株UTM107的菌劑處理生活污泥
[0062] 生活污泥約30噸，其含水量83. 5%，加入水分調(diào)理劑20噸及50升實(shí)施例7制得 的UTM107液體菌劑，拌合混勻。此時(shí)物料水分約60. 3%。將物料移入發(fā)酵槽中進(jìn)行堆肥好 氧發(fā)酵。堆體高度不得低于2. 3m，保持氧氣含量為8%，約5天以倒槽的方式翻拋1次。發(fā) 酵3天時(shí)堆體溫度達(dá)70°C，6?16天溫度達(dá)80?90°C，最高溫度105°C。20天后，終止發(fā) 酵。水分降至33. 1%，有機(jī)物減重85%。容積減量60%，即可作為有機(jī)肥產(chǎn)品或進(jìn)行深加 工制備功能性有機(jī)肥料進(jìn)行出售。
[0063] 按照上述同樣的方法，采用實(shí)施例5和6制備的菌劑處理生物污泥，也能取得上述 類似的有益效果。
[0064] 實(shí)施例9利用UTM107菌劑處理死淘雞制備生物肥料
[0065] 集約化的大型雞養(yǎng)殖場(chǎng)的每個(gè)養(yǎng)殖周期都會(huì)有1?3%的死淘雞。在養(yǎng)雞場(chǎng)的墊 料IOOm 3中加入300L實(shí)施例7制得的UTM107液體菌劑，混合均勾，同時(shí)噴灑適量水分。然 后用裝載機(jī)將物料拌混均勻后送入一個(gè)發(fā)酵槽中，堆高2m以上，同時(shí)開啟曝氣機(jī)對(duì)堆體鼓 風(fēng)供氣，保持氧氣含量為15%，約2天。堆體溫度上升至75°C?95°C后加入死淘雞開始好 氧堆肥發(fā)酵。
[0066] 由于死淘雞數(shù)量波動(dòng)較大，每天有1?3000kg。根據(jù)死淘雞數(shù)量，采用2種入槽方 式：小量時(shí)采用直接坑埋，大量時(shí)用裝載機(jī)拌混后填埋。并同時(shí)按1000 :1比例加入U(xiǎn)TM107 液體菌劑。4?7天換槽一次，在發(fā)酵周期中補(bǔ)充水分以不出現(xiàn)滲濾現(xiàn)象為準(zhǔn)。此好氧堆肥 發(fā)酵溫度可達(dá)90?KKTC以上，并長(zhǎng)時(shí)間維持高溫，使死淘雞的處理完全達(dá)到無害化。經(jīng)一 個(gè)養(yǎng)殖周期的好氧堆肥發(fā)酵死淘雞和墊料變成高效的生物肥料。
[0067] 將本發(fā)明實(shí)施例5、6制得的UTM107液體菌劑用于處理死淘雞，也取得了相同的技 術(shù)效果，可以將好氧堆肥發(fā)酵死淘雞和墊料變成高效的生物肥料。
[0068] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)菌株UTM107，其保藏編號(hào)為CGMCC No.9678〇
2. 如權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌菌株UTM107,其特征在于，其能夠產(chǎn)生耐高溫角 蛋白酶，尿囊素酶，纖維二糖酶和0-葡聚糖內(nèi)切酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的地衣芽孢桿菌菌株UTM107,其特征在于，所述耐高溫角蛋白酶 編碼核苷酸序列含有SEQ ID N0:3所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列；尿囊素酶編碼 核苷酸序列含有SEQ ID N0:4所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列；纖維二糖酶編碼核 苷酸序列含有SEQ ID N0:5所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列；0-葡聚糖內(nèi)切酶編 碼核苷酸序列含有SEQ ID N0:6所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
4. 含有權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌菌株UTM107的菌劑。
5. -種制備含地衣芽孢桿菌UTM107的堆肥接種劑的方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 制備發(fā)酵液：將地衣芽孢桿菌菌株UTM107接種于LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵； (2) 發(fā)酵液經(jīng)脫水干燥得到粉末狀菌劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)是將地衣芽孢桿菌UTM107接種 于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)溫度35?50°C，搖床轉(zhuǎn)速100?250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間 24?48小時(shí)，得搖瓶種子液； 將搖瓶種子液接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的種子罐中，培養(yǎng)溫度35?50 °C、攪拌轉(zhuǎn)速100? 400轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量1:0. 3?0. 6 (v/v)、培養(yǎng)時(shí)間30?40小時(shí)，得到種子罐種子液； 將種子罐種子液接種于內(nèi)裝LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35?50°C、攪拌速度 60?200轉(zhuǎn)/分鐘、通氣量1:0. 5?0? 6 (v/v)、接種量0? 05%?5%、培養(yǎng)時(shí)間24?40小 時(shí)，當(dāng)0D600彡1. 8時(shí)停止培養(yǎng)，得到UTM107的發(fā)酵液。
7. 權(quán)利要求1-3任一所述的地衣芽孢桿菌菌株UTM107或權(quán)利要求4所述的菌劑在有 機(jī)固體廢棄物堆肥發(fā)酵中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)固體廢棄物為下水污泥、生活垃 圾、作物秸桿、動(dòng)物尸體或畜禽糞便中的一種或多種。
9. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將相當(dāng)于總物料濕重〇. 1%?1%的UTM107菌種或其菌劑接種于有機(jī)固體廢棄物 中，混合拌勻，進(jìn)行堆肥好氧發(fā)酵；所述有機(jī)固體廢棄物物按碳氮比為10?50 :1，含水率為 45%?65%，保持氧氣含量為8%?15%進(jìn)行堆肥發(fā)酵，間隔3?5天翻拋1次； (2) 堆肥12-20天，待物料水分降至28?33%，發(fā)酵終止。
10. 權(quán)利要求1-3任一所述的地衣芽孢桿菌菌株UTM107或權(quán)利要求4所述的菌劑在制 備有機(jī)肥料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/10GK104498407SQ201410841868
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】劉永躍, 何璧梅, 許宜北, 汪涌 申請(qǐng)人:大地綠源環(huán)保科技(北京)有限公司