一種基于3d培養(yǎng)體系的擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，該方法包括如下步驟：(1)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)：復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；(2)將(1)的復(fù)合培養(yǎng)基置入低氧培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3～20％。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為，復(fù)合培養(yǎng)基添加的纖維蛋白凝膠是一種高分子網(wǎng)絡(luò)體系，能吸收大量的水份，其結(jié)構(gòu)上也與細(xì)胞外基質(zhì)極為相似，能夠模擬體內(nèi)造血干細(xì)胞的生長微環(huán)境，從而為細(xì)胞提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，降低了成本的同時(shí)顯著增加細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，而且又維持造血干細(xì)胞的特性，防止其因分化而喪失干細(xì)胞的特性。
【專利說明】一種基于3D培養(yǎng)體系的擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種基于3D培養(yǎng)體系擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]造血干細(xì)胞在治療白血病、惡性腫瘤、重癥非惡性血液系統(tǒng)疾病以及某些遺傳性疾病中有廣泛的應(yīng)用，是因?yàn)檫@類細(xì)胞具有自我更新、高度增殖、多向分化等能力，這也預(yù)示著體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞在臨床應(yīng)用上有著廣闊的前景。
[0003]目前，在造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，首先是對骨髓、臍帶血或者外周血進(jìn)行密度梯度離心提取單個(gè)核細(xì)胞，接著進(jìn)行磁珠分選得到CD34+細(xì)胞，然后將造血干細(xì)胞放入培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)。最常使用的傳統(tǒng)2D培養(yǎng)，是將造血干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，再添加血清替代物和多種生長因子，血清替代物由轉(zhuǎn)鐵蛋白和人胰島素等物質(zhì)組成，生長因子包括干細(xì)胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。造血干細(xì)胞生長因子可調(diào)控造血干細(xì)胞的存活和增殖，在造血干細(xì)胞的培養(yǎng)中是必不可少的部分。
[0004]體內(nèi)的造血干細(xì)胞主要存在于骨髓中，約占骨髓細(xì)胞總數(shù)的0.01 %，在一般狀態(tài)下造血干細(xì)胞數(shù)目保持不變，但是當(dāng)有造血需要時(shí)，造血干細(xì)胞會進(jìn)行顯著的擴(kuò)增，不同于體外培養(yǎng)，體內(nèi)的造血干細(xì)胞在擴(kuò)增過程中能夠維持自我更新能力，因此體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境對于造血干細(xì)胞自我更新、擴(kuò)增具有重要的作用。已有研究表明建立一種3D培養(yǎng)體系對于提高造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù)，延長體外培養(yǎng)時(shí)間和維持自我更新能力有顯著效果。Matthias P.Lutolf成功合成了一種聚乙二醇水凝膠微孔平臺用于維持造血干細(xì)胞的自我更新和造血系統(tǒng)重塑能力。
[0005]生理性乏氧對造血干細(xì)胞的生物特性和功能具有保護(hù)作用。低氧環(huán)境下，體外培養(yǎng)的造血干細(xì)胞有更好的集落形成能力，低氧環(huán)境可以刺激VEGF、BNIP3、CXCR4等基因的表達(dá)，從而通過細(xì)胞旁分泌來調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。低氧環(huán)境能使造血干細(xì)胞擴(kuò)增更多的較原始的AC133+⑶34+造血干細(xì)胞和有活性的⑶34+造血干細(xì)胞，維持較多的干細(xì)胞處于G0/G1期，促進(jìn)各系集落(BFU-E、CFU-GM等)的生長，更好地維持造血干細(xì)胞的遷徙能力，但是目前，對影響造血干細(xì)胞擴(kuò)增的氧濃度尚未有系統(tǒng)的確切的研究結(jié)果。
[0006]傳統(tǒng)2D培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的倍數(shù)約為10倍，擴(kuò)增倍數(shù)不理想，且不能為細(xì)胞提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，使得造血干細(xì)胞迅速分化從而失去干細(xì)胞特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種基于3D培養(yǎng)體系擴(kuò)增造血干細(xì)胞的方法，該方法在培養(yǎng)體系中加入生物相容的支架，模擬體內(nèi)骨髓造血干細(xì)胞生長的三維環(huán)境，為細(xì)胞提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，可增加細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)，同時(shí)維持造血干細(xì)胞的表型，不易分化，保持造血干細(xì)胞的特性。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明公開了一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，方法包括如下步驟:(I)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng):復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；
[0009](2)將(I)的復(fù)合培養(yǎng)基置入低氧培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3~20%。體內(nèi)的造血干細(xì)胞主要存在于骨髓中，約占骨髓細(xì)胞總數(shù)的0.01 %，在平時(shí)狀態(tài)下造血干細(xì)胞數(shù)目保持不變，但是當(dāng)有造血需要時(shí)，造血干細(xì)胞會進(jìn)行顯著的擴(kuò)增，不同于體外培養(yǎng)，體內(nèi)的造血干細(xì)胞擴(kuò)增過程中能夠維持自我更新能力，因此體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境對于造血干細(xì)胞自我更新、擴(kuò)增具有重要的作用，本發(fā)明中添加的纖維蛋白凝膠是一種高分子網(wǎng)絡(luò)體系，能吸收大量的水份，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)極為相似，能夠在體外模擬體內(nèi)造血干細(xì)胞的生長微環(huán)境，從而為細(xì)胞提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，而且纖維蛋白凝膠生理、無菌、無毒且具有良好的生物相容性，可通過釋放β轉(zhuǎn)化因子和血小板衍生生長因子等來促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖并分泌基質(zhì)，能夠顯著增加細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，同時(shí)維持造血干細(xì)胞的特性，防止其因分化而喪失干細(xì)胞的特性。
[0010]步驟(1)復(fù)合培養(yǎng)基中，造血干細(xì)胞懸液的體積分?jǐn)?shù)為15%、血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為15%、纖維蛋白凝膠的體積分?jǐn)?shù)為15-25%、SIFE生長因子包括干細(xì)胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在復(fù)合培養(yǎng)基中的終濃度依次為50~100ng/mL、25~40ng/mL、0.5~lU/mL、3~5ng/mL、3~5ng/mL、3~5ng/m L、3~5ng/mL,余量為無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0011]步驟(1)纖維蛋白凝膠的制備方法為，①將氨基酸序列為mqaqqyqqqr rkfaaaflafifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcnwkkqfgaeck yqfqawgecd Inta lktrtg的多肽與50_75mg凍干的纖維蛋白原偶聯(lián)；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶ImL溶解多肽偶聯(lián)的凍干纖維蛋白原，即得溶液A，③將凝血酶加入40mmol/L CaCl2溶液中，配制出凝血酶濃度為250_400u/mL的溶液B將溶液A和溶液B混合，在底面積為0.25cm2模具中制作成為圓柱形的復(fù)合物，置37°C保溫lh，即得到纖維蛋白凝膠，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的纖維蛋白凝膠可為造血干細(xì)胞提供生物支架，為其提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，更有利于維持造血干細(xì)胞的表型。
[0012]綜上所述，本發(fā)明提供的一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，其有益效果是，所使用的復(fù)合培養(yǎng)基中添加的纖維蛋白凝膠是一種高分子網(wǎng)絡(luò)體系，能吸收大量的水份，其結(jié)構(gòu)上也與細(xì)胞外基質(zhì)極為相似，能夠在體外模擬體內(nèi)造血干細(xì)胞的生長微環(huán)境，從而為細(xì)胞提供充足的生長空間和支持細(xì)胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，降低了成本的同時(shí)顯著增加細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，而且又維持造血干細(xì)胞的特性，防止其因分化而喪失干細(xì)胞的特性；方法當(dāng)中用到的低氧環(huán)境進(jìn)一步提高造血干細(xì)胞擴(kuò)增效率。又由于復(fù)合培養(yǎng)基中加入了纖維蛋白凝膠，可節(jié)省生長因子的用量，生長因子的用量降低到現(xiàn)有生長因子用量的1/2~1/3，生長因子和纖維蛋白凝膠的結(jié)合使用，降低成本的同時(shí)又提高了造血干細(xì)胞的擴(kuò)增效率，非常適于規(guī)?；瘧?yīng)用?！揪唧w實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0014]實(shí)施例一:本發(fā)明開發(fā)出的一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，包括如下步驟:(1)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng):復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；
[0015](2)將(I)的復(fù)合培養(yǎng)基置入低氧培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3~20%。
[0016]步驟(1)復(fù)合培養(yǎng)基中各成份的量為，每200ul的復(fù)合培養(yǎng)基中造血干細(xì)胞懸液的體積分?jǐn)?shù)為15%、血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為15%、纖維蛋白凝膠的體積分?jǐn)?shù)為15%、SIFE生長因子包括干細(xì)胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在復(fù)合培養(yǎng)基中的終濃度依次為50ng/mL、25ng/mL、0.5U/mL、3ng/mL、3ng/mL、3ng/mL、3ng/mL,余量為無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0017]步驟(1)纖維蛋白凝膠的制備方法為，①將氨基酸序列為mqaqqyqqqr rkfaaaflafifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcnwkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽與50_75mg凍干的纖維蛋白原偶聯(lián)；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶ImL溶解多肽偶聯(lián)的凍干纖維蛋白原，即得溶液A，③將凝血酶加入40mmol/L CaCl2，配制出凝血酶濃度為250_400u/mL的溶液B ;④將溶液A和溶液B混合，在底面積為0.25cm2模具中制作成為圓柱形的復(fù)合物，置37°C保溫lh，即得到纖維蛋白凝膠，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0018]步驟(1)的30ul造血干細(xì)胞懸液中含有的造血干細(xì)胞個(gè)數(shù)為1-2 X IO5個(gè)。
[0019]本發(fā)明所用到的試劑信息如下:凍干人纖維蛋白原:購自上海萊士血制品有限公司，0.5g/瓶，凝血酶:購自南京金康制藥有限公司，500U/瓶，抑肽酶:購自蘭州大得利生物化學(xué)制藥有限公司，100000KIU/瓶，血清替代物和無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基:購自LifeTechnologies 公司，生長因子均購自 Stem cell Technologies 公司。
[0020]以下通過實(shí)驗(yàn)說明應(yīng)用本發(fā)明方法對造血干細(xì)胞的擴(kuò)增作用，造血干細(xì)胞從血液中分離:在離心管中加入Ficoll-Hypaque,抗凝血液與無血清1640培養(yǎng)基等倍混勻，稀釋后的血液沿離心管壁緩緩疊加于分層液面上，注意保持液面界面清晰，2500rpm離心20min，小心吸取中間云霧層細(xì)胞，無血清1640培養(yǎng)基或PBS洗滌兩次，使用MACS-CD34iSolationkit，免疫磁珠法分選CD34+細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測造血干細(xì)胞純度，分離出的細(xì)胞待用；
[0021]細(xì)胞接種:將兩片纖維蛋白凝膠放入96孔板，每孔加入30uL含1_2X IO5個(gè)造血干細(xì)胞的懸 液，細(xì)胞懸液小心加在纖維蛋白凝膠上方，防止吸頭與纖維蛋白凝膠接觸，添加SIFE生長因子和血清替代物，再小心加入適量無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放入37°C，氧濃度為3-20 %的低氧培養(yǎng)箱中。每天半量換液，補(bǔ)充生長因子，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。設(shè)置2D對照組。
[0022]其中2D對照組培養(yǎng)體系中不加纖維蛋白凝膠，只添加無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為 15%的血清替代物和 150ng/mL SCF、80ng/mL FL、2U/mL EP0U0ng/mL IL-3,lOng/mL IL_6、10ng/mL GM-CSF、lOng/mL G-CSF0
[0023]流式細(xì)胞儀檢測免疫表型
[0024]收集培養(yǎng)前(dayO)臍血單個(gè)核細(xì)胞，于培養(yǎng)第12天(dayl2)收集3D組細(xì)胞及2D組細(xì)胞各 1-2 X IO5 個(gè)，2% FBS-PBS 洗一次，加入 CD34-FITC，CD38-PE，10 μ L，4°C避光放置30—40分鐘，2% FBS-PBS洗一次，加入200yL2% FBS-PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測免疫表型。
[0025]細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測造血干細(xì)胞增殖能力:
[0026]分別收集培養(yǎng)前(dayO)造血干細(xì)胞和培養(yǎng)第12天3D組細(xì)胞及2D組細(xì)胞，重懸于2% FBS-MDM，調(diào)整細(xì)胞至l-2xl05/mL，取300μ L細(xì)胞懸液加入3mL Methocult培養(yǎng)基(Stem Cell Tech.)中，即為溶液A，靜置5分鐘除去氣泡。3mL注射器16_g針頭吸取1.1mL溶液A，緩慢注入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿中，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，置飽和濕度、37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14天。倒置顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞克隆(紅系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，計(jì)算紅系和粒巨系克隆數(shù)。
[0027]利用本發(fā)明的3D培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)方法相比，造血干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)15倍。由于培養(yǎng)體系中加入了纖維蛋白凝膠，可降低生長因子的使用濃度，從而節(jié)省生長因子的用量，生長因子的用量降低到常規(guī)生長因子用量的1/3-1/2，生長因子和纖維蛋白凝膠的配合使用，不僅增加了造血干細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，而且降低了成本，非常適于規(guī)?；瘧?yīng)用。
[0028]實(shí)施例二:本發(fā)明開發(fā)出的一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，該方法包括如下步驟:(I)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng):復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；
[0029](2)將(I)的復(fù)合培養(yǎng)基置`入低氧培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3~20%。
[0030]步驟(1)復(fù)合培養(yǎng)基中各成份的量為，每200ul復(fù)合培養(yǎng)基包括造血干細(xì)胞懸液30ul、血清替代物在復(fù)合培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)分別為15%、纖維蛋白凝膠在復(fù)合培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)為25%、SIFE生長因子包括干細(xì)胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在復(fù)合培養(yǎng)基中的終濃度依次為 100ng/mL、40ng/mL、lU/mL、5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL,余量為無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0031]步驟(1)纖維蛋白凝膠的制備方法為，①將氨基酸序列為mqaqqyqqqr rkfaaaflafifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcnwkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽與50_75mg凍干的纖維蛋白原偶聯(lián)；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶ImL溶解多肽偶聯(lián)的凍干纖維蛋白原，即得溶液A，③將凝血酶加入40mmol/L CaCl2溶液中，配制出凝血酶濃度為250_400u/mL的溶液B將溶液A和溶液B混合，在底面積為0.25cm2模具中制作成為圓柱形的復(fù)合物，置37°C保溫Ih,即得到纖維蛋白凝膠，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0032]步驟(1)的30ul造血干細(xì)胞懸液中含有的造血干細(xì)胞個(gè)數(shù)為1-2 X IO5個(gè)。
[0033]利用實(shí)施例二實(shí)驗(yàn)方法，使用本實(shí)施例方法擴(kuò)增出的造血干細(xì)胞為18倍。[0034]本發(fā)明多肽的合成:近年來研究表明人多效生長因子(pleiotrophin，PTN)在促進(jìn)造血干細(xì)胞的生長和增殖方面有著重要的作用，故我們選擇了 PTN的一段氨基酸序列合成一段多肽，進(jìn)一步研究其作用。多肽的氨基酸序列見序列表。
[0035]實(shí)施例三:本發(fā)明開發(fā)出的一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，包括如下步驟:(1)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng):復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠；
[0036](2)將(I)的復(fù)合培養(yǎng)基置入低氧培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3~20%。
[0037]步驟(1)復(fù)合培養(yǎng)基中各成份的量為，每200ul復(fù)合培養(yǎng)基包括造血干細(xì)胞懸液30ul、血清替代物在復(fù)合培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)分別為15%、纖維蛋白凝膠在復(fù)合培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)為20%、SIFE生長因子包括干細(xì)胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，各成份在復(fù)合培養(yǎng)基中的終濃度依次為 80ng/mL、35ng/mL、0.8U/mL、4ng/mL、4ng/mL、4ng/mL、4ng/mL,余量為無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0038]步驟(1)纖維蛋白凝膠的制備方法為,①將氨基酸序列為mqaqqyqqqr rkfaaaflafifilaavdta eagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcnwkkqfgaeck yqfqawgecd lntalktrtg的多肽與50_75mg凍干的纖維蛋白原偶聯(lián)；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶ImL溶解多肽偶聯(lián)的凍干纖維蛋白原，即得溶液A，③將凝血酶加入40mmol/L CaCl2中，配制出凝血酶濃度為250_400u/mL的溶液B 將溶液A和溶液B混合，在底面積為0.25cm2模具中制作成為圓柱形的復(fù)合物，置37°C保溫lh，即得到纖維蛋白凝膠，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0039]步驟(1)的30ul造血干細(xì)胞懸液中含有的造血干細(xì)胞個(gè)數(shù)為1-2 X IO5個(gè)。
[0040]利用實(shí)施例二實(shí)驗(yàn)方法，可以得出本發(fā)明方法擴(kuò)增造血干細(xì)胞的倍數(shù)為20倍。
[0041]本實(shí)施例僅為進(jìn)一步說明本發(fā)明，并非對發(fā)明做出的任何限制，凡在本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容上做出的簡單修改和改進(jìn)均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，該方法包括如下步驟:(I)將血液中分離出的造血干細(xì)胞懸液置入復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng):復(fù)合培養(yǎng)基包括無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIFE生長因子、血清替代物、纖維蛋白凝膠； (2)將(I)的復(fù)合培養(yǎng)基置入低氧培養(yǎng)箱中,低氧培養(yǎng)箱維持的氧濃度為3~20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟(I)復(fù)合培養(yǎng)基中，造血干細(xì)胞懸液的體積分?jǐn)?shù)為15%、血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為15%、纖維蛋白凝膠的體積分?jǐn)?shù)為15-25%、SIFE生長因子包括干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶_3配體、促紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞介素_3、白細(xì)胞介素_6、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子，各成份在復(fù)合培養(yǎng)基中的終濃度依次為50~100ng/mL、25~40ng/mL、0.5~lU/mL、3~5ng/mL、3~5ng/mL、3~5ng/mL、3~5ng/mL,佘量為無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟(I)纖維蛋白凝膠的制備方法為，①將氨基酸序列為mqaqqyqqqr rkfaaaflaf ifi Iaavdtaeagkkekpek kvkksdcgew qwsvcvptsg dcglgtregt rtgaeckqtm ktqrckipcn wkkqfgaeckyqfqawgecd lntalktrtg的多肽與50_75mg凍干的纖維蛋白原偶聯(lián)；②配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶ImL溶解多肽偶聯(lián)的凍干纖維蛋白原，即得溶液A，③將凝血酶加入40mmol/L CaCl2溶液中，配制出凝血酶濃度為250_400u/mL的溶液B 將溶液A和溶液B混合，在底面積為0.25cm2模具中制作成為圓柱形的復(fù)合物，置37°C保溫lh，即得到纖維蛋白凝膠，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于3D培養(yǎng)體系的造血干細(xì)胞擴(kuò)增方法，其特征在于，步驟(I)的30ul造血干細(xì)胞懸液中含有的造血干細(xì)胞個(gè)數(shù)為1-2 X IO5個(gè)。
【文檔編號】C12N5/0789GK103740644SQ201310648974
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月20日
【發(fā)明者】曾憲卓 申請人:曾憲卓